内质网（ER）是细胞内的主要细胞器，分泌蛋白和跨膜蛋白在其中合成和修饰，以获得适当的三级结构。各种环境压力（如葡萄糖缺乏、细胞内钙离子紊乱2+储存和抑制蛋白质糖基化）导致内质网管腔中错误折叠的蛋白质积聚(18). 此外，一些疾病的病理生物学与内质网中累积的突变或错误折叠蛋白的有害影响有关(4,14). 在真核细胞中，对内质网中未折叠蛋白积累的反应（称为未折叠蛋白反应或UPR）涉及三个不同的方面（参考文献综述15和21)：（i）翻译衰减，减少新合成蛋白质被ER折叠的负担；（ii）ER驻留分子伴侣和相关应激反应蛋白的转录诱导，包括BiP/GRP78和GRP94；和（iii）通过逆行运输去除内质网中错误折叠的蛋白质，并通过内质网膜细胞质表面或附近的26S蛋白酶体降解这些蛋白质。
UPR信号转导途径首次被阐明用于酿酒酵母在酵母中，内质网驻留的跨膜蛋白激酶Ire1p是导致UPR激活的内质网应激的唯一近端传感器(8,23,29). Ire1p的N末端感测ER管腔内的扰动环境，导致寡聚和反式其细胞质定位激酶结构域的磷酸化。这反过来被认为激活了Ire1p C末端的相邻内核糖核酸酶活性，该酶从编码转录因子Hac1的mRNA中切除一个翻译抑制内含子。当Hac1被有效翻译时，它与ER伴侣和其他UPR靶基因启动子中未折叠的蛋白反应元件结合，并上调其转录(5,16,22,24).
哺乳动物的UPR更为复杂。在哺乳动物中，ER包含两个Ire1p同源物，普遍表达的IRE1α(38-40)和IRE1β，主要在肠道上皮中表达(40). 此外，与酵母细胞溶质Gcn2激酶和哺乳动物PKR激酶相关的第三个跨膜ER激酶PERK磷酸化eIF-2α，从而介导翻译抑制对UPR激活的反应(11,34). 令人惊讶的是，内质网应激诱导的BiP在IRE1α中也没有受损−/−IRE1β−/−从小鼠胚胎中获得的双敲除细胞(39)或在IRE1α基因因基因破坏而失活的小鼠胚胎干细胞中(19)这表明哺乳动物细胞中存在IRE非依赖性或补偿途径，调节内质网应激诱导的转录反应。
ER驻留跨膜转录因子ATF6是UPR的另一个反式激活因子。该蛋白的细胞溶质部分编码一个转录激活域，当它因内质网应激而从膜上分裂时，会迁移到细胞核，在那里它能够上调BiP基因和其他应激反应基因的表达(12,20,41,45). ATF6和IRE1是作为单个通路的串行成分发挥作用，还是代表平行但重叠的通路，仍在研究中。
许多关键的调节激酶，包括可溶性丝氨酸/苏氨酸激酶Raf1(32,36,42)，阿克特(31,35)，Gcn2公司(10)，巴基斯坦卢比(9)和I型跨膜酪氨酸激酶p185/ErbB2(6,43)依赖于与分子伴侣HSP90的相互作用，以实现稳定性和功能。在研究中，发现HSP90与这些蛋白质的激酶结构域相关，并且HSP90结合药物格尔德霉素（GA）对这种关联的干扰导致其快速失稳和蛋白酶体介导的降解（有关综述，请参阅参考文献25). HSP90以前没有参与内质网应激反应。然而，由于PERK和IRE1都是I型跨膜激酶，并且考虑到Gcn2和PKR对HSP90的依赖性，我们决定通过调节IRE1和/或PERK的稳定性和功能来研究HSP90参与哺乳动物UPR的可能性，我们试图确定最近报道的GA是否仅诱导短暂UPR的能力(17)是由于HSP90介导的UPR信号通路效应被破坏。
在这里，我们表明HSP90确实与两种ER跨膜激酶的细胞质结构域相关，并且其持续的关联是这些蛋白质稳定性所必需的。最后，我们的数据表明，GA瞬时诱导UPR的能力并不取决于其与HSP90的结合，而是取决于它与GRP94的相互作用，GRP94是HSP90中的ER相关副产物。由于GA诱导的HSP90依赖性IRE1活性的丧失，这种作用是有时间限制的。
材料和方法
细胞培养和瞬时转染。
NIH 3T3成纤维细胞、HEK 293和COS7细胞在含有10%胎牛血清、2 mM的Dulbecco改良Eagle’s培养基中生长我-谷氨酰胺和1%真菌酮（马里兰州沃克斯维尔BioWhittaker）。将AR42J大鼠胰腺癌细胞保存在补充有15%胎牛血清、2 mM的F12K培养基（弗吉尼亚州马纳萨斯美国型培养物收集中心）中我-谷氨酰胺和1%真菌酮。
对于瞬时转染研究，HEK 293和COS7细胞生长在6厘米直径的培养皿中。根据制造商的说明，使用Lipofectamine-Plus（Gibco BRL，Rockville，Md.）转染细胞，每个标记cDNA编码0.5至1μg全长人类IRE1α（氨基酸1至1115）或ΔIRE1（缺乏细胞质结构域；氨基酸725到1115）。必要时，转染后24小时，用GA（根据实验）处理细胞，然后用含有蛋白酶抑制剂的冷TNESV缓冲液（50mM TRIS HCl[pH 7.4]、1%Nonidet P-40、2mM EDTA、100mM NaCl、1mM原钒酸钠）裂解。在pcDNA3.1质粒中克隆的全长IRE1α和ΔIRE1 cDNA是日本大阪大阪大学K.Imaizumi的一份礼物，之前已有描述(13).
ATF6表达质粒pCGN-ATF6（在N末端含有血凝素[HA]标签）是从R.Prywes（纽约哥伦比亚大学）获得的，之前已经描述过(41). 如上所述瞬时转染COS7细胞。转染后20至24小时，根据实验条件用GA、GA衍生物514或衣霉素处理细胞。如前所述，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blotting在细胞裂解液中检测到瞬时表达的HA标记ATF6蛋白的裂解和未裂解形式(43).
抗体和免疫沉淀。
HSP90抗体SPA-830和SPA-835购自StressGen生物技术公司（加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚市）。HA、BiP和XBP1抗体购自加州圣克鲁斯生物技术公司。IRE1和PERK多克隆抗血清来自D.Ron（纽约州纽约市纽约大学）。抗-FLAG-M2抗体购自Upstate Biotechnology（Lake Placid，N.Y.）。如前所述进行免疫沉淀分析(43). 简言之，用1至3μg抗Flag、抗PERK或抗IRE1抗体免疫沉淀可溶性蛋白（每种情况下400μg），并在4°C下将免疫复合物结合在蛋白A-Sepharose珠上6小时（旋转）。用TNESV缓冲液洗涤珠子四次，用SDS-7.5或10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离结合蛋白并转移到硝化纤维素膜上进行Western blot分析。
应激诱导剂。
GA及其HSP90提呈衍生物514（NSC#658514）来自发展治疗计划（国家癌症研究所），分别以2和5 mM的储备浓度溶解在二甲基亚砜中，并使用水介质稀释至其最终浓度。Tunicamycin、二硫苏糖醇（DTT）和thapsigargin购自Sigma（密苏里州圣路易斯），分别以2.5 mg/ml、1 M和1 mM的储备浓度溶解于二甲基亚砜或水中。
IRE1的GST-HSP90绑定。
将来自转染细胞或含有高水平内源性IRE1（AR42J）的细胞的等量蛋白裂解物与谷胱甘肽Sepharose 4B珠（Amersham Pharmacia，Uppsala，Sweden）孵育，该珠之前已装载纯化谷胱甘苷S公司-转移酶（GST）-HSP90（明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所D.Toft的礼物）。将样品在4°C下旋转2小时，然后用TNESV缓冲液彻底洗涤。洗涤后的珠子在蛋白负载缓冲液中煮沸，并通过SDS-PAGE进行分析。用抗Flag或抗IRE1抗体进行蛋白质印迹。
在有或无GA的情况下测定IRE1半衰期。
如上所述，用IRE1质粒转染COS7细胞。用GA处理这些细胞或AR42J细胞（表达丰富的内源性IRE1）8小时或如图所示。然后将细胞在无蛋氨酸/半胱氨酸的培养基中饥饿30分钟，并用100μCi的[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸（Tran35S标签；ICN，Costa Mesa，Calif.）/ml培养60分钟。将细胞清洗两次，然后在添加有或没有GA（1μM）的10%胎牛血清的完全Dulbecco改良Eagle's培养基中进一步培养。在返回完全培养基后的不同时间，裂解细胞，并用抗Flag抗体或抗IRE1抗血清免疫沉淀IRE1蛋白。样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。NIH Image软件使用Macintosh 9500计算机对谱带密度进行量化。
结果
HSP90与IRE1的关联。
将表达Flag-tagg全长IRE1α或缺乏细胞质激酶和核糖核酸酶结构域（ΔIRE1）的IRE1β的质粒转染COS7细胞。24小时后对细胞进行裂解，并使用抗标记抗体对蛋白裂解产物进行免疫沉淀。在SDS-PAGE和电转移到硝化纤维素后，用HSP90抗体探测印迹（图。). HSP90显然与全长IRE1共沉淀，但不与ΔIRE1共沉淀，尽管ΔIRE1的可复制表达程度高于野生型IRE1。通过将ΔIRE1的量的1/10转染为野生型IRE1，近似等于稳态水平（图。，底部面板）。为了排除HSP90与IRE1的关联是转染伪影的可能性，我们从AR42J（一种内质网发育良好的胰腺细胞系）免疫沉淀内源性IRE1α。HSP90很容易与未处理细胞的IRE1共沉淀（图。)而将AR42J细胞短暂暴露于GA（3小时）会破坏IRE1-HSP90的关联（图。)不改变IRE1或HSP90的稳态水平（图。，右侧面板）。我们最近发现了一种化学性质类似的安息香醌类安息香霉素，在这里命名为514，它与HSP90的结合亲和力是伴侣的内质网副产物GRP94的90倍(43). 使用该化合物，我们还观察到IRE1与HSP90的结合被破坏（图。). 最后，我们使用纯化的GST-HSP90蛋白去除HEK293细胞中外源性表达的标记IRE1和AR42J细胞中内源性IRE1（图。). 与体内结合数据一致，GST-HSP90无法降低HEK293细胞中瞬时表达的等量ΔIRE1（图。). 综上所述，这些数据支持这样的假设，即全长IRE1通过IRE1的细胞质域与HSP90相关，而GA结合HSP90破坏了这种关联。
HSP90与IRE1相关，但与胞质结构域缺失的IRE1无关。用IRE1-FLAG或ΔIRE1-FLA质粒转染Cos7细胞，24小时后在TNESV中裂解。未转染的AR42J细胞经处理或用未处理（0道）的GA或其衍生物514（1μM）处理3小时，然后以类似方式裂解细胞。可溶性蛋白（400μg）与3μg抗Flag抗体（A）或IRE1抗体（B）免疫沉淀，复合物在4°C下与蛋白A-Sepharose珠结合2小时。用TNESV将小球洗涤四次，用SDS-10%PAGE将结合蛋白溶解并转移到硝化纤维素膜上。使用抗HSP90或抗IRE抗体进行Western分析。图A显示了瞬时转染野生型IRE1和ΔIRE1的表达水平，图B显示了细胞裂解液中HSP90和IRE1稳态水平，以进行比较。HEK293细胞转染IRE1-FLAG或ΔIREI-FLAG质粒。24小时后，对细胞进行裂解，并在400μl谷胱甘肽-脑葡萄糖4B存在下对每种条件下的1 mg总蛋白进行GST-HSP90结合，该4B先前已被GST-HSP 90（C）饱和。天然IRE1（在AR42J裂解物中）与GST-HSP90或GST单独的结合如面板D所示。
HSP90相关性的破坏与IRE1蛋白的丢失一致。
用全长IRE1或ΔIRE1瞬时转染COS7细胞和表达内源性IRE1的AR42J细胞，用增加浓度的GA处理24小时。用Western blotting监测标记IRE1（COS7 cells）或内源性IRE2（AR42J）蛋白的稳定水平。图中的数据。显示了转染和内源性IRE1的剂量和时间依赖性耗竭，而ΔIRE1仍然对GA完全耐药。因此，IRE1对GA的敏感性与HSP90的结合平行，因为ΔIRE2不与HSP70结合，并且对GA不敏感。这些结果与另一种I型跨膜激酶ErbB2的结果相同(43).
凝胶霉素不稳定IRE1，但不稳定胞质结构域缺失的IRE1。用全长IRE1-FLAG或ΔIRE1-FLA转染Cos7细胞。随着GA浓度的增加，将Cos7细胞（A）或AR42J细胞（表达内源性IRE1）（B）孵育24小时。（C）AR42J电池暴露于1μM GA，时间如图所示。对细胞进行裂解，并使用标记抗体（A）或IRE1抗体（B和C）通过SDS-PAGE和Western blotting分析等量的蛋白质。在B组和C组中，对微管蛋白进行了印迹，以证明蛋白质负载量相等。
GA降低IRE1蛋白的半衰期。
由于GA不影响IRE1 mRNA水平（数据未显示），我们预计其对IRE1蛋白的影响是翻译后的。因此，我们研究了药物对IRE1蛋白半衰期的影响。瞬时转染表达内源性蛋白的全长IRE1和AR42J细胞的COS7细胞被脉冲标记[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸如材料和方法中所述，然后在非放射性完全介质中增加时间。在每种情况下，一组细胞持续暴露于GA，而另一组细胞未经处理。数据表明，在GA存在下，外源表达或内源性IRE1的合成导致半衰期显著缩短的蛋白质（图。). 在COS7细胞中，Flag-IRE1的半衰期从>5h缩短到<1h，而在AR42J细胞中，IRE1α的半衰率从约3h缩短到了<1h。这些结果与GA对其他HSP90客户蛋白的影响一致(26).
GA降低了新合成IRE1的半衰期。瞬时转染的Cos7（A）和未转染的AR42J（B）细胞在转染后12 h用GA（1μM）处理或不处理。在额外的8小时后，用无蛋氨酸/半胱氨酸的培养基替换培养基30分钟，并用100μCi的[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸/ml持续60分钟。在1小时时，将细胞置于完整的非放射性介质中（时间零点），并追踪所示时间。在实验期间，GA仍存在于所有药物处理样品中。用抗Flag（A）或抗IRE1（B）抗体免疫沉淀蛋白质。样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。使用NIH Image软件对扫描胶片的带密度进行量化，以创建所示图形。
苯醌-安塞霉素与GRP94结合可诱导内质网应激反应，而与HSP90结合则最终消除这种反应。
由于GA在数小时内耗尽IRE1蛋白，我们怀疑该药物会干扰ER对应激诱导刺激的转录反应。另一方面，Lawson等人之前已经证明，GA本身会诱导内质网应激反应，尽管与他吡格金或衣霉素等药物不同，GA诱导的应激反应相对来说是短暂的(17). 在目前的实验中，我们首先证实，在暴露于GA或514的细胞中12小时，IRE1蛋白水平显著降低（图。). 同时，暴露于任一HSP90抑制剂12小时，在用膜霉素（TM）激发4小时后，消除了BiP蛋白合成的诱导（图。). 对TM反应的抑制并不是由于对GA或514暴露12小时的细胞中一般蛋白质合成的抑制。因此，未经处理的细胞短暂脉冲加入放射性标记的蛋氨酸1.77×106cpm/mg蛋白质（三氯乙酸可捕集计数），而细胞暴露于GA或514中12小时，则包含1.78×106和1.87×106cpm/mg蛋白质。与长期暴露于HSP90抑制剂后获得的结果相反，GA自身4h暴露产生了强大的BiP反应，相当于TM引起的反应（图。). 然而，514的4h激发仅导致可忽略的BiP响应（图。). 因此，尽管GA和514在长时间暴露后都阻断了应激反应，但在短暂暴露后，只有GA能够促进应激反应。
GA和514是一种GA衍生物，与HSP90的亲和力比GRP94的亲和力高2 log，两者在长时间接触后都抑制UPR，但只有GA在短时间接触后诱导UPR。（A） 将AR42J细胞（表达高水平IRE1）暴露于GA（1μM）或514（1或10μM）12小时。通过蛋白质印迹在全细胞裂解物中检测IRE1和微管蛋白。（B） 在添加应力诱导剂TM之前，用GA衍生物514或GA预处理AR42J细胞12小时（额外4小时）。BiP蛋白检测方法为[35S] 蛋氨酸脉冲标记30min，Western blotting检测微管蛋白。（C） 将AR42J细胞暴露于TM、GA或514中4 h，并进行BiP和微管蛋白检测，如对A组所做的一样。（D）Cos7细胞转染pCGN-ATF6，这是一种含有HA表位标签的ATF6表达质粒。转染后20小时，细胞未经处理（第1和第7道），用TM处理4小时（第2道），再用GA预处理12小时，然后再用TM再处理4个小时（第3道），再用514预处理12 h，再用TM处理4 h（第4道），只用GA处理12 h（第5道），或只用514处理12小时（第6道）。为了更好地检测内质网应激诱导的ATF6裂解产物，我们在暴露于内质网胁迫剂期间用蛋白酶体抑制剂PS-341（0.5μM）处理所有细胞。在通道1、5、6和7中，在裂解前的最后4小时培养中添加PS-341。细胞裂解后，通过SDS-PAGE分离等量的可溶性蛋白，并使用抗HA抗体通过蛋白质印迹分析应激诱导的ATF6切割。
GA抑制内质网应激诱导的ATF6裂解和活化。
IRE1不是普遍定期审议转录部分的唯一调解人。实际上，在IRE1中，BiP对内质网应激的反应基本上保持不变−/−单元格(19). 因此，长时间抑制HSP90对内质网应激介导的BiP诱导的显著抑制需要进一步解释。ATF6是一种内质网跨膜定位转录因子，也与内质网应激的转录反应有关，因为它的细胞质域可以在从膜上分裂后激活BiP转录(12,20,41,45). 由于ATF6的切割对其转录活性是必要的，我们用ATF6表达质粒转染细胞，20小时后我们测定了GA和514对TM引起的ATF6切割的影响。这些培养中包括蛋白酶体抑制剂，因为ATF6的裂解片段非常不稳定，但可以受到蛋白酶体抑制的保护(44). 尽管外源性ATF6过度表达可导致自发分裂，但我们成功地测定了转染质粒的数量以避免这个问题（图。，车道1和7）。而4小时时的TM导致了ATF6容易检测到的解理（图。比较通道1和通道2），预先暴露于两种HSP90抑制剂12小时后，TM激发后ATF6的分裂减少（图。，将车道2与车道3和4进行比较）。仅HSP90抑制剂引起的ATF6裂解最小（图。，车道5和6）。因此，预防应激诱导的ATF6切割是HSP90抑制影响UPR转录臂的额外手段。
GA促进BiP与IRE1的分离，但其他应激源不会干扰HSP90-IRE1的相互作用。
诱导内质网应激的药物已被证明破坏内质网伴侣BiP与IRE1管腔结构域的联系(2,28). 我们希望确定GA是否具有类似的活性，同时确定内质网应激是否通常导致HSP90从IRE1的细胞质域分离。因此，我们将AR42J细胞暴露于DTT 30分钟、TM 2小时或GA 1或2小时。内源性IRE1免疫沉淀后，通过Western blotting检测BiP的共沉淀。我们发现，在所示时间内，这三种试剂中的每一种都有效地破坏了BiP-IRE1的关联（图。). 相反，与GA不同，TM和DTT都没有将HSP90从IRE1中分离出来（图。). 抗FLAG抗体不能与HSP90共免疫沉淀，从而证实了HSP90与抗IRE抗体共免疫沉淀的特异性（图。、底板和图。). 因此，虽然GA模拟了其他内质网应激因子破坏BiP/IRE1复合物的能力，但HSP90-IRE1结合的破坏既不是内质网胁迫反应的一般特征，也不是其前提条件。
内质网应激源，包括GA，使IRE1与BiP分离，但不使HSP90与IRE1分离。（A） 用GA（2μM）处理AR42J细胞1或2 h，用TM（2.5μg/ml）处理2 h，或用DTT（10 mM）处理30 min。裂解后，用2μg IRE1抗体免疫沉淀400μg可溶性蛋白，并将复合物结合在蛋白A-Sepharose珠上。结合蛋白通过SDS-7.5%PAGE溶解并转移到硝化纤维素膜上。用抗IRE1和抗BiP抗体进行Western分析。（B） 在类似的实验中，在TM或DTT处理的细胞中，通过HSP90 Western blot检测抗IRE1免疫沉淀后的HSP90共沉淀。HSP90与IRE1共沉淀的特异性表现为抗FLAG免疫沉淀物中缺乏HSP90信号。
ER跨膜激酶PERK也与HSP90相关，并被GA破坏。
接下来我们研究了另一种内质网应激激活激酶PERK是否也是HSP90客户蛋白。如图所示。B，HSP90在AR42J细胞中与PERK共沉淀。短暂接触GA会破坏这种联系，长期接触GA会导致PERK蛋白水平下降（由于蛋白质半衰期缩短；数据未显示）。
ER跨膜激酶PERK与HSP90相关，但在功能上对GA的敏感性低于IRE1。（A） 用GA（1μM）处理AR42J细胞达到指定的时间，细胞被裂解，蛋白质被SDS-10%PAGE溶解并转移到硝化纤维膜上。用抗PERK抗体对PERK稳态水平进行Western分析。对Tubulin进行印迹，以证明蛋白质负载量相等。（B） AR42J细胞未经处理或用GA处理（1μM处理4 h），然后裂解，用2μg抗PERK抗体免疫沉淀400μg可溶性蛋白。抗体复合物结合在蛋白A-琼脂糖珠上，洗涤、洗脱并用SDS-10%PAGE溶解。转移到硝化纤维素膜后，对共沉淀HSP90进行Western分析。免疫沉淀物也被印迹用于PERK，以证明其在存在和不存在GA时的等效下拉。（C）AR42J细胞用GA（1μM）处理指定时间。然后用100μCi脉冲标记细胞[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸/ml，30min后溶解。通过SDS-PAGE和放射自显影术分析等量的总可溶性蛋白。（D） 用thapsigargin（Th；0.5μM）处理AR42J细胞0.5小时（填充菱形），用GA（1μM）处理0.5、1、2或24小时（填充圆形），或用GA和Th的组合（填充正方形和填充三角形；在指定的时间内加入GA，然后加入Th 30分钟）。然后对细胞进行脉冲标记，并按照C组进行处理。通过SDS-PAGE和放射自显影术分析等量的细胞总蛋白。
GA不能阻止thapsigargin诱导的翻译抑制。
PERK激活导致平移衰减(11,34). 为了确定PERK功能是否需要PERK-HSP90关联，我们测试了GA是否可以阻断应激诱导的翻译抑制。使用放射性蛋氨酸脉冲测量平移，我们观察到GA本身引起了明显但短暂的平移衰减（图。). 然而，细胞预先暴露于GA 1或24小时并不能阻止在暴露于thapsigargin 30分钟后观察到的平移衰减（图。). 这些数据表明，尽管当PERK与HSP90分离时，其稳定性降低，导致其稳态水平缓慢下降，但剩余PERK蛋白的活性足以抑制内质网应激反应激活期间的蛋白质合成。
讨论
我们的数据表明HSP90参与了UPR的转录臂。HSP90与外源性引入和内源性表达的IRE1α相关，HSP90抑制剂GA促进伴侣蛋白与IRE1的分离，同时显著降低激酶的半衰期。由于IRE1缺乏细胞溶质结构域，既不与HSP90相关，也不对GA敏感，因此药物敏感性可能依赖于与IRE1激酶结构域的伴侣相互作用，就像其他HSP90客户跨膜激酶一样。
根据IRE1α稳定性对HSP90结合的依赖性，细胞长期暴露于GA可抑制内质网应激引起的BiP诱导。然而，与Lawson等人的研究结果一致，并对其进行了扩展(17)短时间接触GA模拟了其他内质网应激源的活性，因为它刺激BiP蛋白合成并促进IRE1α从BiP中分离。然而，GA诱导的HSP90与IRE1的解离并不是IRE1激活的先决条件，因为其他应激因子，包括DTT和Tm，与GA不一样。
GA如何诱导和抑制内质网应激依赖性转录，取决于暴露时间的长短？我们目前的数据为GA诱导的UPR的短暂性提供了解释(17). GA与HSP90及其ER paralog GRP94具有相似的亲和力(6,43). 如果GA与GRP94的结合干扰了这种伴侣在蛋白质成熟中的作用，从而增加了BiP与传递ER的“停滞”的不完全折叠蛋白质结合的需求，那么从IRE1管腔结构域释放BiP的结果将诱导ER应激反应(2). 事实上，据报道，GA会干扰至少两种蛋白质的成熟和分泌，即胆盐依赖性脂肪酶(27)和免疫球蛋白lambda轻链(1)这两种蛋白在通过内质网的过程中都与GRP94相互作用。第三种蛋白质，即toll受体，在其通过内质网上的成熟过程中也依赖GRP94(30); 然而，GA对toll受体的可能影响尚未被研究。同时，GA对IRE1的有害影响最终会干扰细胞对内质网应激的转录反应。GA对HSP90和GRP94的联合但相反的作用可以解释该药物诱导的短暂应激反应。GA导数514获得的数据支持这一提议的机制。与GA不同，514通过一个K（K）d日（GRP94）90μM，相比之下K（K）d日（热休克蛋白90）HSP90为1μM(43). 由于514被证明是短时间接触后BiP合成的不良诱导剂，但长期治疗后BiP对TM反应的有效抑制剂，因此数据符合以下假设：前一个事件取决于药物与GRP94的结合，而后一个过程需要药物与HSP90的结合。
假设BiP对从IRE1获得的细胞中的内质网应激作出反应−/−在小鼠中，GA显著削弱BiP诱导的能力不太可能仅仅是由于其对IRE1的影响。转录因子ATF6可能代表哺乳动物细胞中UPR转录臂的分支。来自几个实验室的最新数据表明，IRE和ATF6介导的信号转导途径能够最大限度地诱导UPR转录反应(三,7,19,46). 作为对内质网应激的反应，ATF6从内质网迁移到高尔基体，在那里它从90kDa的膜相关形式分裂成大约50kDa的可溶性活性片段(7)迁移到细胞核并激活转录。尽管我们无法检测到GA或514诱导的转染ATF6的蛋白水解裂解，但用两种HSP90抑制剂预处理显著降低了TM引起ATF6裂解的能力。因此，通过证明GA可以干扰UPR的两个转录臂（IRE1和ATF6），这些数据解释了GA如何显著削弱BiP对内质网应激的反应。然而，使这些发现的解释复杂化的是，GA并没有影响未处理ATF6的稳态水平，我们也没有观察到HSP90与任何形式的ATF6相关（数据未显示）。此外，据报道BiP与ATF6的管腔结构域结合，就像与IRE1和PERK结合一样，BiP结合位点的去除导致ATF6向高尔基体的结构性移位，在高尔基体中被裂解(33). 尽管基于这一范式，我们预计GA会激活ATF6，但GA对ATF6的作用可能是间接的，药物可能会干扰ATF6裂解途径的其他部位，以抑制转录因子的加工。目前正在探索的一种可能性是，GA对应激诱导的ATF6激活的抑制依赖于对一个或多个上游HSP90客户激酶的药物活性，而ATF6的磷酸化是其裂解（或从ER转运到高尔基体）的先决条件。事实上，p38丝裂原活化蛋白激酶对ATF6的磷酸化已被证明在心肌细胞的细胞环境中调节其转录活性(37). p38激酶是否被内质网应激激活并对GA敏感，ATF6磷酸化是否是其向高尔基体转运或蛋白水解裂解的必要信号，目前正在研究中。
PERK是内质网应激诱导的翻译抑制的介质，是哺乳动物细胞中发现的第二种内质网跨膜激酶。我们在这里显示，PERK也与HSP90相关，GA破坏了这种关联，在数小时内缓慢降低蛋白质的稳态水平。然而，与IRE1α不同，PERK活性对HSP90的依赖性较小。因此，即使长期接触GA，尽管它显著降低了PERK蛋白的稳态水平，也不能阻止内质网应激源刺激PERK自身磷酸化（数据未显示）或PERK介导的翻译抑制。这些数据表明，PERK水平超过了其活性显现所需的水平。鉴于PERK和IRE管腔结构域的明显互换性，PERK对GA抑制HSP90和GRP94的敏感性不足有些令人惊讶(2). 此外，与PERK、酵母中的Gcn2和哺乳动物中的PKR相关的两种细胞溶质激酶都依赖于HSP90的活性和稳定性(9,10). 进一步研究AR42J和其他细胞类型中PERK-HSP90和PERK-BiP相互作用的性质可能最终解释这些差异。
我们的数据表明，一种有趣的可能性是，ER应力的所有近端传感器对传入信号的敏感性并不相同。GA对GRP94功能的破坏可能只会导致内质网蛋白质负荷的有限增加，因此可能被认为是一种轻微的应激，其刺激强度不足以保证关闭一般蛋白质翻译或激活ATF6，但足以适度刺激内质网伴侣的转录以进行补偿。因此，IRE1α信号通路可能代表细胞对低水平内质网应激的反应。在这个模型中，只有当应激时间延长或严重到需要ER伴侣水平适度增加以上时，PERK和/或ATF6才会激活。最近由几个小组提出的这种分级响应模型(19,46)这将有助于解释为什么与酵母相比，哺乳动物细胞中UPR的调节变得如此复杂。
总之，我们的数据表明HSP90是UPR转录臂的重要组成部分，就像伴侣在细胞对细胞质应激的反应中起着重要作用一样。然而，虽然与错误折叠或未折叠蛋白的非特异性结合被认为是HSP90在细胞质应激期间的主要功能，但其在内质网应激反应的传播中的作用取决于HSP90与至少一种内质网驻留跨膜激酶IRE1α的特异性结合。
