胞嘧啶DNA甲基化在基因沉默和异染色质形成中起主要作用(1). 在哺乳动物中,甲基化主要局限于CpG二核苷酸,但在一些细胞类型中发现不对称位点的低水平甲基化(2). 在一些真菌基因组中也发现不对称DNA甲基化。例如,粗糙脉孢菌显示了与一种称为对重剑-我诱导的P(P)点突变(RIP)(三)、和沉水子囊藻显示了与M(M)乙基化我诱导的P(P)记忆(MIP)现象(4). 植物基因组含有高水平的不对称甲基化,也含有丰富的CpNpG甲基化(5–8).
CpG位点的对称性被认为对DNA复制后甲基化模式的稳定维持很重要(9,10). 对称位点的复制将产生半甲基化序列,这被认为是维持甲基转移酶的首选靶点,维持甲基转移酶将使新合成的DNA链中的胞嘧啶甲基化(11). 与这些早期想法一致,Dnmt1是哺乳动物中主要的CpG甲基转移酶(12),已知偏好含有半甲基化CpG二核苷酸的DNA底物(13). Dnmt1也定位于DNA复制焦点(14)这与维持甲基化和DNA复制紧密耦合的概念是一致的。植物中甲基化的CpNpG位点也是对称的。虽然可以想象CpNpG甲基化的维持与CpG甲基化相类似,但其机制基本上一无所知。另一方面,非对称或非顺式序列的甲基化可以通过不同于对称位点的机制很好地维持。不对称甲基化必须在每个DNA复制周期后重新建立,因为没有互补序列来指导特定胞嘧啶的再甲基化(2,15,16).
不对称甲基化的功能尚不清楚。在一项研究中,所有对称的CpG和CpNpG位点都从一个35S转基因中移除,该转基因通常会被第二个转基因转染,该转基因含有重复序列中存在的35S启动子(17). 对称的无位点转基因在不对称位点处严重甲基化。此外,去除对称位点并没有阻止该转基因的转录沉默,但确实阻止了在没有重复序列的情况下保持沉默。体外不对称胞嘧啶的甲基化也降低了原生质体中35S启动子的转录活性(18). 这些研究表明,不对称甲基化可以在没有对称甲基化的情况下存在,并可能导致基因沉默。
拟南芥至少有三类DNA甲基转移酶基因可能是控制不对称甲基化的候选基因MET1型类厘米3(色甲烷酶3)类,以及结构域重排甲基化酶(数字版权管理)类(19). 虽然这些基因可能编码的酶是活性甲基转移酶,但这还没有通过研究在体外蛋白质的酶性质。
这个MET1型基因类别(20)最类似于Dnmt1型在顺序和功能上。功能丧失满足1突变体(也称为ddm2型突变体)和反义-MET1型转基因植物缺乏大多数CpG甲基化(20–25). 与突变体相比Dnmt1型发育9天后死亡的反义小鼠-MET1型或满足1突变体植物是可行的,但随着突变体的近交,表现出一些发育异常,这些异常会变得越来越极端(22,23). 令人惊讶的是,其中一些异常是由特定基因的异位高甲基化引起的,例如超人(啜饮)和阿加穆斯(8,26),这种现象表面上类似于在其他低甲基化的基因组背景下人类肿瘤抑制基因的高甲基化(27).
这个CMT3型这类基因是植物界特有的,编码甲基转移酶蛋白,其中含有一个染色结构域(28).CMT3型在三项独立的研究中分离出功能丧失突变体,显示CpNpG甲基化在全基因组范围内消失,一些位点的不对称甲基化减少(24,29,30). CpNpG甲基化也受到组蛋白甲基化的影响,因为克雷普托尼特(KYP公司)组蛋白H3赖氨酸9甲基转移酶基因在CpNpG环境中显示DNA甲基化缺失(31).
第三类基因,由DRM1(DRM1)和DRM2(DRM2),包含与哺乳动物Dnmt3甲基转移酶序列相似的催化域(32).Dnmt3a型和Dnmt3b型编码重要从头开始甲基转移酶(33–36). 例如,携带两种酶突变的小鼠缺乏从头开始甲基化逆转录病毒导入胚胎干细胞(35). 此外,在人类中,Dnmt3b型突变降低了一些着丝粒周围序列的CpG甲基化,是一种罕见的隐性疾病ICF综合征的原因我免疫力,c(c)熵不稳定性,以及(f)acial异常(35,37,38). 我们最近报道称数字版权管理在所有已知序列背景下,胞嘧啶甲基化的初始建立需要基因:CpG、CpNpG和不对称(39). 我们发现了数字1数字2缺少双突变体从头开始甲基化的直接重复序列鱼类和野生动物管理局轨迹,通常发生在鱼类和野生动物管理局转化为野生型植物(39).数字1数字2双突变体也被阻断从头开始甲基化啜饮轨迹,出现在啜饮反向重复。然而drm公司突变体没有表现出先前甲基化和沉默的再激活鱼类和野生动物管理局或啜饮表观遗传等位基因,表明数字版权管理基因是建立基因沉默所必需的,但不是维持基因沉默所必需的(39).
在本报告中,我们表明数字版权管理位点是维持不对称DNA甲基化所必需的。然而,在某些位置,例如啜饮,我们发现数字版权管理以冗余方式行事CMT3型,所以只有在drm1 drm2 cmt3三重突变体均不对称甲基化丢失。此外,我们发现在某些位点数字版权管理对维持CpNpG甲基化比CMT3型我们的数据表明数字版权管理和CMT3型基因编码部分冗余的甲基转移酶,不同的序列或染色质环境可以调节它们的功能。
结果
DRM控制不对称和CpNpG甲基化鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司.
为了确定数字版权管理在保持不对称甲基化的基因座中,我们使用亚硫酸氢盐基因组测序来研究在不对称位点甲基化的两个内源性序列的甲基化水平,鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司. The鱼类和野生动物管理局该基因座编码一种同源域蛋白,其在野生型植物的营养组织中的表达被沉默。这种沉默与基因5′区两个直接重复序列的甲基化有关(40). 当这种甲基化丢失时,无论是在自发的低甲基化表观遗传突变中,如转发-1或者在甲基化突变体中ddm1型和满足1,的鱼类和野生动物管理局基因过度表达导致显性晚花表型(24,40,42). 在野生型中鱼类和野生动物管理局直接重复序列包含89%的CpG、18%的CpNpG和4%的不对称甲基化(图。和表2,作为支持信息发布在PNAS网站上,网址:www.pnas.org) (40).MEA-ISR公司是一个大约183-bp的序列,存在于印迹美狄亚之间的基因间区域的7个直接重复序列中(测量)基因(43,44)BAC克隆T14P4上的醛氧化酶基因位于1号染色体上端附近,距离末端约500000 bp。这些重复序列还发现于其他12个基因组位置,所有这些位置都是亚群。因此,我们将此序列命名为MEA-ISR公司对于我内源性的S公司亚端粒的对重剑。我们发现,这种重复在野生型菌株中显示出高水平的DNA甲基化,即87%的CpG、47%的CpNpG和18%的不对称(图。).
图中显示了顶部链500-nt区域的亚硫酸氢盐序列鱼类和野生动物管理局基因,219-nt区MEA-ISR公司区域,以及啜饮不同突变背景的基因。支持图形表示的详细数据见表2和图6。为了分析鱼类和野生动物管理局和测量仪表,野生型菌株为WS啜饮基因,野生型菌株是clk-st公司在兰茨堡直立人背景。数字1数字2,厘米t3-7,和drm1 drm2 cmt3突变体是纯合子clk-st公司反向重复啜饮转基因。条形的高度表示通过亚硫酸氢盐测序分析的15个克隆的每个位点的甲基化百分比。
我们将亲本Wassilewskija(WS)菌株与数字1数字2通过亚硫酸氢盐基因组测序发现双突变株数字1数字2突变消除了两种基因的所有不对称甲基化鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司序列。因此数字版权管理基因座对不对称胞嘧啶的甲基化很重要。
这个数字1数字2突变还消除了两种基因的CpNpG甲基化鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司(图。). 因为厘米t3以前发现突变能强烈降低所有检测基因座CpNpG位点的甲基化(24,30),我们接下来分析了鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司在中厘米t3-7突变体,空厘米3等位基因(24). 我们发现了厘米t3-7降低但没有消除CpNpG甲基化(图。). 因此,两者都是数字版权管理和CMT3型在某些位点,如鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司,的数字1数字2双突变体比厘米3-7降低CpNpG甲基化。
我们还分析了drm1 drm2 cmt3-7通过亚硫酸氢盐测序获得三个突变体(图。)然后发现,就像数字1数字2双突变体,三突变体在鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司然而,CpG甲基化水平与野生型相似。
我们使用甲基化敏感限制酶的Southern blot分析来确认亚硫酸氢盐在鱼类和野生动物管理局和测量仪表在这些分析中,我们还包括数字资源1和干重2单个突变体以及满足1突变体。对于鱼类和野生动物管理局斑点,我们包括fwa-1型表观遗传突变(40)作为完全非甲基化的对照。甲基化鱼类和野生动物管理局用两种甲基化敏感限制性内切酶对该基因进行了检测,Cfo公司我和Bgl公司二、 在甲基化的直接重复序列中发现(图。A类).Cfo公司我识别GCGC序列,并被该位点的CpG甲基化所抑制。先前的Southern杂交结果表明数字1数字2双突变体(39)和厘米t3-7单一突变体(31)不影响CpG甲基化鱼类和野生动物管理局这里我们比较了两个独立的drm1 drm2 cmt3三重突变体(命名为A和B)和所有单个突变体,发现所有突变体或突变体组合显示出与野生型对照WS相同的CpG甲基化水平(图。A类). 这一发现与亚硫酸氢盐序列数据一致,表明drm1 drm2 cmt3三重突变体不影响预先存在的CpG甲基化鱼类和野生动物管理局.CpG甲基化在满足1发展出fwa公司晚开花表型(图。A类). 这一发现进一步证实了MET1型维持CpG甲基化(20,22–25).
Southern blot分析鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司. (A类 上部)Cfo公司我和Bgl公司II存在于鱼类和野生动物管理局基因。内部两个Cfo公司I站点和Bgl公司II位点位于鱼类和野生动物管理局启动程序,如上面的箭头所示。还注意到亚硫酸氢盐测序分析的区域。(下部)等量的DNA印迹Cfo公司我(左侧)和Bgl公司二(赖特)用一个1.74-kb的片段探测消化后的基因组DNA,该片段与顶部的图表相对应。图中显示了甲基化(M)、非甲基化(U)和部分甲基化(P)带的位置,以及带的大小(千碱)。drm1 drm2 cmt3-7A和B是两个独立分离的三重突变菌株。(B类 上部)血红蛋白二/Msp公司I限制片段存在于MEA-ISR公司区域。内部血红蛋白二/Msp公司I位点位于七个直接重复序列中的第一个(如箭头所示),探针位于这些重复序列和测量轨迹。(下部)等量的DNA印迹血红蛋白二(左侧)和Msp公司我(赖特)用与上图对应的1.1kb片段探测消化后的基因组DNA。
限制性内切酶Bgl公司II被其识别位点AGATCT内的胞嘧啶甲基化抑制(45),我们用这种酶来检测CpNpG甲基化鱼类和野生动物管理局。由于处的序列上下文鱼类和野生动物管理局(A)AGATCT公司G) ,Bgl公司II将在我们之前通过亚硫酸氢盐测序发现甲基化的位点检测CpTpG甲基化(40).Bgl公司II也会被另一条链上不对称CpTpT位点的甲基化所抑制,但因为我们还没有通过亚硫酸氢盐测序在该位点发现甲基化,这不太可能使分析复杂化。3.7千字节Bgl公司II片段由胞嘧啶甲基化引起Bgl公司II站点出现在野生型WS中,但不出现在fwa-1型(图。A类). 在中检测到微弱的3.7 kb甲基化带厘米t3-7,与亚硫酸氢盐序列数据一致,表明CpNpG甲基化在厘米3-7(图。).数字1数字2双突变体和drm1 drm2 cmt3-7三重突变体消除了甲基化Bgl公司II位点,与亚硫酸氢盐数据一致,显示这些菌株中缺乏CpNpG甲基化(图。).
甲基化Bgl公司II站点也在干重2单个突变体,但不在数字资源1单个突变体(图。A类). 这一发现与我们之前的观察结果相符干重2但不是数字资源1此 路 不通鱼类和野生动物管理局转基因从头开始甲基化(39)事实上DRM2(DRM2)RNA的表达水平远高于DRM1(DRM1)核糖核酸(32). 因此DRM2(DRM2)可能编码DRM家族中的主要酶。
对于MEA-ISR公司区域,我们使用单个血红蛋白二/Msp公司I位点(CCGG)出现在第一个直接重复内。我们使用一个与这些重复序列相邻的独特序列中的探针来检测该位点的甲基化(图。B类).血红蛋白II被其识别位点的胞嘧啶甲基化抑制,允许检测CpG和CpNpG甲基化,而Msp公司我只被外胞嘧啶的甲基化抑制,允许检测CpNpG甲基化。与野生型菌株WS和Ler相似,数字1数字2,厘米3-7和drm1 drm2 cmt3-7三重突变植株未被切割血红蛋白二、 证实亚硫酸氢盐数据表明这些突变体不影响CpG甲基化(图。). 然而满足1突变体表现出完全消化血红蛋白II表明位点甲基化缺失(图。B类).
这个Msp公司I Southern印迹MEA-ISR公司序列显示野生型Ler和WS-DNA约50%的裂解(图。B类),与亚硫酸氢盐序列测定的47%CpNpG甲基化一致(图。). 与鱼类和野生动物管理局基因,干重2但不是数字资源1导致所有CpNpG甲基化在测量值。厘米t3-7保留了相当数量的CpNpG甲基化,再次与亚硫酸氢盐数据一致(图。). 这些结果证实,在MEA-ISR公司轨迹,厘米t3-7单个突变体和数字1数字2双突变体均降低CpNpG位点的甲基化,但数字1数字2这样做效率更高。
总之,数字1数字2双突变体在两个位点都显示非CpG甲基化完全丧失鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR。有趣的是,数字1数字2植物没有表现出典型的晚开花表型鱼类和野生动物管理局基因已被重新激活(39). 这表明非CpG甲基化在沉默鱼类和野生动物管理局.
两者都有数字版权管理和CMT3型控制不对称甲基化啜饮.
表观遗传沉默的等位基因啜饮轨迹(克拉克肯特或clk公司等位基因)在所有序列中都被密集甲基化(8,24,25). 而最初孤立的clk公司等位基因自发回复到非甲基化状态≈3%的时间(8),一个名为clk-st公司显示稳定的非回复表型,使其更适合遗传研究(24).clk-st公司包含啜饮基因座,可以诱导从头开始自身甲基化和内源性甲基化啜饮轨迹(在参考文献39中详细描述)。甲基化由16%CpG、55%CpNpG和16%不对称组成(图。) (24). 我们之前发现厘米3-7消除了CpNpG甲基化,并将不对称甲基化降低了约60%(图。) (24). 测试drm公司上的突变啜饮甲基化,我们比较了clk-st公司用一个drm1 drm2 clk-st应变,应变(39). 与发现的情况相反鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司,我们观察到数字1数字2双突变体减少了但没有消除不对称甲基化(图。图6和表2,作为支持信息发布在PNAS网站上)(24,39). 然而,这种残留的不对称甲基化在drm1 drm2 cmt3-第7节应变(图。). 因此,数字版权管理和CMT3型多余地进行控制啜饮不对称甲基化。
因为drm1 drm2 cmt3-7三重突变体消除所有不对称甲基化啜饮,甲基化残留分析厘米t3-7突变体应反映数字版权管理和剩下的数字1数字2应反映CMT3型.图。A类显示了非对称甲基化的位置啜饮保留在其中之一厘米t3-7植物或数字1数字2植物大部分重叠(也见图6)。对这些突变体中不对称甲基化序列背景的分析表明,CMT3和DRM都倾向于胞嘧啶残基之后的甲基化位点(表). 然而,CMT3和DRM都显示出对紧邻胞嘧啶之前的位点的偏见;CpA和CpT甲基化比CpC甲基化更频繁(表). 这些结果表明,CMT3和DRM可以甲基化相同的不对称位点,并且两者对特定DNA序列上下文的偏好大致相同。
表1
在啜饮亚硫酸氢盐处理DNA的15个克隆PCR产物中的位点
现场 | %位点甲基化
|
---|
野生型 | 厘米t3-7 | 数字1数字2 | drm1 drm2 cmt3-7 | 现场数量 |
---|
所有站点* | 16.2 | 5.7 | 8.7 | 0 | 204 |
C类个人账户 | 17.1 | 4.6 | 8.7 | 0 | 70 |
C类pT型 | 22 | 9.5 | 13 | 0 | 86 |
C类保时捷中心 | 4.7 | 0.7 | 1 | 0 | 48 |
Ap公司C类 | 8.6 | 0.6 | 4.5 | 0 | 46 |
Tp公司C类 | 18.3 | 7.1 | 8.9 | 0 | 83 |
集团C类 | 13.3 | 4.7 | 5.8 | 0 | 31 |
内容提供商C类 | 22.4 | 9.1 | 14.7 | 0 | 44 |
CpNp公司C类† | 22.5 | 8.4 | 12.7 | 0 | 61 |
CpCp公司C类 | 40 | 15.6 | 30.4 | 0 | 9 |
遗传冗余数字版权管理和CMT3型基因。(A类)显示非对称甲基化水平和位置的图表啜饮在中厘米t3-7突变体或数字1数字2双突变体,均位于clk-st公司背景。条形的高度表示通过亚硫酸氢盐测序分析的15个克隆的每个位点的甲基化频率。这个x个axis表示啜饮. (B类)四周龄野生勒尔植物的照片(左侧)和几个drm1 drm2厘米3-7三重突变植物(赖特).
The effects of thedrm公司CpNpG甲基化突变啜饮也不同于在鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR。数字1数字2只有CpNpG甲基化在啜饮大约30%的基因座,而厘米t3-7完全消除了这种甲基化。因此数字1数字2CpNpG甲基化是局部特异性的,完全消除了鱼类和野生动物管理局和MEA-ISR公司,但仅在啜饮.
CMT3控制Ta3反转录转座子和着丝粒重复序列的CpNpG甲基化。
我们测试了各种单甲基转移酶、双甲基转移酶和三甲基转移酶突变体对两个着丝粒周围序列的影响Ta3型逆转录转座子和180-bp着丝粒重复序列,使用Southern blot分析血红蛋白II和Msp公司I(图。). 也不是drm公司单个突变体也不是数字1数字2双突变体影响酶消化模式,表明数字版权管理在这些序列中,基因在维持CpG或CpNpG甲基化方面不起作用。相反,厘米t3-7和drm1 drm2 cmt3-7三个突变体通过Msp公司一、 但不是血红蛋白二、 证明了这一点CMT3型负责维持CpNpG甲基化钽3和着丝粒重复序列(24,31).
Southern blot分析Ta3型逆转录转座子和180-bp着丝粒重复序列。每个面板显示的泳道含有等量的所示基因型的基因组DNA,用血红蛋白二(左侧)和Msp公司我(赖特). (A上部)血红蛋白二/Msp公司I限制片段存在于钽3探查。(下部)DNA印迹探针钽3探查。(B类)用180-bp着丝粒重复探针探测斑点。
我们还发现,与厘米t3突变体(24)和满足1突变体(X.C、L.Johnson和S.E.J.未发表的观察结果),数字1数字2双突变体没有表现出RNA表达的重新激活钽3序列(数据未显示)。因此数字版权管理基因似乎不起维持基因沉默的作用钽3.
MET1型可能间接影响CpNpG和不对称甲基化。
亚硫酸氢盐测序和Southern blot数据表明,CpG位点的甲基化在drm1 drm2 cmt3-7测试所有序列的三个突变菌株(图。–). 相反,在每个测试序列中满足1突变体显示CpG甲基化显著降低(图。和). 因此,与哺乳动物对应物Dnmt1一样,MET1似乎是维持CpG甲基化的主要甲基转移酶。然而,与早期研究一致(22,23,46),我们观察到满足1突变体大大降低了CpNpG甲基化鱼类和野生动物管理局,MEA-ISR公司,钽3和着丝粒重复序列(图。和),并消除了鱼类和野生动物管理局和测量仪表通过亚硫酸氢盐测序检测(数据未显示)。因为MET1型不能替代CpNpG的维持和drm1 drm2 cmt3-7菌株中,CpNpG的丢失和不对称甲基化似乎最有可能发生在满足1不是由MET1酶的杂乱酶活性直接引起的,而是由CpG甲基化的初级损失引起的次要影响。
多效性形态表型标记数字版权管理和CMT3型冗余。
虽然两者都不是厘米t3突变体(24)也不是数字1数字2双突变体(39)表现出与野生型的形态差异,drm1 drm2 cmt3-7植物表现出多效性表型,包括发育迟缓、植株缩小和部分不育(图。B类). 然而,我们没有观察到在ddm1型和满足1甲基化突变体,例如棍状突起-像花一样,无花瓣2-像花一样,无性生殖的-像花一样,啜饮-像花朵,或极度晚花(22,23,26,42). 因此,数字版权管理和CMT3型以冗余的方式控制植物生长和发育的某些方面,这些方面可能不同于ddm1型和满足1突变体。
讨论
基因座特异性作用数字版权管理和CMT3型甲基转移酶基因。
我们的结果表明数字版权管理和CMT3型基因编码甲基转移酶,在不对称和CpNpG甲基化的控制中显示出重叠的作用(图。A类). 然而,这些甲基转移酶的活性高度依赖于所研究的基因座,从而产生了数量惊人的不同依赖模式数字版权管理,CMT3型或两者兼而有之。图。B类总结了这项研究的结果,显示了每个甲基化基因对数字版权管理和/或CMT3型用于不对称和CpNpG甲基化。靶向这些甲基化酶以改变其功能的信号是什么?似乎可能涉及多个因素,包括特定位点的染色质修饰、涉及的DNA序列,以及CpG甲基化和非CpG甲酯化之间的串扰。
说明DRM和CMT3活动之间复杂关系的模型。(A类)DRM和CMT3都具有甲基化不对称位点和CpNpG位点的能力,但这些活性是特定于场所的,因此可能受到文本中讨论的各种因素的调节。(B类)DRM和CMT3活性的总结,该活性是通过分析基因中每个位点甲基化丢失的类型推断出来的数字1数字2,厘米t3-7,或drm1 drm2 cmt3-7突变体。较厚的箭头表示更多的活性,这是从特定突变中甲基化损失较大推断出来的。
染色质修饰可以从两个层面考虑:整体染色质结构和特定组蛋白修饰。染色质整体结构的示例由钽3反转录转座子和着丝粒重复序列,它们嵌套在高度浓缩的、着丝粒周围的、组成型异染色质中。位于着丝粒附近的高阶染色质结构可能以这样一种方式调节甲基转移酶功能,即CMT3仅负责CpNpG位点的甲基化(图。B类). 相反,MEA-ISR公司是亚砾岩,并且啜饮和鱼类和野生动物管理局处于单拷贝序列的中间,这可能是自然界中的常染色序列。组蛋白H3 Lys-9甲基化是一个特殊染色质修饰的例子。中的突变KYP公司编码组蛋白H3 Lys-9特异性甲基转移酶的基因降低CpNpG甲基化(31). 该观察结果表明,通过CMT3与甲基化染色质的相互作用,CpNpG DNA甲基化至少部分受组蛋白H3 Lys-9甲基化控制。一种可能性是,H3 Lys-9甲基化可能通过与H3 Lys-9结合蛋白HP1的植物同源物的相互作用,更有效地将CMT3募集到特定位点(31). 第二种可能性是H3 Lys-9甲基化和/或HP1结合作用调节CMT3的生化特性,刺激其CpNpG甲基化活性或调节其对非甲基化或半甲基化CpNp G位点的偏好。
可以想象至少有两个DNA序列参数可以调节甲基转移酶的功能;总体序列结构和序列组成。整体序列结构的一个例子可能是存在直接或反向重复,这实际上在本研究的所有基因中都发现了。鱼类和野生动物管理局,MEA-ISR、,并且180-bp着丝粒重复序列都包含彼此直接相邻的直接重复序列。这个钽3反转录转座子在元件的每一端包含长末端重复序列,这些序列是由几个千碱基分隔的直接重复序列。最后clk公司本研究中使用的等位基因,clk-st公司,包含的反向重复啜饮除了内源性基因啜饮基因座(39). 就序列组成而言,特定靶位点的密度可能是重要的。特别是,我们注意到啜饮,其甲基化和沉默高度依赖于CMT3型功能,富含CpNpG位点,但CpG位点很少。在甲基化1028-bp区域内有9个CpG和27个CpNpG位点。相反鱼类和野生动物管理局其甲基化和沉默主要依赖于MET1型函数,富含CpG。500-bp甲基化区域鱼类和野生动物管理局包含20个CpG位点(在啜饮)和14个CpNpG站点。
另一个需要考虑的可能性是,CpG甲基化可以针对非CpG的甲基化。这项研究和其他研究的结果表明,MET1对CpG甲基化具有特异性,但满足1突变体在大多数检测位点显示非CpG甲基化显著降低(20,22–25). MET1不直接甲基化非CpG位点的最有力证据是,所有非CpG-甲基化的痕迹在drm1 drm2厘米3-7三个突变体,包含野生型MET1型基因。此外,在啜饮轨迹满足1突变体导致CpG甲基化大幅度降低,而CpNpG和不对称甲基化没有重大损失(24,25). 这些结果表明MET1对CpG甲基化具有特异性,CpNpG的丢失和不对称甲基化满足1突变体是间接的。对这些发现的一种解释是,先前存在的CpG甲基化会在其他情况下产生胞嘧啶进一步甲基化的信号。一个例子是鱼类和野生动物管理局,主要在CpG位点(89%)甲基化,在CpNpG位点和不对称位点(4%)甲基化较少。这个数字版权管理基因座主要负责维持这种非CpG甲基化,因为它在数字1数字2双突变体。然而,在fwa公司a中诱导的突变体满足1背景,所有CpG和非CpG甲基化的痕迹都消失了(24,40). 因此,DRM可以甲基化CpNpG和不对称位点鱼类和野生动物管理局这可能是因为先前存在的CpG甲基化本身,也可能是因为CpG的甲基化引起的其他染色质修饰。第二种可能性是CpG甲基化的缺失鱼类和野生动物管理局足以重新激活基因表达,并且该转录产生对非CpG甲基化具有抑制作用的染色质结构。
这项研究的一个有趣的方面是,CMT3似乎在啜饮基因座,但不在其他测试的基因座。一种可能的解释是啜饮转基因中存在的位点clk-st公司该线激活CMT3甲基化不对称位点的能力。然而,我们发现在drm1 drm2 clk-3三重突变植物(参考。39数据未显示),表明CMT3可以甲基化单个啜饮该菌株存在内源性。因此,似乎染色质或DNA结构的某些方面啜饮激活CMT3的不对称甲基化活性。我们之前发现啜饮包含一个富含嘧啶的序列,预计会形成一个小发夹(26). 在无义基因座的两个高甲基化区域也发现了类似的序列。似乎有可能啜饮发夹,或这种发夹被转录成小RNA的潜力,激活了啜饮有人可能会预测个人事故保险位点(47)与DNA甲基转移酶的关系类似啜饮不对称甲基化依赖于DRM和CMT3活性。这是因为之前对甲基化模式的观察个人事故保险基因表现出高度不对称甲基化,在厘米t3突变体(30).
总之,几个染色质或DNA序列参数可能单独或联合调节非CpG甲基化,只有通过研究非CpG-甲基化的其他遗传修饰物才能进一步了解这个问题。
不对称甲基化序列特异性。
对DRM和CMT3甲基化的不对称位点序列背景的分析表明,相对于CpC位点,这两种酶都更倾向于甲基化CpA和CpT位点(表). 这些结果与其他有关植物不对称甲基化的研究结果一致,其中CpA和CpT的含量超过CpC甲基化(6,17,48). 这些结果也与植物DNA的最近邻分析一致(5)以及对在体外纯化植物甲基转移酶的底物选择性(49,50). 有趣的是,小鼠胚胎干细胞还含有大量的CpA和CpT甲基化,以及较低的CpC甲基化,间接证据表明,CpC的甲基化在胚胎干细胞发育中起着重要作用Dnmt3型基因(最接近的哺乳动物数字版权管理同源物)维持这种甲基化(2). 例如,小鼠胚胎干细胞突变Dnmt1型仍然含有显著水平的CpA和CpT甲基化Dnmt3a型暗示它与甲基转移酶有关(2). 此外,Dnmt3a可以甲基化非CpG位点在体外或当外胚层表达于果蝇属单元格(2,16)在这两种情况下,CpA和CpT位点甲基化的频率高于CpC位点。最后,站点C我C(A/T)GG在哺乳动物中也被甲基化(51–55). 因此,对CpA和CpT位点甲基化的偏好可能是不对称甲基转移酶的保守特性。
De Novo公司甲基化与非CpG甲基化的维持。
之前对drm公司突变体表明DRM编码主要从头开始甲基转移酶拟南芥(39). 例如,数字1数字2双突变体完全阻断从头开始CpG甲基化和转基因沉默鱼类和野生动物管理局,通常发生在鱼类和野生动物管理局被转化为植物。此外,数字1数字2双突变体被阻断从头开始CpNpG与内源性非对称甲基化和基因沉默啜饮轨迹,通常出现在啜饮反向重复转基因位点。这些实验表明数字版权管理基因编码的酶能够甲基化以前未经修饰的DNA,并且CMT3型无法替代此函数。然而,在这项研究中,我们表明,对于已经确定沉默的基因数字版权管理和CMT3型基因座的作用是多余的,以维持适当的不对称和CpNpG甲基化模式。因此,必须区分基因的初始甲基化和沉默(通常称为从头开始甲基化),并在基因最初甲基化后保持非CpG甲基化的总体模式。DRM似乎参与了这两个过程,而CMT3仅参与了后者。
此外,尽管数字版权管理和CMT3型就维持非CpG甲基化的总体模式而言,基因座在功能上是多余的,特别是在CpNpG甲基化时,这两个基因座的作用机制可能不同。例如,DRM2可能更有效地甲基化完全未修饰的CpNpG位点,而CMT3可能表现出对半甲基化的CpNpG位点的偏好。
非CpG甲基化的生物学功能。
我们发现,尽管数字1数字2双突变体也不是厘米t3-7单个突变体表现出与野生型的形态差异,drm1 drm2 cmt3-7植物表现出多效性发育缺陷。这些drm1 drm2 cmt3-7植物在所有测试序列中都保持了CpG甲基化(图。–),表明多效性表型是由非CpG甲基化减少引起的,这对一些内源性植物过程很重要。在植物中,高水平的非CpG甲基化与转录和转录后基因沉默期间观察到的RNA定向DNA甲基化有关,这种甲基化可能有助于病毒和转座子序列的沉默(15,56–62). 因此,一种可能性是drm1 drm2 cmt3-7植物是由基因组防御/基因沉默过程中的缺陷引起的。对这些三突变体植物的进一步研究可能有助于揭示非CpG甲基化的可能生物学功能。