Sindbis-Group病毒S.A.AR86 nsP1的减突变加速非结构蛋白加工并上调病毒26S RNA合成

摘要

小鼠实验性Sindbis群α病毒感染是研究病毒和宿主致病决定因素的一个有价值的系统。以前的研究表明，病毒的遗传和小鼠的年龄都会影响疾病的进程（参考文献中综述11). 感染了强毒Sindbis群α病毒的哺乳小鼠会发展成一种致命的休克样疾病，这种疾病在老年动物中会减弱，或者如果使用细胞培养适应型病毒(14，15，30). 除了少数显著的例外，大多数Sindbis病毒株即使通过脑内途径也不能在10至14天大的小鼠中引起疾病（参考文献综述11). 然而，S.A.AR86，一种在南非分离的Sindbis组α病毒，在成年小鼠体内接种后确实会导致致命疾病(9，28，34). 这种在成年免疫活性小鼠中引起致命疾病的能力使S.A.AR86成为研究病毒性脑炎病毒和宿主决定因素的宝贵工具。

α病毒非结构蛋白包含病毒RNA依赖的RNA聚合酶，并且单个非结构蛋白在病毒RNA合成中具有若干已知功能。nsP1具有甲基转移酶和鸟苷转移酶活性，并参与病毒RNA封盖(23). nsP2是一种具有RNA解旋酶活性的多功能蛋白质(5)并在限制病毒RNA方面发挥作用(33). 此外，nsP2在其C末端包含一个蛋白酶结构域，负责处理来自多蛋白前体的成熟非结构蛋白(1，8). nsP3是一种功能未知的磷蛋白，尽管它对病毒RNA复制至关重要(20)nsP4是核心病毒RNA依赖RNA聚合酶(12). 在病毒进入并解开外壳后，病毒基因组充当一种信使核糖核酸，非结构蛋白从中翻译出来。非结构蛋白以多蛋白前体的形式产生，然后被nsP2蛋白酶裂解，产生成熟的非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。大多数Sindbis-groupα病毒在nsP3的3′端有一个蛋白石终止密码子，它截断翻译以产生多蛋白前体P123。蛋白石终止密码子的读入导致P1234的产生，其中包括所有四种非结构蛋白，约占P123水平的20%（参考文献综述29). S.A.AR86在Sindbis-groupα病毒中是唯一的，因为它缺少蛋白石终止密码子，并且应该过度产生P1234(28). 非结构多蛋白前体加工成成熟形式在调节病毒RNA合成中起着重要作用（参考文献综述29). 在感染早期，P123加上翻译后立即从P1234上裂解的nsP4负责病毒的负链合成(17-19，27). 在感染过程的后期，P123被加工产生成熟的nsP1、nsP2和nsP3，导致负链RNA合成被阻断，正链和26S RNA合成被上调(19，27).

尽管病毒非结构蛋白在病毒RNA合成中起着重要作用，但它们在α病毒发病机制中的作用尚未得到广泛研究。此前对Sindbis病毒NSV株的研究，该病毒在3至4周龄小鼠经静脉接种后可导致100%的死亡率(21)证明了病毒糖蛋白在脑炎发病机制中的作用(21). 特别是，E2糖蛋白55位的组氨酸残基在NSV的神经毒力中起重要作用(21). E2 His 55的实际作用机制尚不清楚，尽管突变可能在病毒结合或进入宿主细胞的水平上起作用(31). 除了His 55外，病毒糖蛋白中的其他决定因子在神经侵袭和神经毒力中也起着作用(21). 5′非翻译区也参与神经侵袭和脑炎的发展(2，16). S.A.AR86最新研究(9)和Semliki Forest病毒(32)证明了病毒非结构蛋白在成年小鼠神经毒力中的作用。在S.A.AR86中，nsP1位置538处的一个氨基酸变化显著降低成年小鼠的神经毒力(9). 将S.A.AR86中nsP1 538处的Thr替换为Ile可以减弱成年小鼠的神经毒力，而在非神经毒力Sindbis-group病毒中nsP1538处引入Thr则会导致神经毒力增加。在nsP1 538处的Ile的减弱作用不是由于病毒生长的明显缺陷，因为在nsP1 538处含有Ile的病毒在体内和体外生长得与野生型S.A.AR86一样好。然而，与野生型s55病毒相比，突变型s51（nsP1 538 Ile）病毒似乎从受感染小鼠的大脑中清除得更快(9).

在本报告中，我们检查了s51表型的近端原因。nsP1 538位于nsP1和nsP2之间的裂解识别基序（参考文献综述29)这表明该位点的变化可能会改变病毒的非结构蛋白加工，进而影响病毒RNA的合成。虽然先前的研究表明nsP1538的减弱突变不会对病毒在高感染多重性（MOI）下的生长产生不利影响(9)，我们有兴趣评估nsP1538的Ile或Thr对病毒非结构蛋白加工和RNA合成的影响。通过结合S.a.AR86感染细胞的非结构蛋白的体外翻译和免疫沉淀，我们证明了nsP1 538处的Ile减弱加快了非结构蛋白前体向成熟非结构蛋白转化的过程。这随后导致减毒突变体更快地诱导病毒26S RNA合成。讨论了病毒RNA合成的这种变化对S.A.AR86神经毒力的潜在影响。

材料和方法

结果

nsP1 538位的减弱突变不会对S.A.AR86的体外生长产生不利影响。

nsP1蛋白538位的单一氨基酸变化显著影响Sindbis群病毒S.A.AR86的成年小鼠神经毒力。由于非结构区域的突变可能会对病毒RNA合成产生不利影响，因此进行了研究以评估nsP1538处Ile或野生型Thr的减弱对病毒复制的影响。在感染的头几天，变异病毒在受感染动物的大脑中生长的速度与野生型病毒相当(9). 此外，当用体外单步生长曲线评估时，两种病毒表现出相似的生长动力学(9). 虽然单步生长曲线提供了有关病毒生长动力学的有用信息，但使用的高MOI可能掩盖了减毒s51病毒生长中的细微缺陷。因此，通过使用BHK-21和Neuro2A细胞低MOI下的多步生长曲线来评估突变型和野生型病毒的生长动力学。细胞以0.01的MOI感染野生型s55（nsP1 538 Thr）或突变型s51（nsP1538 Ile）病毒，并通过斑块试验评估病毒生成。与早期通过单步生长曲线获得的结果一致(9)突变型s51病毒和野生型s55病毒在BHK-21细胞和Neuro2A细胞中以多步生长曲线生长（图。​（图1）。1). 此外，在Neuro2A细胞中，生长曲线后期，s51产量比s55产量高约1 log（图。​（图1A）。1安培). 在BHK-21细胞中，在生长曲线的早期，s51产量始终高于s55产量（图。​（图1B）。1B年). BHK-21和Neuro2A细胞之间的差异可能反映了与Neuro2A细胞相比，BHK-21细胞的病毒生成速度加快。最重要的是，这些结果表明，在培养的成纤维细胞和神经母细胞瘤衍生细胞中，nsP1 538的Ile减弱实际上可能对S.a.AR86产生轻微的生长优势，而不是导致病毒生长缺陷。

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图1。

在多步体外生长曲线中，减毒突变体s51（nsP1 538 Ile）的生长水平高于野生型s55（nsP1538 Thr）病毒。以MOI为0.01的s55（实心正方形）或s51（实心圆形）感染Neuro2A（A）或BHK-21（B）细胞。在指定的时间点取出上清液样本，并通过菌斑试验评估病毒产量。所示数据来自三个代表性实验之一。每个点代表三个独立井的平均滴度，具有标准偏差。

nsP1 538处的Ile减弱加速了体外感染细胞中成熟nsP1的积累。

位置538位于nsP1和nsP2之间的切割识别结构域内，这表明Ile或Thr在该位置的存在可能调节非结构蛋白多蛋白前体的加工，这可能对病毒RNA合成和生长产生下游影响。为了评估nsP1 538处Ile或Thr的存在是否改变了病毒非结构蛋白的成熟，用野生型s55（nsP1 538 Thr）或减毒的s51（nsP1 538 Ile）病毒感染BHK-21细胞，用[³⁵S] 蛋氨酸，然后用过量的冷蛋氨酸追赶。在脉冲和追逐期间收集细胞裂解物，用nsP1特异性抗血清免疫沉淀nsP1，并用SDS-PAGE分析沉淀蛋白，如前所述(7). 在s55-和s51感染的细胞裂解液中，200-kDa P123非结构蛋白前体和135-kDa-P12裂解中间产物和成熟nsP1都很明显（图。​（图2）。2). 在未感染的裂解物中出现的非特异性条带聚集在略小于200 kDa的水平，使得分析200 kDaP123前体变得困难。然而，在P12裂解中间产物的存在和成熟nsP1的积累方面，s55和s51之间存在明显差异（图。​（图2）。2). 在追踪过程中，P12裂解中间产物在s55感染的细胞裂解液中的水平较高，而成熟nsP1在s51感染的细胞溶解液中的早期积累到较高水平（图。​（图2B）。2B型). 当从s55和s51感染细胞中免疫沉淀nsP2时，也观察到类似的结果（数据未显示）。这些结果表明，nsP1 538的Ile减弱改变了病毒非结构蛋白的处理，导致成熟非结构蛋白在感染细胞内更快地积累。

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图2。

通过减毒s51病毒在感染细胞中加速非结构蛋白处理。用野生型s55（实心方块）病毒（nsP1 538 Thr）或减毒的s51（实心圆）病毒（nsP1 538Ile）以5.0的MOI感染BHK-21细胞2小时。然后用[³⁵S] 蛋氨酸15分钟，然后用过量的冷蛋氨酸追逐10、20或30分钟，在这一点上产生细胞裂解物。（A） 从细胞裂解液中免疫沉淀NsP1，并在10%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。正常兔血清作为非特异性抗体相互作用的对照。（B） A组s55或s51感染细胞nsP1相对水平图。所示为四个代表性实验之一的结果。

nsP1 538处Ile的衰减加速了体外非结构蛋白的加工。

为了进一步评估Ile或野生型Thr的衰减对非结构蛋白加工的影响，进行了体外非结构蛋白翻译和加工分析。α病毒nsP2蛋白酶在体外是活性的，在兔网织红细胞裂解物中会发生非结构蛋白加工(1，8)从而可以评估在nsP1位置538处含有Thr或Ile的S.A.AR86非结构蛋白的加工动力学。用SP6聚合酶从S.A.AR86感染性克隆中产生全长病毒RNA转录物，其野生型Thr（ps55）或突变型Ile（ps51）位于nsP1的538位。这些抄本随后被用作制作³⁵使用兔网织红细胞裂解物进行S标记的非结构蛋白。将体外翻译反应混合物培养40分钟，此时添加过量的未标记蛋氨酸和环己酰亚胺，以停止翻译反应，并允许通过SDS-PAGE分析翻译的多蛋白的加工动力学（图。​（图3）。三). 与以前的报告一致(1，8)在40分钟脉冲后的s55和s51翻译反应中，与P1234前体相对应的250-kDa带都很明显，并且该带在追逐的前15分钟后基本消失。200-kDa p123前体对这两种病毒以及135-kDaP12裂解中间体也很明显。在追逐过程中，P123和P12前体都被加工成成熟的非结构蛋白；然而，对于突变的s51病毒非结构蛋白，这种处理发生得更快。追逐20分钟后，s51衍生非结构蛋白的成熟nsP1和nsP2很容易显现。事实上，成熟nsP1和nsP2即使在追捕的时间零点也可以检测到，这表明s51衍生蛋白在40分钟脉冲期间发生了非结构蛋白加工。相比之下，成熟的非结构蛋白几乎无法从野生型s55体外翻译反应中检测到，即使在追逐的80分钟内（图。​（图3A第3页和B）。与成熟nsP1和nsP2的积累增加相一致，s51翻译反应也显示P123前体和P12裂解中间体的水平相应降低，而P123和P12对s55更稳定。在一个有代表性的实验中，在追逐开始的60分钟内，s51的P123水平下降了83%，而s55的只有34%。为了进一步测试nsP1538的Ile或Thr对非结构蛋白加工的影响，对Sindbis病毒TR339及其突变体39ns1的体外非结构加工动力学进行了分析。TR339和39ns1仅在nsP1 538处不同，其中TR339编码Ile，39ns1编码Thr(9). 39ns1中538位Thr的存在增加了3周龄小鼠的神经毒力(9). 对这两种病毒的体外翻译非结构蛋白的加工分析表明，39ns1的nsP1538处存在Thr会延迟非结构蛋白前体的加工（图。​（图3C）。3C公司). 39ns1（nsP1 538 Thr）非结构蛋白加工的动力学与s55相似，而TR339（nsP1538 Ile）衍生非结构蛋白的加工与s51病毒的加工非常相似（图。​（图3A第3页和B）。这些结果，结合病毒感染细胞的结果，表明nsP1 538处减弱的Ile的存在加速了病毒非结构蛋白的切割，导致成熟非结构蛋白的更快积累。

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图3。

nsP1 538处的Ile减弱加速了体外非结构蛋白的加工。（A） 将s55（实心方块）或s51（实心圆圈）的全长RNA转录物在体外翻译为[³⁵S] 用兔网织红细胞裂解物测定蛋氨酸。翻译反应在30°C下培养40分钟。此时，添加过量的未标记的蛋氨酸和环己酰亚胺以停止翻译，反应转移到37°C。停止翻译并升高温度后，在0、20、40、60和80 min时取出样品，通过SDS-PAGE进行分析。（B） 在荧光成像仪上分析了s55或s51翻译反应中P123和P12裂解中间体以及成熟nsP1和nsP2的水平随时间的变化。数据表示每个时间点相关频带的像素总数。所示数据来自面板A中所示的凝胶。（C）弱毒TR339（nsP1 538 Ile）和神经毒力39ns1（nsP1538 Thr）的全长RNA转录物如图所示进行翻译。​图2A。2安培所示为三个代表性实验之一的结果。

nsP1 538处的Ile减弱上调了S.A.AR86 26S启动子的表达。

非结构蛋白加工调节α病毒RNA合成（参考文献综述29); 因此，我们假设减毒s51病毒加速的非结构蛋白加工将在动力学和/或稳态水平上影响病毒RNA合成。为了验证这一点，BHK-21细胞被S.A.AR86衍生的复制子颗粒感染，该复制子颗粒表达GFP并在nsP1538处含有Thr或Ile。然后，用流式细胞仪测定GFP表达，作为S.a.AR86 26S启动子基因表达的替代读数。感染nsP1538处Ile突变复制子（REP91-GFP）的细胞在感染后4小时的荧光强度比感染nsP1 538处Thr野生型复制子的细胞高4到10倍（图。​（图4）。4). 在一个具有代表性的实验中，REP91-GFP感染细胞的平均荧光强度为1960，而感染后4小时REP89-GFP的平均荧光密度为190。在Neuro2A细胞和原代大鼠皮层神经元中也观察到了这种效应（数据未显示），这表明减毒s51病毒在病毒26S启动子中的表达比野生型s55病毒在细胞类型依赖性方式下更快、更高。

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图4。

nsP1 538处的Ile减弱增加了S.A.AR86 26S启动子的表达。用S.A.AR86衍生的具有野生型Thr（REP89-GFP）或突变体Ile（REP91-GFP）的复制子颗粒在nsP1 538以0.1的MOI感染BHK-21细胞。这些复制子表达来自病毒26S启动子的GFP，该启动子被用作26S表达的替代标记。在感染后4小时，收集细胞并通过流式细胞术分析GFP表达（荧光[Fl]）。所示为BHK-21细胞的三个实验之一的代表性直方图。

为了更直接地评估nsP1538的Ile或Thr对病毒RNA合成的影响，BHK-21细胞被突变的s51病毒（nsP1538Ile）或野生型s55病毒（nsP2538Thr）感染，并在感染后的不同时间采集细胞总RNA。使用基因组正链和26S RNA或基因组负链RNA专用探针进行RNase保护试验。使用对小鼠β-肌动蛋白特异性的探针作为对照，以使RNA负载正常化。在对β-肌动蛋白水平进行标准化后，我们发现野生型和突变型病毒在分析的所有时间点的负和正RNA水平差异极小。然而，在感染后早期（3小时），与s55相比，s51的26S RNA持续增加三到四倍（图。​（图55和表​表1），1)这与复制子感染细胞的GFP数据一致（图。​（图4）。4). 然而，这种差异是暂时的，因为s55和s51 26S RNA水平在感染后5到6小时相当（表​（表1）。1). 在s55或s51感染原代大鼠神经元培养物后，也获得了类似的结果（表​（表1），1)表明这种作用并不局限于成纤维细胞。这些结果表明，nsP1 538的Ile减弱并没有损害病毒复制，反而改变了病毒非结构蛋白加工的动力学，并加速了病毒26S RNA合成的诱导。

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图5：。

Ile的衰减导致更快地诱导26S RNA合成，但不影响负或正品牌合成。BHK-21细胞以5.0的MOI感染野生型s55或突变型s51病毒。在感染后3或6小时收集总细胞RNA，并使用探针保护病毒+和26S RNA、病毒负链RNA或小鼠β-肌动蛋白片段，通过RNase保护分析进行分析。代表性RNase保护试验显示s55或s51感染细胞的3小时和6小时时间点。每个泳道代表来自独立样本的RNA。在3小时的时间点，每个样品使用5微克的总细胞RNA，在6小时的时间点将每个样品使用1微克。由于与负链水平相比，β-肌动蛋白信号过多，因此负链和β-肌动蛋白带的强度不同。

表1。

感染细胞中s51与s55 RNA的比率

单元格类型	感染后时间（h）	s51/s55 RNA比率一
		负股	Plus股	26S RNA
钻孔K-21	三	0.8, 0.8	1.1、0.6、1.0	4.2、3.1、4.2
	4	1.3	1.2	1.4
	5	0.8	1	1
	6	0.9	1.2, 0.9	1.0, 1.0
初级神经元	三		0.8	2.7
	6		0.6	1

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^一每个数据点代表单个实验中s51与s55 RNA的比率。

讨论

我们之前已经证明，nsP1 538位的单一氨基酸从Thr变为Ile可以减弱Sindbis组α病毒S.a.AR86对成年小鼠的神经毒力(9). α病毒非结构蛋白包含病毒RNA依赖的RNA聚合酶，这表明减弱突变会以某种方式影响病毒复制。因此，我们进行了一系列实验来评估nsP1538的Ile或Thr对病毒生长、非结构蛋白合成和加工以及病毒RNA合成的影响。对nsP1 538处带有Ile或Thr的病毒的分子分析表明，Ile的减弱加速了非结构蛋白的加工，并导致感染细胞中更快地诱导26S RNA合成。虽然尚未证明加速的非结构蛋白加工和26S RNA合成是否直接导致s51的表型减弱，但这些实验表明，病毒复制中的一个简单缺陷并不能提供解释。由于在几种非神经毒力的Sindbis群α病毒中发现Ile位于538位，这些研究提出了野生型S.A.AR86病毒进化为下调或延迟诱导26S RNA合成的可能性，这有助于成年小鼠的神经毒力。

s51病毒减毒表型的最简单解释是，突变病毒的复制效率低于野生型病毒。然而，s51突变株在体外没有表现出生长缺陷，与野生型s55病毒相比可能有轻微的生长优势（图。​（图1）1) (9). s55和s51在感染动物的大脑中也生长到类似的水平(9)进一步支持了简单的生长缺陷不会导致s51衰减的观点。

nsP1 538，野生型S.A.AR86编码一个独特的Thr残基，位于nsP1和nsP2之间8-氨基酸裂解识别基序的P3位置（参考文献综述29). Sindbis群α病毒中nsP1538处Ile的高度保守性导致了分裂结构域的P3位置在调节非结构蛋白分裂中的重要性(29). 这一建议在实验上得到了我们的发现的支持，即野生型S.A.AR86-编码的Thr在该位置的存在减缓了非结构蛋白加工的速率（图。​（图22和​和3）。三). 野生型或突变型S.A.AR86病毒改变nsP1/nsP2连接处的加工过程也可能影响成熟nsP2和nsP3的产生，因为nsP1从nsP2中分离出来后，nsP2蛋白酶在nsP2/nsP3裂解位点更为活跃(26). 这得到了以下观察结果的支持：在体外加工分析中，nsP1 538处的Thr增加了P123前体的稳定性（图。​（图3）。三). 也有可能，nsP1 538中野生型Thr的存在影响了感染细胞中成熟nsP1的稳定性，因为s55感染细胞中的成熟nsP1水平没有达到s51感染细胞中观察到的水平，即使在后期，当大多数P12分裂中间产物消失时（图。​（图2）。2). 然而，P12在s55感染细胞和s55体外翻译反应中明显更稳定（图。​（图3），三)表明nsP1538的Ile或Thr的主要作用是影响nsP1/nsP2连接处非结构蛋白的加工。

多蛋白前体P123加上成熟的nsP4对病毒感染最初几个小时内的负链合成至关重要(17-19，27). 尽管P123-nsP4组合能够进行低水平的全长加品牌合成(19)，高效的plus-stand基因组和26S RNA合成依赖于成熟非结构蛋白的存在(27). 将P123前体加工成成熟的nsP1、nsP2和nsP3蛋白，与负链合成被阻断以及正链基因组和26S RNA合成增加一致(27). 此外，存在几个nsP2蛋白酶缺陷的温度敏感性突变体，它们在26S RNA合成中表现出特定缺陷(6，13，24，25). 因此，由于nsP1位置538处存在Thr，非结构蛋白前体的延迟裂解预计会延迟26S RNA合成的诱导，这与我们的观察一致，即野生型s55病毒与突变型s51病毒相比，在26S合成方面表现出延迟（图。​（图44和​和55).

虽然它们在s51病毒（nsP1 538 Ile）减毒表型中的作用尚待确定，但非结构蛋白加工的改变和/或26S RNA合成的加速诱导可能通过多种机制减弱，包括（i）增加抗病毒因子的诱导，如i型干扰素；（ii）由于病毒结构基因的早期表达，增强了感染细胞的细胞病变效应；或（iii）与成熟非结构蛋白相比，非结构蛋白前体对宿主细胞大分子合成的不同影响。神经毒力s55病毒中nsP1 538处的Thr可能会延迟26S RNA的合成，直到宿主细胞大分子合成被关闭，从而限制了受感染细胞对I型干扰素或其他免疫介质的诱导。nsP1538的Ile也可能由于细胞病变效应的改变或宿主细胞大分子合成的关闭而减弱。Sindbis群α病毒的结构蛋白至少部分负责病毒的细胞病变作用(4)，而非结构蛋白被认为介导宿主细胞大分子合成的阻断(4). 减毒突变体对26S RNA的快速诱导将导致病毒结构蛋白的早期产生，这可能会更快地杀死宿主细胞，并导致病毒产生的总体减少。然而，也有可能突变病毒实际上可能没有那么严重的细胞病变，因为Sindbis病毒nsP2 726位的突变导致非细胞病变表型，也表现出病毒非结构蛋白的过度处理(三). 在这种情况下，变异病毒可能不会像野生型病毒那样有效地杀死受感染的细胞，这可能会导致受感染动物大脑内的病理学下降。或者，非结构蛋白加工的改变可能会影响宿主大分子合成的停止，从而导致因受感染细胞内资源竞争而导致病毒生产效率低下。然而，由于在体内或体外均未观察到这种情况，因此本研究结果与减毒突变体产生病毒的缺陷相矛盾（图。​（图1）1) (9).

总之，我们提供的数据表明，成年小鼠神经毒力Sindbis-group病毒S.A.AR86的nsP1的减弱突变加快了病毒非结构蛋白的成熟形式的裂解，从而导致病毒26S RNA合成的更快诱导。目前正在进行其他研究，以确定这种蛋白质加工和病毒RNA合成的改变是否在s51（nsP1 538 Ile）病毒的减毒表型中起直接作用。

致谢

参考文献