《维罗尔杂志》。2006年3月；80(5): 2267–2279.
副粘病毒载体疫苗单次鼻内接种保护豚鼠免受致命剂量埃博拉病毒挑战
,1,* ,1 ,2 ,2 ,2 ,1 ,1和2
亚历山大·巴克利耶夫
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
杨丽娟
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
谢里夫·扎基
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
Wun-Ju Shieh先生
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
皮埃尔·罗林
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
布莱恩·墨菲
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
彼得·柯林斯
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
安东尼·桑切斯
马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
美国国家过敏和传染病研究所，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，1佐治亚州亚特兰大国家传染病中心、疾病控制和预防中心2
*通讯作者。通讯地址：NIH，NIAID，LID，50 South Drive，Rm。马里兰州贝塞斯达6505号，邮编：20892-8007。电话：（301）594-1854。传真：（301）496-8312。电子邮件：vog.hin.diain@维耶库巴. 收稿日期：2005年8月23日；2005年12月9日接受。
摘要
为了确定鼻内接种副粘病毒载体疫苗是否能诱导对埃博拉病毒（EV）的保护性免疫，对重组人副流感病毒3型（HPIV3）进行了修饰，以单独表达EV结构糖蛋白（GP）（HPIV3/EboGP）或与EV核蛋白（NP）一起表达（HPIV2/EboGP-NP）。通过这些重组病毒表达EV-GP，可将其有效地并入病毒颗粒中，并增加Vero细胞的细胞病变效应。EV抗体中和HPIV3/EboGP的效率是HPIV3抗体的100倍。单次鼻内接种10只豚鼠5.3HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP的PFU没有明显的疾病迹象，但对EV蛋白产生了强烈的体液反应。当这些动物被腹腔注射10三EV的PFU，没有疾病的外部迹象，血液中没有病毒血症或可检测的EV抗原，脾脏、肝脏和肺部也没有感染的证据。相反，所有对照动物在挑战后死亡或发展为严重的EV疾病。单剂量疫苗获得的高效免疫表明，以重组呼吸道病毒为基础的活载体疫苗进行鼻内免疫可能是诱导对严重全身感染（如出血热制剂引起的感染）产生保护性反应的有利方法。
埃博拉病毒（EV）是已知的最具致病性的病毒之一；它和另一种高致病性病毒马尔堡病毒构成了这个家族丝状病毒科（订单单核糖核酸). 它在人类中引起严重的出血热，死亡率高达88%，并且缺乏批准的疫苗或抗病毒治疗。病毒很容易通过接触粘膜表面或伤口的体液从急性感染的人和动物中传播，安全处理感染病毒需要生物安全级别4（BSL-4）控制(19,28,38). 继1976年第一次有记录的暴发之后，扎伊尔和苏丹EV物种在中非引发了零星的人类疾病暴发，但在过去十年中，发病率增加到每隔几年一次(33)也涉及濒危类人猿种群(37). 这些疫情的来源尚不清楚，因为丝状病毒的生态（自然宿主）仍然是一个谜(33).
严重EV病的特征是病毒在全身复制，特别是在脾脏和肝脏，导致高病毒载量和显著的抗原血症(19,28,38). 病毒基因的表达通过阻断干扰素途径导致免疫逃避，促进了这种广泛复制(三)，诱导淋巴细胞凋亡（间接）(1,2,17)以及破坏抗原呈递细胞的成熟(5,6,18,29). EV基因组是一个长约19kb的负极性单链RNA，基因序列为3′-NP-VP35（或P）-VP40（或M）-GP-VP30-VP24-L-5′(40). 每个基因都转录成一个单顺反子mRNA(39). 主要表面糖蛋白（GP）合成为全长676-氨基酸I型膜锚定蛋白和C末端截短的364-氨基酸分泌型（sGP）。全长GP由GP mRNA表达，GP mRNA通过共转录编辑进行修改，包括在开放阅读框（ORF）的中间特定序列基序插入一个a残基，而sGP由未经编辑的转录物编码(41,50). 全长GP在ORF的497到501位的一个多基氨基酸基序处经历翻译后蛋白水解裂解，形成两个二硫键片段GP1和GP2(52). GP的表达与细胞培养中增强的细胞病变效应（CPE）有关，并被认为在EV感染的急性期引起血管细胞毒性(46,55). 然而，另一项涉及食蟹猴的研究表明，EV感染不会广泛破坏血管内皮(22).
开发预防EV疾病的保护性疫苗的尝试取得了有限的成功（在参考文献中进行了综述14和20). 一些重组候选疫苗在啮齿类动物模型中显示出了良好的效果，但在非人类灵长类动物中测试时未能提供足够的保护，因为灵长类对EV感染极为敏感，因此提出了更严格的模型。然而，最近发现两种疫苗在灵长类动物模型中有效：一种疫苗涉及表达EV-GP或GP以及主要核蛋白（NP）的复制缺陷型腺病毒，另一种疫苗则涉及表达GP的复制能力强的水泡性口炎病毒，以代替其自身的G糖蛋白(24,45,47). 肌肉注射这些病毒可以保护食蟹猴免受EV的后续攻击。
针对EV和其他出血热的粘膜免疫尚未探索，但通过呼吸道的免疫已被证明是诱导针对呼吸道病毒感染的局部和系统免疫反应的高效手段。一种鼻内流感减毒活疫苗最近已上市（参考文献综述25)以及几种抗人呼吸道合胞病毒（RSV）和人副流感病毒（HPIV）的减毒活疫苗目前正在临床试验中(30). 在EV病例中，呼吸道似乎是EV感染的可能入口(23,42)在这种情况下，直接刺激局部免疫非常重要。在本研究中，使用HPIV血清型3（HPIV3）作为EV-GP和NP表达载体的豚鼠模型，评估鼻黏膜免疫对肠外给药EV激发的疗效。该报告表明，这种病毒载体的单一鼻腔给药能够诱导高效免疫，表明副粘病毒有潜力作为人类接种疫苗的载体。虽然常见的人类病原体（如HPIV3）可能不会在成人人群中作为载体有效，因为针对该载体的抗体普遍存在，但其他非人类副粘病毒正在被开发为人类使用的载体(8).
材料和方法
细胞、病毒和动物。
使用猴肾LLC-MK2、Vero和Vero E6细胞（美国型培养物收集组织[ATCC]，弗吉尼亚州马纳萨斯）生长和定量HPIV3株JS及其衍生物（HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP），并使用Vero E7细胞培养EV。豚鼠适应EV（扎伊尔种，1976年马英加株）用于挑战免疫动物(12). 这种病毒对豚鼠具有很强的毒性。在之前的一项研究中，发现1种PFU含有40050%的致死剂量，所有感染都是致命的（未发表的数据）。所有涉及感染性EV颗粒的实验均在佐治亚州亚特兰大市疾控中心的BSL-4控制下进行。大多数涉及感染性HPIV3 EV蛋白的实验均是在马里兰州贝塞斯达州NIH的BSL-3控制下进行的，或在佐治亚州亚特兰大疾控中心进行的BSL-4.控制下进行，当观察到表达EV蛋白的HPIV3不会导致豚鼠生病时，随后在BSL-2使用面罩并在加强感染控制的条件下进行了有限数量的体外实验。这些指南由疾病预防控制中心和国家卫生研究院的生物安全委员会批准。
cDNA的构建和重组病毒的生产。
在一组HPIV3基因起始和基因结束信号的控制下，通过在P和M基因之间插入EV-GP ORF来修改编码HPIV3抗原组的cDNA（图。). 具体来说，通过PCR从克隆的cDNA中扩增出一个cDNA，该cDNA包含扎伊尔物种Mayinga株EV-GP ORF的全长编辑版本。正向引物是GTATCAT科科斯群岛自动液位计GCGTTACAGGAATT公司（ORF的开头有下划线，NcoI位点斜体化），反向引物是TACACTTAAGC公司TT公司AAAAGACAAATTCATAT公司（ORF的末尾和终止密码子用下划线表示，HindIII位点用斜体表示）。GP-PCR产物用NcoI和HindIII消化，并克隆到质粒pUC（GE/GS）的NcoI-HindIII窗口中P-M公司(44). 这将GP ORF置于HPIV3基因连接副本的下游（包含一组HPIV3的基因末端、基因间和基因启动序列），两侧为AflII位点（图。). 通过几个克隆步骤将AflII片段转移到全长HPIV3抗原cDNA中（图。)产生质粒pHPIV3/EboGP。在第二个构建中，pHPIV3/EboGP通过在HN和L基因之间额外插入EV NP ORF，在一组HPIV3基因开始和基因结束信号的控制下进行修改（图。). 具体来说，使用正向引物TACACTT从cDNA克隆中通过PCR扩增出包含相同EV菌株NP ORF的cDNAACGCGT公司G公司ATGGATTCTCGTCCTCAGAA公司（ORF的开头用下划线表示，MluI位点用斜体表示）和反向引物TACACTTTTCGAA公司G公司甲状腺激素（ORF的末尾和终止密码子用下划线表示，BstBI位点用斜体表示）。PCR产物用MluI和BstBI消化，并克隆到质粒pHPIV3（XhoI-SphI）StuI的MluI-BstBI窗口中(43). 这将NP ORF置于HPIV3基因连接副本的下游，两侧为StuI位点。通过几个克隆步骤将StuI片段转移到全长HPIV3抗原cDNA中（图。)为了获得质粒pHPIV3/EboGP-NP。两个构建物中的GP和NP插入物都设计为符合六的规则，并将插入的基因定位为在其各自六聚体的第一个位置适当启动，而不会干扰其余基因的起始位置(26).
表达EV GP和NP的重组HPIV3的基因组结构。（A）HPIV3载体的基因组示意图，插入位点用箭头表示（顶部），HPIV3向量包含编码EV GP（中间）的转录盒或编码GP和NP的两个单独盒（底部）。每个结构的基因组长度（以核苷酸表示）显示在右侧。（B） HPIV3基因组中EV-GP（顶部）和NP（底部）ORF侧翼的序列，以抗原或阳性意义显示。显示了GP和NP嵌件的边界。HPIV3特异性基因起始和基因终止转录信号被装箱，三核苷酸长的基因间序列被命名为IG，GP和NP ORF的起始和终止密码子用黑体表示，每个ORF的其余部分用三个点表示。用于克隆的限制性内切核酸酶位点显示在其下划线序列下方。
通过将各自的抗原质粒转染到组成性表达T7聚合酶的BHK-21细胞中，产生了两种重组病毒，即HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP(7)以及N、P和L支持质粒(13). 病毒在LLC-MK2细胞中通过两个传代进行繁殖。包含GP和NP插入物的基因组区域通过逆转录PCR扩增，并通过对未连接的PCR产物进行测序分析。如结果所述，发现第一组回收的病毒在构成GP ORF编辑位点一部分的八个a残基中存在核苷酸替换或缺失（图。). 因此，对GP cDNA进行了修改，以便在不改变氨基酸编码的情况下，将本次试验中的两个A残基改为G残基。这是通过使用QuikChange II试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）、正向引物GGCCTGGGAAACTAA对包含EV GP ORF全长编辑版本的cDNA进行定点突变来实现的G公司AA公司G公司AACCTCACTAGAAAAATTCG和反向引物CGAATTTTTCTAGTGAGGTTCTT公司CTTAGTTTCCCAGAGGCC（突变核苷酸残基下划线）符合制造商的建议。使用修改后的GP cDNA按照上述相同的策略重组HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP病毒。在使用这些进一步修饰的质粒回收的病毒中，未在GP或NP ORF中观察到突变。
在恢复的HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP病毒的EV-GP ORF编辑位点检测到偶然突变。顶行显示了EV-GP mRNA未编辑版本中部分编辑位点的阳性序列，其中显示了编码氨基酸（a.a.）及其在GP中的序列位置，并在同寡聚体a区下划线。下一行显示了包含八个a残基的mRNA的编辑版本；这是最初插入HPIV3载体但被证明不稳定的版本。接下来的四行显示了从含有核苷酸替换或核苷酸缺失的恢复病毒中提取的序列，这些核苷酸替换或缺失破坏了八个a残基的序列。底部的序列是经过编辑的mRNA的工程突变版本，包含两个A→G替换，中断八个A残基的运行，而不影响氨基酸编码；该版本用于制造本研究中使用的第二组HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP病毒。
病毒蛋白分析。
LLC-MK2细胞以每细胞0.2 PFU的输入感染多重性（MOI）感染HPIV3、HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP。在感染后24小时，制备裂解物以分析细胞相关蛋白。为了分析病毒相关蛋白，如前所述分离病毒颗粒(9)从感染HPIV3或HPIV3/EboGP的细胞上清液中提取。作为对照，来自未感染细胞的培养基被并行处理。简言之，通过低速离心澄清培养基，将其分层到30%至60%（wt/vol）的蔗糖梯度上，并以130000×克在4°C下持续90分钟，分离出产生的病毒颗粒带。如图图例所示，在变性和还原条件下，在4至12%或10%双三丙烯酰胺梯度凝胶（NuPage蛋白质电泳系统；Invitrogen，Mountain View，CA）或7.5%三丙烯酰胺凝胶中分离来自细胞裂解液或纯化病毒制剂的蛋白质，并根据制造商的建议，通过Western blotting（Western Breeze免疫检测试剂盒；Invitrogen）或银染色（SilverQuest试剂盒；Initrogen.）进行分析。魔法XP标记蛋白（Invitrogen）作为分子量标记并行电泳。使用分子动力学个人密度计SI对蛋白质条带进行密度计扫描，并使用ImageQuant软件（均来自加利福尼亚州桑尼维尔市的分子动力学）分析数据。
病毒中和滴定。
HPIV3或HPIV3/EboGP在含有10%（vol/vol）商业豚鼠补体制剂的Opti-MEM培养基（Invitrogen）中稀释（Cambrex Corporation，East Rutherford，New Jersey）。复制小份，每份包含10份5.2将病毒的PFU与等体积的1:10或1:40稀释的兔超免疫血清制剂混合，该超免疫血清是针对纯化的HPIV3颗粒或灭活的纯化EV病毒制备的，或与两种血清混合。将混合物在37°C下培养1 h，然后在LLC-MK2和Vero细胞中进行斑块滴定，以通过在免疫染色后计数斑块来量化残余感染病毒。为此，将细胞单层在冷的80%甲醇中固定过夜，并将斑块依次与1:2000的兔抗HPIV3抗体（如上所述）、1:2000的碱性磷酸酶缀合的小鼠抗兔抗体孵育，和碱性磷酸酶底物（均来自Kirkegaard和Perry Laboratories，Gaithersburg，MD）。
豚鼠免疫。
从马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯·里弗实验室获得了三个月大的哈特利品系豚鼠，并确认其HPIV3血清学阴性。采集血液，9或10组动物经鼻内感染105.3100μl Leibowitz l-15培养基（Invitrogen）中的重组病毒PFU（每个鼻孔吸入50μl）。28天后，采集了血液，并对动物进行了10次腹腔注射三豚鼠适应性EV的PFU在无菌Hanks缓冲盐溶液中稀释。激发七天后，即疾病的高峰期，采集血液，每组四五只动物进行安乐死，并分离肺、肝和脾进行组织学分析，如下所述。在剩下的动物中，将患有EV疾病的动物处死或在死亡后不久采集，并采集血液和组织进行组织学分析。在挑战后22天处死所有剩余动物，并采集血液和组织进行组织学分析。在功效研究的免疫和激发阶段，观察动物是否有疾病迹象，并每隔1天或2天称重一次，以评估其健康状况。所有程序均按照CDC机构动物护理和使用委员会批准的方案和指南进行。
体液反应定量。
用豚鼠红细胞血凝抑制（HAI）试验测定动物体内HPIV3特异性血清抗体滴度(49). 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定EV特异性免疫球蛋白G滴度，其中动物血清稀释液与固定EV蛋白反应。具体而言，使用钴-60高能γ辐射器（加拿大安大略省渥太华市MDS Nordion），通过4毫拉德的γ辐射使干冰上浓缩EV颗粒的制备失活，并通过在Tris缓冲盐水中的20%（wt/vol）蔗糖溶液中造粒进行纯化。γ射线照射步骤遵循CDC标准操作程序，该程序最初通过在Vero细胞上滴定进行鉴定。该制剂用吐温20（西格玛，密苏里州圣路易斯）处理，在磷酸盐缓冲盐水中稀释，并用于涂覆96个U底聚氯乙烯板（Falcon 353911；Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖）。使用与辣根过氧化物酶和ABTS（2,2′-叠氮（3-乙基苯并噻唑啉磺酸）过氧化物底物系统（KPL，盖瑟斯堡，马里兰州）结合的山羊抗豚鼠免疫球蛋白G多克隆血清检测特异性抗体结合。使用帝肯荧光光谱分光光度计（瑞士帝肯贸易公司）测量405 nm处的吸光度。
组织学分析。
组织样本经免疫组织化学（IHC）染色进行抗原检测(56). 简单地说，脾、肝和肺组织的样品在10%福尔马林缓冲液中固定5天。然后将湿冰上的组织暴露于如上所述的γ射线照射，以灭活感染性，并进行石蜡包埋、切片和IHC染色。特异性EV抗原染色是通过按顺序用以下试剂处理组织切片来完成的：（i）用灭活的纯化EV病毒超免疫家兔产生的抗EV血清，（ii）生物素化小鼠抗兔抗体，（iii）链霉亲和素结合碱性磷酸酶，以及（iv）萘酚固红底物（试剂ii至iv是来自加利福尼亚州卡彭特里亚Dako公司的LSAB试剂盒的成分）。
电子显微镜。
使用感染重组HPIV3或EV的Vero E6细胞培养物中的病毒颗粒生成阴性染色图像。将Formvar碳涂层的镍格栅（300目）漂浮在组织培养液滴上10分钟，并用pH 6.8的2%钨酸甲胺对吸附的颗粒进行染色（Nanoporobes，Yaphank，NY）。使用FEI Tecnai 12 BioTwin透射电子显微镜（FEI，Hillsboro，OR）在100至120 kV的电压下对染色病毒进行可视化，并对图像进行数字记录。
结果
HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP的施工。
通过在P和M基因之间插入包含EV-GP ORF的转录盒，在HPIV3转录信号的控制下，利用反向遗传学修改HPIV3，从而产生HPIV3/EboGP（图。). 此外，第二个版本还包含一个编码EV-NP的转录盒，插入HN和L基因之间，从而产生HPIV3/EboGP-NP（图。). 为了确认插入基因的序列，分离病毒RNA，并通过逆转录PCR扩增包含插入物的基因组区域并测序。令人惊讶的是，我们在每一个恢复的病毒的GP ORF编辑位点中都发现了突变。具体而言，三种独立回收的制剂，分别为HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP，在构成编辑位点一部分的八个A残基序列中含有突变（图。). 这些突变涉及单核苷酸替换，在每种情况下，都会导致氨基酸编码的改变或单核苷酸的缺失，从而导致未经编辑的ORF编码sGP（图。). 这种序列不稳定可能是HPIV3聚合酶异常复制该同聚体序列的结果；值得注意的是，HPIV3基因组中不存在大于7个核苷酸的均聚物束。在任何回收病毒的EV GP基因插入物或EV NP基因插入物的其他地方都没有发现突变。
由于氨基酸编码的变化可能会对编码GP的免疫原性产生不利影响，我们使用GP cDNA的一个版本制作了第二组HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP NP病毒，其中通过引入两个沉默的a→G取代来修饰八个a残基的序列（图。). 对这组回收病毒的序列分析表明，GP或NP基因插入没有突变。
细胞相关EV-GP和NP的表达以及GP与病毒颗粒的结合。
用重组病毒感染LLC-MK2细胞，24小时后采集细胞进行Western blot分析，以检测细胞相关EV-GP和NP的表达（图。). 在感染HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP的细胞中，EV-GP被鉴定为一个宽的分散带，电泳迁移率约为100至160 kDa（图。). 这个大小范围将包括先前描述的GP的细胞相关形式：110-kDa内质网特异性形式、160-kDa-Glgi特异性形式和140-kDaGP1亚单位(52). 在感染HPIV3/EboGP-NP的细胞中，鉴定出一种约90 kDa的蛋白质，对应于EV-NP（图。). 载体表达的GP1和NP蛋白与EV病毒颗粒中的对应物结合（见图。).
重组载体表达的细胞相关EV-GP和NP的Western blot分析。用重组病毒感染LLC-MK2细胞，24 h后制备总细胞裂解物，在变性和还原条件下，在4~12%双三元丙烯酰胺梯度凝胶上电泳分离，并进行Western blot分析。用兔抗EV抗体（A）、豚鼠抗NP抗体（B）和鼠抗肌动蛋白单克隆抗体作为负荷对照（C）分析复制印迹。车道：1、分子量标记；2、HPIV3；3、HPIV3/EboGP；4、HPIV3/EboGP-NP；模拟感染。标记蛋白的分子量（单位为千道尔顿）显示在左侧边缘，EV GP1（A）和NP（B）的位置用箭头表示。
初始免疫后豚鼠血清抗体的特异性。以下样品在三个7.5%重复的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离：来自未感染细胞的模拟纯化病毒（第1道）、纯化的HPIV3（第2道）、精制的HPIV3/EboGP（第3道）、净化的HPIV3/4-P-NP（第4道）和纯化的EV（第5道）。一个复制凝胶用考马斯蓝（A）染色，另两个用HPIV3（B）或HPIV3/EboGP-NP（C）免疫后第28天采集的具有代表性的豚鼠个体抗血清进行Western blot分析。在面板A和C中，EV GP1和NP的位置分别由星星和圆圈表示。面板A第5车道中GP1的检测不良可能反映了糖蛋白与考马斯染色的低反应性，因为碳水化合物侧链密度高。面板C的车道4中缺少NP，这表明EV NP未纳入HPIV3矢量粒子。
已报道了几个将外源病毒跨膜蛋白并入负链病毒载体包膜的实例(36). 为了研究GP是否被掺入HPIV3载体的病毒粒子中，我们通过在不连续的蔗糖梯度上显带来纯化HPIV3和HPIV3/EboGP病毒粒子，并用抗GP的抗体对其进行蛋白质印迹分析。如图所示。在HPIV3/EboGP的制剂中检测到GP1和GP2，如预期的那样，在HPIV3制剂中不存在。为了评估病毒制剂中EV GP1的丰度，我们将其置于第二个凝胶上进行电泳，并通过银染色进行分析（图。). 尽管EV GP1不如主要HPIV3结构蛋白磷酸蛋白（P）、血凝素-神经氨酸酶（HN）、N和F1丰富，但它显然被视为一个附加带。凝胶的密度分析表明，EV-GP带的含量约为HPIV3 HN蛋白的13%。此外，这一比较表明，载体颗粒中EV-GP的存在对HPIV3蛋白的含量没有任何明显影响，这已通过密度计分析得到证实（未显示）。
将EV GP1和GP2并入重组病毒颗粒。纯化的HPIV3和HPIV3/EboGP通过不连续蔗糖梯度沉淀制备，在变性和还原条件下，在4~12%（顶面板A和B）或10%（底面板A）双三元丙烯酰胺梯度凝胶上通过电泳分离，并使用针对灭活纯化EV病毒培养的豚鼠抗GP抗体（顶面板A）或兔超免疫血清（底面板A）进行Western blot分析。通过银应变（B）分析含有相同样品阵列的第二凝胶。泳道：1，分子量标记；2、HPIV3；3、HPIV3/EboGP。标记蛋白的分子量（单位为千道尔顿）显示在左侧边缘，EV GP1、GP2和主要HPIV3蛋白的位置显示在右侧边缘。
我们还通过使用阴性染色的电子显微镜比较了HPIV3、HPIV3/EboGP、HPIV3/4 EboGP-NP和EV（图。). 这表明HPIV3/EboGP的病毒粒子形态（图。)和HPIV3/EboGP-NP（图。)与HPIV3基本上没有区别（图。)但与EV不同（图。).
病毒颗粒的电子显微镜。所示为HPIV3（A）、HPIV3/Ebo-GP（B）、HPIV3/EboGP-NP（C）和EV（D）的阴性染色图像。糖蛋白蛋白聚合体被视为沿着所有病毒颗粒外缘的边缘，在面板B中突出的核衣壳很明显。显示了典型的图像；一般来说，HPIV3及其带有EV基因插入的衍生物之间的一致性差异并不明显。
EV-GP的表达改变了细胞培养中HPIV3载体的CPE。
由于已知EV-GP的表达会导致细胞培养中CPE增加(46)，我们检测了HPIV3的GP表达是否与病毒CPE的变化相关。这在广泛用于HPIV3繁殖的LLC-MK2细胞和有效支持EV复制的Vero细胞中进行了研究。LLC-MX2和Vero细胞的培养物感染了重组病毒。在感染HPIV3的LLC-MK2细胞中，在第2天到第3天观察到大量的合胞体形成，并出现一些细胞圆形，而感染HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP则产生大量的细胞圆形和分离，很少形成鸟巢合胞体（图。)（未显示HPIV3/EboGP-NP感染，因为它与HPIV3/EboGP感染无法区分）。在感染HPIV3的Vero细胞中，直到感染后5至6天才观察到少量CPE，此时开始出现一些细胞圆形（未显示）。然而，在感染HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP的细胞中，从第2天开始观察到显著的细胞圆形（未显示），到第3天，50%至70%的细胞单层由圆形细胞组成（图。). 这些研究表明，将EV-GP基因插入HPIV3基因组会导致CPE改变，其特征是细胞圆形和分离，这与之前发表的观察结果一致(55).
在LLC-MK2和Vero细胞培养物中感染后第3天，所示重组病毒产生的CPE。在每个细胞0.2PFU的输入MOI下进行感染。感染HPIV3/EboGP-NP产生的CPE与感染HPIV3/4EboGP的CPE没有区别，因此未显示。
抗-HPIV3抗体抑制HPIV3/EboGP的生长，但不完全中和。
EV-GP掺入病毒颗粒有可能改变HPIV3载体的中和和感染特性。要研究这个问题，105.2将HPIV3或HPIV3/EboGP的PFU与HPIV3中和抗血清、EV-中和抗血清以及两种血清的混合物（稀释度分别为1:10和1:40）或稀释液（无抗体）（在豚鼠补体存在的情况下）混合，并在37°C下孵育1 h，通过斑块滴定法对LLC-MK2细胞和Vero细胞中残留的感染病毒进行定量（表). 每天观察单层，第7天对斑块进行免疫染色和计数。将HPIV3与HPIV3特异性抗体孵育后，感染性完全中和，在没有抗体的样品中观察到斑块形成。对于HPIV3/EboGP，所有接受HPIV3特异性抗体的样本中出现的斑块数量减少，表明与HPIV3相比，HPIV3/EboGP仅被HPIV3特异性抗体部分中和。用EV特异性抗体孵育HPIV3并没有显著降低感染性，而对于HPIV3/EboGP，在较高抗体浓度下观察到感染性显著降低或完全丧失。HPIV3/EboGP与两种抗体的混合物孵育会导致传染性的丧失，类似于单独使用EV抗体所获得的传染性。因此，HPIV3特异性抗体延缓但没有完全抑制HPIV3/EboGP在细胞培养中的传播，而EV特异性抗体显示出对病毒的高水平中和。
表1。
用抗HPIV3和/或抗EV抗体中和HPIV3及HPIV3/EboGP
| 病毒 | 细胞 | 抗体稀释 | 感染病毒数量（log10PFU）中和后一:
|
|---|
| 抗-HPIV3 | 反电动汽车 | 抗-HPIV3+抗EV |
|---|
| HPIV3型 | LLC-MK2型 | 1:10 | <1.2 | 3.9 | <1.2 |
| | 1:40 | <1.2 | ND（无损检测）b条 | <1.2 |
| | 无抗体 | 4.7 | 4.6 | 4.6 |
| 维罗 | 1:10 | <1.2 | 3.9 | <1.2 |
| | 1:40 | <1.2 | ND（无损检测） | <1.2 |
| | 无抗体 | 4.8 | 4.8 | 4.7 |
| HPIV3/资产负债表 | LLC-MK2型 | 1:10 | 3.2 | <1.2 | 1.2 |
| | 1:40 | 3.7 | 2.1 | 2.6 |
| | 无抗体 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| 维罗 | 1:10 | 3.6 | 1.7 | 1.9 |
| | 1:40 | 3.9 | 2.3 | 2.7 |
| | 无抗体 | 4.9 | 5.1 | 5.2 |
HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP在细胞培养中减弱。
我们比较了重组病毒在LLC-MK2细胞和Vero细胞中的多步生长动力学（图。). 与亲本病毒HPIV3相比，HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP的生长动力学降低，这一效应在LLC-MK2细胞中比在Vero细胞中更为明显，在HPIV3/EboGP-NP中比在HPIV3/4 EboGPS中更为显著。这与我们之前的发现一致，即在HPIV3基因组中插入额外的转录单位会导致细胞培养中复制减少，并且这种影响随着插入长度和数量的增加而增加(43,44). 也有可能GP的表达有助于减弱效应，正如重组EV所观察到的那样，重组EV旨在表达增加的GP水平(53).
所示重组病毒在LLC-MK2和Vero细胞中的多步生长动力学。细胞单层以每细胞0.001 PFU的输入MOI感染所示病毒。每隔24小时采集上清液并进行快速冷冻，在LLC-MK2细胞中测定病毒滴度，并以每毫升PFU表示。显示了三份样品的平均值和标准误差。这些数据来自两个独立实验中的一个代表性实验。
用HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP NP对豚鼠进行单次鼻内接种不会引起疾病，并诱导高水平的EV特异性抗体免疫反应。
选择豚鼠模型评估重组病毒的安全性、免疫原性和保护效果。豚鼠对HPIV3的感染和复制具有高度的耐受性，尽管它们没有表现出明显的HPIV3疾病。该实验动物还允许豚鼠适应型EV株感染和复制，感染导致体重大幅度减轻，随后几乎所有动物死亡(12,51). 用105.3HPIV3、HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP的PFU，每组使用9或10只动物（表). 所有动物看起来都很健康，所有组的体重都在稳步增加（图。). 免疫后第28天，在所有三组的血液中检测到HPIV3载体的高滴度抗体（表). 在这个公认的间接基础上，这三种免疫病毒似乎复制到了可比较的水平。用两种HPIV3/Ebo病毒中的任何一种而非HPIV3免疫的动物产生了用ELISA测定的EV特异性血清抗体的高滴度（表).
在初始免疫感染（A）和第28天EV攻击（B）后，接受所示重组病毒的实验组豚鼠的平均体重。平均重量绘制为相对于免疫日（A）或激发日（B）平均重量的百分比。对照组（接种HPIV3疫苗）的五只动物在挑战后第7天没有被处死，其中两只动物在第8天死亡，一只在第9天死亡，两只在第10天死亡。
表2。
HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP对豚鼠的免疫原性和保护作用
| 免疫病毒（动物数量） | 免疫反应（倒对数2±SE）一
| EV挑战响应（平均值±SE）b条
|
|---|
HPIV3抗体（HAI）
| EV抗体（ELISA）
| 血液中的EV抗原（ELISA，倒对数2)，第7天 | 血液中EV滴度（PFU/ml，倒数对数）10)，第7天 | 死亡率，% | EV抗体（ELISA，倒数对数2)
|
|---|
| 第0天 | 第28天 | 第0天 | 第28天 | 第7天 | 第22天 |
|---|
| HPIV3（9） | <2.0 | 7.7 ± 0.2 | <7.6 | <7.6 | 13.9 ± 0.3 | 6.7 ± 0.2c（c） | 100 | <7.6d日 | ND（无损检测）e（电子） |
| HPIV3/EboGP（10） | <2.0 | 6.6 ± 0.1 | <7.6 | 13.6 ± 0.0 | <4.3 | <1.0 | 0 | 14.2 ± 0.3 | 16.0 ± 0.3 |
| HPIV3/EboGP-NP（9） | <2.0 | 7.3 ± 0.2 | <7.6 | 13.9 ± 0.2 | <4.3 | <1.0 | 0 | 14.1 ± 0.3 | 17.2 ± 0.3 |
由于用于检测EV特异性反应的EV抗原由EV颗粒组成，EV颗粒能够检测对GP和其他病毒蛋白的抗体反应，因此对初始免疫反应的特异性进行了进一步表征，以确认HPIV3载体GP和NP-EV抗原具有免疫原性。这是通过使用纯化的HPIV3/Ebo病毒或EV作为抗原来源的蛋白质印迹分析来完成的（图。). 用HPIV3/EboGP-NP免疫的动物产生的抗GP反应（图。)使用浓缩HPIV3/EboGP（车道3）、HPIV3/EboGP-NP（车道4）和EV（车道5）检测EV-GP抗原。抗NP反应（图。)使用浓缩EV（第5车道）中的EV NP抗原检测到，但未检测到HPIV3/EboGP-NP（第4车道），因为EV NP-不存在于构建物的病毒颗粒中。用HPIV3免疫的对照动物的血清与两种EV抗原均无反应（图。).
免疫接种对EV挑战具有高度保护作用。
在免疫接种后28天，所有动物均接受10次腹腔注射三豚鼠适应EV的PFU，一种高致死剂量。所有接种了HPIV3控制病毒的动物都感染了EV，并伴有体重减轻（图。). 这些动物表现出高水平的病毒血症和血液中高水平的EV抗原（表); 在脾脏、肝脏和肺部（图。); 还有一例是胆囊。该组所有动物在挑战后8至10天死亡。在用HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP免疫的组中，体重没有明显减轻（图。)或出现疾病症状，并且在激发后第7天或第22天血液中未检测到EV或EV抗原（表)或在第7天采集的肺、肝和脾组织中（图。)或22（未显示数据）。在感染后7或22天处死所有动物时，它们都是健康存活的（表；图。).
激发后第7天检测豚鼠内脏EV抗原。所示为用HPIV3（A、B和C）免疫的对照动物和用HPIV3/EboGP-NP（D、E和F）免疫的动物的脾（A和D）、肝（B和E）和肺（C和F）组织的IHC染色的代表性示例。含有EV抗原的部分区域被染成红色。Bar，100μm。
接受HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP免疫的动物在挑战后第22天EV特异性血清抗体有所增加（表). 对这一现象的可能解释如下：（i）免疫导致滴度持续上升；（ii）激发病毒中EV抗原的增强作用；（iii）激发后EV的有限、未检测到的无症状复制；或（iv）这些因素的组合。
讨论
这是首次研究表明，用表达严重病毒性出血热病原体保护性抗原的活呼吸道病毒载体进行鼻内免疫，可以诱导对致命剂量的该病原体的系统保护性免疫。值得注意的是，在之前用HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP免疫的动物中没有证据表明EV感染。HPIV3/E bo免疫动物的血液和靶器官（肝、脾和肺）中缺乏EV，表明达到了高水平的保护，尽管可能存在低水平的挑战性病毒复制，低于我们的检测水平。然而，有必要对非人类灵长类动物的结构进行评估，因为在啮齿类动物模型中诱导的保护性免疫在猴子中测试时不能保证类似的结果(21,35). 值得注意的是，在允许两种病毒复制且对EV疾病非常敏感的动物模型中，HPIV3表达EV GP和NP与疾病无关。虽然更全面地检查HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP的感染很重要，包括监测病毒滴度和组织分布，但现有证据表明，这些EV蛋白在体内的表达并未赋予HPIV3载体EV特异性致病性。我们认为，本研究将提供对赋予HPIV3载体的任何EV特异性致病性的灵敏检测，因为该EV菌株在豚鼠中的50%致死剂量约为0.0025 PFU（见材料和方法），并且基于HPIV3的载体以5.3 log的更高剂量给药10PFU。
这项研究表明EV-GP蛋白对于诱导对病毒的保护性免疫是必要的和充分的，这与之前公布的豚鼠模型数据一致(34,54)和灵长类动物模型(24,47). 第二种EV蛋白，NP，先前被证明在豚鼠中诱导短期保护性反应(54)并通过诱导细胞毒性T淋巴细胞，促进灵长类动物的保护性免疫反应(45). 然而，在我们的研究中，GP蛋白诱导的高水平保护作用掩盖了HPIV3/EboGP-NP中NP对诱导保护性免疫的可能贡献。因此，用HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP免疫后抗体反应和细胞毒性T细胞反应对单个EV蛋白的相对贡献将在单独的研究中进行检查。
先前研究表明，在缺乏其他EV蛋白的细胞培养中GP的表达会导致CPE增加(46). 在本研究中，从HPIV3表达的GP也观察到了这一点。然而，这与豚鼠模型中的毒力增加无关，这也不是我们第一次观察到体外CPE和体内毒力之间缺乏相关性。例如，将RSV融合F糖蛋白重新定位为启动子近端增加了其在体外的表达和CPE，但在小鼠中未观察到毒力变化(27). 此外，当所有RSV基因（包括F）的表达通过M2-2调节蛋白的缺失而增加时，体外观察到CPE显著增加，但这种重组RSV在黑猩猩中高度减弱(4,48). 将F蛋白的裂解位点改性为非胰蛋白酶依赖性的人偏肺病毒（出于生物安全原因，在减弱的背景下进行评估）在体外表现出更大的CPE，而仓鼠的毒力没有变化（S.Biacchesi、B.R.Murphy、P.L.Collins等，未发表的数据）。体外CPE不一定能预测体内毒力，这也许并不奇怪，因为体内感染的细胞在任何情况下都会被病毒因子（如合胞体形成）、细胞凋亡或宿主免疫杀死。与HPIV3相比，体外观察到的CPE增加伴随着HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP的复制减少。
HPIV3对GP的表达导致外源糖蛋白在HPIV3病毒颗粒中的结合水平较低，而在HPIV3/EboGP-NP病毒中未检测到NP。由于EV-GP介导粘附和渗透，因此它有可能独立于载体的HN和F蛋白而引发HPIV3载体的感染，因此HPIV3病毒相关GP可能能够在存在HPIV3中和抗体的情况下介导感染。事实上，这似乎发生了：完全中和HPIV3载体的HPIV3中和抗体仅弱中和HPIV3/EboGP感染性，因为病毒中存在EV-GP。令人惊讶的是，EV抗体在中和HPIV3/EboGP感染性方面非常有效。因此，尽管HPIV3糖蛋白的数量大于EV GP，但含有HPIV3的HN和F糖蛋白以及EV的GP的病毒被EV抗体比HPIV3更有效地中和。这种观察的原因尚不清楚。无论如何，病毒粒子中HPIV3和EV糖蛋白的存在并没有明显改变体内HPIV3的发病机制。这令人放心，但并非出乎意料。HPIV3的细胞受体唾液酸分布广泛，因此HPIV3感染和组织嗜性可能不受受体可用性的限制。此外，在免疫抑制的实验动物中，HPIV3可以很容易地从肺部全身传播到其他器官(15,16). 因此，HPIV3已经具有从呼吸道广泛传播的能力。
我们选择HPIV3作为模型来评估呼吸道病毒作为EV载体的潜力，因为HPIV3容易感染豚鼠和恒河猴，并诱导免疫反应，这是评估EV感染和疾病的合适实验动物。HPIV3是婴儿和儿童呼吸道感染的常见原因，一系列cDNA衍生的HPIV3突变体正在被开发和评估为针对HPIV3的候选儿科疫苗(30). 因此，HPIV3的减毒版本可能适合用作EV和其他病原体的儿童疫苗载体。然而，由于自然接触，大多数成年人群的HPIV3血清呈阳性。HPIV3载体的免疫流行将限制其复制(11)导致对表达的外来抗原的免疫反应降低。对于任何基于常见人类病原体的载体，如5型腺病毒载体，都会出现此问题。另一方面，成人HPIV3再感染很常见(10)这表明在血清阳性个体中至少可以发生有限水平的病毒复制。此外，将EV-GP并入HPIV3/EboGP病毒颗粒中，以及在存在抗HPIV3抗体的细胞培养物中病毒的传染性，表明HPIV3/Ebo-GP可能对HPIV3血清学阳性宿主有一定疗效。这一问题将在使用HPIV3-血清阳性豚鼠的单独研究中进行探讨。另一种策略是开发基于非人类副粘病毒的载体，这些病毒与主要人类病原体抗原无关，并且人类成年人群对其血清呈阴性，例如禽新城疫病毒(31,32). 我们最近发现，这种病毒在非人类灵长类动物中高度减毒，并诱导了对表达的外来抗原的强烈免疫反应(8)因此代表了一种有前景的疫苗载体。
针对EV和马尔堡病毒等出血热病毒的副粘病毒载体鼻内疫苗可能被证明有助于控制这些疾病的暴发并保护卫生保健工作者。这种疫苗有几个重要的优点。首先，因为已知EV的气溶胶具有传染性(23,42)鼻内接种诱导的系统免疫和粘膜免疫可以快速有效地保护公众免受此类公共健康威胁。第二，鼻内免疫不需要训练有素的医务人员，与肠外免疫相比，通过这种途径可以更容易地完成暴发环境中大量个人的免疫接种。第三，鼻内免疫可阻止血液传播病原体的传播，这可能发生在肠外免疫期间。第四，大多数副粘病毒可以在Vero悬浮细胞培养基中生长良好，这将使其制造在经济上可行。这与其他一些载体系统形成对比，例如基于复制缺陷型腺病毒的载体系统，后者需要昂贵的辅助细胞系和高剂量免疫。此外，鼻腔免疫可用于增强肠外注射疫苗后的免疫反应，例如基于腺病毒或水泡性口炎病毒的疫苗(24,45,47). 无论如何，为了控制各种新出现的病原体的爆发，拥有多个载体疫苗平台是很有价值的，因为针对一种特定载体的免疫反应的发展可能会使同一个人的后续疫苗接种效率低下。
致谢
我们感谢Elaine Lamirande提供了出色的技术援助，Ernest Williams和Fatemeh Davoodi执行了HAI分析，Mario Skiadopoulos提供了兔抗HPIV3血清，Patricia Greer为IHC处理组织，Charles Humphrey生成了电子显微镜图像。
该项目是NIAID校内项目的一部分。
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