生物化学杂志。2006年2月15日；394（第1部分）：207–216。
硫氧还蛋白还原酶调节主动脉内皮细胞血红素氧化酶-1表达的诱导
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温迪·L。特里戈纳
*美国宾夕法尼亚州立大学亨宁大厦115号兽医学系，宾夕法尼亚州大学公园，邮编16802。
伊西斯·K。百灵鸟
*美国宾夕法尼亚州立大学亨宁大厦115号兽医学系，宾夕法尼亚州大学公园，邮编16802。
曹玉章
*美国宾夕法尼亚州立大学亨宁大厦115号兽医学系，宾夕法尼亚州大学公园，邮编16802。
洛林·M·。索尔迪洛
†美国密歇根州立大学202D兽医中心兽医学院，密歇根州东兰辛48824。
*美国宾夕法尼亚州立大学亨宁大厦115号兽医学系，宾夕法尼亚州大学公园，邮编16802。
†美国密歇根州立大学202D兽医中心兽医学院，密歇根州东兰辛48824。
2005年5月2日收到；2005年9月23日修订；2005年10月7日接受。
摘要
某些硒蛋白如GPX-1（谷胱甘肽过氧化物酶-1）和TrxR1（硫氧还蛋白还原酶-1）在血管内皮细胞中具有重要的抗氧化防御功能。饮食中硒（Se）缺乏期间硒蛋白活性降低可导致其他非硒依赖性抗氧化剂的代偿性增加，如HO-1（血红素氧化酶-1），这可能有助于抵消氧化应激的破坏作用。然而，单个硒蛋白在调节血管衍生保护性基因反应（如HO-1）中的作用尚不清楚。使用基于BAEC（牛主动脉内皮细胞）硒缺乏的氧化应激模型，我们试图确定TrxR1活性是否有助于HO-1表达的差异调节，作为氧化还原环境改变的功能。在用前氧化剂15-HPETE（15-氢过氧二十碳四烯酸）刺激后，充足的BAEC上调HO-1的表达，并且这种抗氧化剂的水平与EC的凋亡呈负相关。虽然硒缺乏的BAEC显示出较高的HO-1基础水平，但在15-HPETE处理后，HO-1没有上调，这导致前凋亡标记物水平显著升高。随后的结果表明，HO-1的诱导依赖于TrxR1的活性，正如化学抑制剂研究和TrxR1-siRNA的直接抑制所证明的那样。最后，在15-HPETE刺激后，恢复硒缺乏BAEC中还原底物Trx（硫氧还蛋白）的胞内水平足以增加HO-1的激活。这些数据为Trx/TrxR系统参与前氧化激发期间BAEC HO-1表达的调节提供了证据。
关键词：血红素氧化酶-1、氧化应激、硒、硫氧还蛋白、硫氧还原酶
缩写：AA，花生四烯酸；BAEC，牛主动脉内皮细胞；环氧化酶；DCFH-DA，2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯；DNCB，2,4-二硝基氯苯；DTNB，5,5-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）；内皮细胞；FAHP，脂肪酸过氧化氢；胎牛血清；谷胱甘肽过氧化物酶；15-HETE，15-羟基二十碳四烯酸；血红素氧化酶-1；15-HPETE，15-氢过氧二十碳四烯酸；辣根过氧化物酶；低密度脂蛋白；脂氧合酶；QC RT-PCR、定量竞争性逆转录-PCR；活性氧；siRNA，短干扰RNA；锡原卟啉；SP-HPLC，直相HPLC；TBS，Tris缓冲盐水；Trx，硫氧还蛋白；rTrx，重组人Trx；TrxR，硫氧还蛋白还原酶
简介
血管微环境中微量元素硒（Se）的缺乏会导致氧化应激，并与动脉粥样硬化的进展有关[1]. 由于缺乏这种微量营养素的机制数据，研究补充硒与预防心血管疾病之间关系的临床试验结果仍然存在争议，难以解释[2]. 在内皮细胞中补充硒的一个有益结果是硒依赖性抗氧化剂GPX（谷胱甘肽过氧化物酶）和TrxR（硫氧还蛋白还原酶）的活性增加，这些抗氧化剂通过多种机制调节氧化应激。除了清除活性氧（ROS）的能力外，GPX和TrxR还控制其底物谷胱甘肽和Trx（硫氧还蛋白）的氧化还原状态[三]. 一旦被还原，谷胱甘肽和Trx可以通过减少氧化还原敏感蛋白中的关键半胱氨酸残基来清除活性氧并控制细胞反应。此外，有充分的文献证明，硒蛋白调节AA（花生四烯酸）代谢的活性，特别是COX（环氧化酶）和LOX（脂氧化酶）途径。例如，活性氧可以刺激或抑制酶活性，这取决于活性氧的特定亚型和积累量[4]. 硒蛋白还调节COX和LOX酶产生的氧合产物的特异性，包括将主要15-LOX-1代谢物15-HPETE（15-氢过氧化二十碳四烯酸）还原为其还原形式15-HETE（15-羟基二十碳三烯酸），从而抑制主要产物的积累[5,6]. 氢过氧代谢物15-HPETE在许多细胞类型中作为一种反应性前氧化物质，在内皮细胞中特别具有促凋亡作用[7,8]. 最后，除了在调节细胞氧化还原环境中的多重作用外，最近的证据表明硒蛋白在调节非硒依赖性应激反应酶如HO-1（血红素氧合酶-1）的表达中也发挥作用[9].
抗氧化剂HO-1催化前氧化分子血红素转化为产物胆绿素、铁和CO。HO-1在许多细胞类型中普遍表达，转录被许多前氧化分子激活，包括血红素、重金属、氧化低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、促炎性细胞因子和ROS[10–13]. 基于其抗氧化特性，HO-1的表达可以预防与氧化应激相关的疾病，包括缺血再灌注、移植排斥和动脉粥样硬化，这一点并不奇怪[14,15]. 事实上，进行的研究体内证实HO-1在动脉粥样硬化发展中的治疗和预防作用。与对照组相比，HO-1的化学诱导在低密度脂蛋白受体缺乏小鼠中产生较小的动脉粥样硬化损伤，而HO-1的抑制加剧了损伤的大小[16,17]. 载脂蛋白B缺乏小鼠血管中HO-1的靶向过度表达可延缓动脉粥样硬化临床表现的进展[18]. 虽然HO-1在预防这些疾病方面的重要性已经明确，但在氧化应激期间，其在血管细胞（如内皮细胞）中的表达调控尚不明确。
最近的研究表明硒蛋白活性与HO-1表达之间存在相关性[19]，尽管这种关系涉及的确切机制尚待确定。体内对硒缺乏症的研究表明，大鼠肝细胞HO-1表达呈代偿性增加，这表明非硒依赖性抗氧化调节在硒蛋白合成丰富的部位具有显著影响[19]. 然而，这些相同的研究表明，其他器官中HO-1水平没有改变，这表明这些部位非Se依赖性防御的调节与肝脏不同。其他研究表明，硒蛋白在氧化应激期间对HO-1的调节中具有特殊作用，并暗示TrxR是参与该调节的主要硒蛋白[19,20]. 这些研究表明TrxR活性对HO-1表达有积极和消极影响，但结果与之相矛盾。在一个例子中，TrxR活性的增加降低了ROS，ROS是肝细胞中HO-1基因转录的潜在刺激源[19,20]. 或者，TrxR活性升高导致Trx增加红色（Trx减少），这被认为通过减少巨噬细胞HO-1基因转录上游的氧化还原敏感信号蛋白来增加HO-1的表达[19,20]. 为了进一步阐明血管内皮中硒蛋白和HO-1表达之间的关系，本研究使用了一种氧化应激模型，该模型中的初级BAEC（牛主动脉EC）缺乏硒，可以评估缺乏硒依赖性抗氧化剂时的代偿性抗氧化机制。本文证明，前氧化剂暴露后HO-1表达的差异性调节取决于EC的硒状态。通过用siRNA（短干扰RNA）特异性抑制TrxR1，我们证明，这种硒蛋白通过控制细胞内氧化还原状态来积极调节HO-1的表达水平。
实验
试剂
以下试剂购自西格玛化学公司：胰岛素、肝素、转铁蛋白、PMSF、抑肽酶、AA、亚硒酸钠、钙离子载体A23187、DTNB[5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）]、DNCB（2,4-二硝基氯苯）和重组TrxR。抗生素和抗真菌，L（左）-谷氨酰胺、胰蛋白酶/EDTA、Hepes缓冲液、TRIzol®均来自Invitrogen。火腿的F-12K（凯恩的营养混合物F-12）是从欧文科学公司获得的。Hyclone实验室根据要求提供Se水平降低的FBS（胎牛血清）（终浓度为200至250 nM）。Hoechst 33342和DCFH-DA（2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯）购自Molecular Probes。ApoONE同源caspase 3/7分析和Dual-Luciferase®Reporter分析系统来自Promega。SnPPIX（锡原卟啉）从Tocris Chemical Co.获得。rTrx（重组人Trx）从American Diagnostica购买，并在还原条件下储存。HO-1 4.0 kb启动子荧光素酶构建物由Xi-Lin Chen博士（AtheroGenics Inc.，Alpharetta，GA，U.S.A.）提供。抗-HO-1单克隆抗体购自Stressgen，抗Trx抗体购自BD Pharmingen，抗肌动蛋白购自Chemicon。从Upstate获得抗TrxR抗体并检测TrxR的N末端区域。M-PER®（哺乳动物蛋白提取试剂）和与HRP（辣根过氧化物酶）结合的次级小鼠IgG来自Pierce。siRNA质粒载体pSuppressor-Neo来自Imgenex。Oxis Research提供了GSH/GSSG-412™套件。
15-LOX-1代谢物的制备
将大豆脂氧合酶（40 mg）添加到600 ml含氧150 mM磷酸钾缓冲液中，pH值为8.7。通过添加1.5 ml 64 mM AA启动反应，然后在O下培养2在37°C下流动1.5分钟，剧烈摇晃。通过添加10 ml 6 M HCl将pH调节至2.0终止反应，并立即用800 ml己烷/乙醚（1:1，v/v）萃取。有机提取物在30°C的真空下通过旋转蒸发进行干燥。将粗15-HPETE溶解于2ml HPA-30（己烷/丙-2-醇/乙酸，969:30:1，按体积计）中，并进行SP-HPLC（直相HPLC）纯化。在Beckman Gold系统上使用Phenomenex半制备柱（10μm，10 mm×250 mm，二氧化硅），使用HPA-30等比流动相，以4 ml/min的流速进行HPLC。在235 nm下监测洗脱液的吸光度。15-HPETE在约7–8分钟时从色谱柱中洗脱，然后旋转蒸发并在2 ml乙醇中再次悬浮。为了获得15-HETE，用100 mg NaBH减少15-HPETE的1500 AU（235 nm处的吸光度单位）4在0°C的60 ml甲醇中放置1分钟。在用1 ml 6 M HCl酸化并用150 ml水稀释后，15-HETE通过上述SP-HPLC提取和纯化，但使用HPA-15溶剂（己烷/丙醇/乙酸，984:15:1，体积比）代替HPA-30。放射性标签[1-14C] 15-HPETE使用[1合成-14C] AA和大豆LOX如上所述。
细胞培养
如前所述，通过胶原酶消化法从牛主动脉中分离出初级BAEC[21]. 使用限制稀释法将内皮细胞克隆到单细胞水平，并将其保存在含10%（v/v）FBS的Ham’s F-12K培养基中，添加L（左）-谷氨酰胺、Hepes缓冲液、胰岛素、转铁蛋白和肝素。三到四次传代后，血清水平降至5%，硒缺乏培养基（−Se）的基础硒浓度为10nM。向硒充足的培养基（+Se）中添加额外的亚硒酸钠（10 ng/ml），使最终硒浓度达到70 nM，硒浓度增加7倍。如前所述，硒状态由GPX活性和TrxR活性水平确认[21,22]. 简言之，GPX活性是通过在谷胱甘肽和谷胱甘苷还原酶存在下生成NADPH来测量的[21,22]. 通过在rTrx和NADPH存在下底物胰岛素中硫醇残基的还原来测定TrxR的活性[21,22]. 如前所述，在重组TrxR和NADPH存在下，通过减少胰岛素底物中的硫醇残基来测定Trx活性[23]. 细胞内ROS生成通过过氧化物敏感DCFH-DA探针的相对荧光进行测量，如[21]. 根据制造商的说明，使用GSH/GSSG-412试剂盒测量GSH和GSSG的水平。在用15-HPETE、15-HETE或AA刺激之前，BAEC在无血清F-12K培养基中培养。对于rTrx和DNCB实验，在刺激前3 h向培养物中添加10μg/ml rTrx或10 nM DNCB。
QC RT-PCR（定量竞争性逆转录-PCR）
根据制造商的说明，使用TRIzol®试剂分离总RNA，并在所有反应中使用100 ng样品。根据前面描述的程序构建mRNA内部标准[24]. 然后使用以下引物进行QC RT-PCR以测量HO-1 mRNA水平：正向5′-TCTAGACTGGATGTTGA-3′和反向5′-TAGGACCGTACGACTTA-AG-3′。为了确认siRNA系统，使用以下针对牛TrxR1 C末端区域的引物测量TrxR1-产物：正向、5′-TG-AATGGAAAAACAAAGATG-3′和反向、5′-CACG-GCCTAGATAAACGCACAGT-3′。反应最初在94℃下加热3 min，然后在94℃进行30次循环，每次10 s，HO-1在52℃下30 s（TrxR1在58℃下），在72℃下45 s。在2%琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并进行密度测定以相对于内标水平定量HO-1和Trxr1mRNA的量。
蛋白质印迹
在M-PER®中收集全细胞裂解产物，并在10000下离心克在4°C下保持10分钟，以去除膜部分。等量的蛋白质（20–30μg）通过SDS/10–15%PAGE溶解并转移到硝化纤维素膜上。在室温（25°C）下，用（v/v）0.01%吐温-20在TBS（Tris缓冲盐水）中的5%（w/v）奶粉中封闭膜，并用抗（人HO-1）（1:1000稀释）、抗（人Trx）（1:2000稀释）或抗（人TrxR1）（1:500稀释）在含有0.01%（v/v）吐温-20的TBS中5%（w/v）BSA中培养过夜。然后在室温下将针对HRP结合小鼠IgG的二级抗体（1:5000稀释）添加到膜中1 h，清洗并暴露于HRP底物（Pierce）中，并通过放射自显影胶片上的化学发光进行可视化。在类似条件下，用抗（人类肌动蛋白）（Chemicon，1:5000）和抗（小鼠IgG）-HRP二级抗体（1:5000稀释）剥离并重新切割膜。
荧光素酶分析
如前所述，使用磷酸钙沉淀法转染初级+Se和−Se BAEC[25]. 简言之，4×104将细胞置于24孔板上，DNA/磷酸钙沉淀含有0.4μg报告质粒（HO-1 4.0 kb启动子-pGL3）和0.02μg雷尼利亚将控制质粒（pRL-TK）添加到每个孔中。4 h后，细胞在含有20%（v/v）甘油的无血清培养基中经受45 s的渗透性休克，然后在5%+Se或−Se培养基中培养。44小时后，在100μl被动溶解缓冲液中收集细胞，并根据制造商的说明使用双荧光素酶®报告分析系统测量荧光素素酶活性。萤火虫比例/雷尼利亚计算荧光素酶活性，并报告为+Se对照细胞的倍数增加。
细胞凋亡分析
对于caspase 3/7分析，104如上所述，将EC接种在+Se或−Se培养基中的96-well培养板中。过夜培养后，将HO-1抑制剂SnPPIX添加到无血清培养基中15 h，然后用30μM 15-HETE或15-HPETE刺激6 h。根据制造商的说明测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7的活化。将ApoONE同源caspase 3/7试剂（25μl）添加到每个孔中，并在室温下混合4 h。培养后，对样品进行罗丹明-10荧光分析。结果显示，半胱天冬酶3/7活性比未刺激的+Se增加了一倍。Hoechst 33342染色，约5×104将BAEC接种在−Se或+Se培养基中的六孔板中，并如上所述用SnPPIX处理。在用15-HPETE刺激2 h后，用4%（w/v）多聚甲醛在4°C的PBS中固定EC过夜，用10μg/ml Hoechst 33342在PBS中在室温下染色10 min，并用蒸馏水清洗。根据是否存在核酸凝集物，对每孔约200个内皮细胞（每个治疗三次）进行凋亡手动评分。
TrxR siRNA
pSuppressorNeo siRNA质粒载体用于构建牛TrxR1的21 bp头对头发夹环（GenBank®登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_174625”，“term_id”：“1406210724”}}NM_174625，残基303–324），被证实是牛TrxR1特有的。最佳TrxR1序列为tcga公司-ggaggcagcaaaatacaa公司-gagtactg公司-ttg目录tggctgcctcc-ttttt，其中相应的有义和反义硒蛋白序列用粗体字母表示，茎环序列用斜体字表示，克隆悬突（XhoI）用下划线表示。该区域对应于牛TrxR基因的5′区，位于转录起始位点下游约30 bp处，该转录起始位点存在于其他物种中鉴定的所有已知TrxR1剪接变体中[26,27]. 对于构建物，合成两个互补的寡核苷酸并退火以生成双链DNA。对于对照siRNA载体，开发了一个在牛或人基因序列中不包含任何显著相似性的加扰序列。将这些链连接到线性化的pSuppressorNeo载体中，转化为胜任的大肠杆菌，并对RNA干扰插入物进行测序，以确认正确插入。通过氯化铯梯度离心制备质粒，并使用上述和之前报道的磷酸钙方法将其稳定转染到BAEC中[25]. 转染后48小时，在含有Se的G418 10%（v/v）FBS培养基中选择稳定的BAEC。在选择抗生素后2周，通过TrxR1 QC RT-PCR、Western blot和上述活性测定证实TrxR1活性降低。
结果
硒缺乏期间氧化应激的确认
硒充足（+Se）和缺乏（−Se）的BAEC通过在体外在有或无亚硒酸钠补充的情况下培养2至3代，如实验部分所述和前面所示[21]. 通过测量主要EC衍生硒蛋白、GPX和TrxR的活性以及ROS的升高来监测氧化应激水平() [28,29]. 在氧化应激期间，AA代谢也会发生变化，包括下游代谢物的积累[5,6]. 生化研究表明，在正常细胞氧化还原条件下，15-LOX-1代谢物15-HPETE通过硒蛋白、GPX-1和TrxR1转化为其还原形式15-HETE[5,6]. 因此，硒缺乏会减少15-HPETE向15-HETE的转化，导致这些细胞中这种前氧化剂的大量积累。如所示，+Se BAEC中15-HETE升高，−Se BAECs中15-HPETE升高，表明BAEC中氧化应激期间LOX代谢发生改变。
表1
硒缺乏对氧化应激的影响BAEC在添加了5%（v/v）FBS的F-12K培养基中培养，有无硒（10 ng/ml）。GPX活性（单位：nmol NADPH氧化/min）一412单位×1000/min每毫克蛋白质。用过氧化物敏感的DCFH-DA探针的相对荧光测定细胞内ROS的产生。pmol/10中的15-LOX-1（15-HETE和15-HPETE）代谢物6用30μM AA和2μM钙离子载体A23187刺激后每小时BAEC。结果为平均值±S。三次个人实验的E.M，P（P）与+Se组的相应值相比<0.05（配对学生t吨测试）。
| 活动 |
|---|
| 化验 | +硒 | −硒 |
|---|
| GPX公司 | 32.0±4.9 | 6.3±1.4* |
| TxrR公司 | 100.1±2.2 | 47.3±7.1* |
| ROS公司 | 6.7±1.4 | 13.9±3.4* |
| 15-海特 | 519±27.2 | 254±15.7* |
| 15-羟丙基乙酯 | 239±19.4 | 60±17.6* |
硒缺乏时内皮细胞HO-1的升高
为了证实硒缺乏会增加BAEC中保护性抗氧化剂HO-1的表达，在这些研究中使用了一种包含人类HO-1启动子4.0 kb部分的荧光素酶报告构建物。转染后48小时，对+Se和−Se BAEC中的荧光素酶活性进行了测定，结果表明，与+Se BAECs相比，−Se-BAECs中的荧光素酶活性增加了4倍(A） ●●●●。接下来，测量HO-1 mRNA水平，以确定启动子活性增加是否导致HO-1转录增加。在−Se BAEC中，HO-1 mRNA水平显著增加>4倍（使用QC RT-PCR测定）(B） ●●●●。使用Western blot分析在蛋白质水平上进一步证实了这一点，与+Se BAEC相比，−Se BAECs的全细胞裂解物中HO-1升高(C） ●●●●。
硒缺乏增加HO-1 mRNA和蛋白的表达ECs在+Se或−Se培养基中培养2至3代。(一)用HO-1 4.0 kb Luc质粒瞬时转染细胞，48小时后分析荧光素酶活性。荧光素酶活性表示为萤火虫的倍数增加/雷尼利亚超过+Se未刺激BAEC（unsim）。结果为平均值±S。三个单独实验的E.M。(B类)分离RNA并进行QC RT-PCR。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并进行密度测定以量化HO-1 mRNA的数量。五个独立实验的E.M。(C类)收获全细胞裂解物，通过SDS/12%PAGE解析等量的蛋白质，并进行蛋白质印迹。结果表示为HO-1蛋白/肌动蛋白比值比+Se未刺激BAEC（unsim）增加了一倍，平均值为±S。三个单独实验的E.M。不同小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05）根据配对学生的t吨测试。
15-HPETE刺激后HO-1的差异水平
由于FAHP（脂肪酸氢过氧化物）可以诱导HO-1表达，我们试图确定来自LOX途径的FAHP的前氧化激发物15-HPETE是否改变HO-1表达。选择15-HPETE作为前氧化激动剂是基于早期的研究，这些研究记录了这种FAHP在硒缺乏期间促进血管功能障碍的作用[30]. 15-HPETE的还原形式，15-HETE，也被用来证实，在通过15-LOX途径增加AA代谢期间，过氧化氢代谢产物负责HO-1的激活。随着每种代谢物（2–30μM）剂量的增加，刺激+Se和−Se BAEC后，测量HO-1 mRNA和蛋白质的水平。结果表明，虽然−Se细胞在基础条件下HO-1水平升高，但进一步暴露于高剂量的15-HPETE导致HO-1表达呈下降趋势(A） ●●●●。或者，高剂量的15-HPETE暴露于+Se BAECs显著增加了HO-1 mRNA的水平，高于基础水平，并随着15-HPETE浓度的增加而表现出剂量反应(A） ●●●●。HO-1 mRNA水平的升高是由于从头开始转录，因为在RNA聚合酶抑制剂放线菌素D的存在下HO-1的诱导被阻止（结果未显示）。相反，用15-HETE刺激后，+Se BAEC中HO-1 mRNA没有显著变化，而−Se BAECs中HO-1的水平降低，这证实了15-HPETE中的氢过氧基团负责HO-1的激活(B） ●●●●。为了证实在mRNA水平上观察到的趋势导致了类似的蛋白水平，在15-HPETE刺激后收集细胞裂解物，并通过Western blot分析测量HO-1蛋白表达水平(C和D） ●●●●。在蛋白质水平上，外源性15-HPETE刺激后，在−Se BAEC中观察到HO-1表达显著降低。引人注目的是，在相同的刺激下，+Se BAEC中HO-1水平增加，与在mRNA水平上观察到的结果类似。
15-HPETE刺激后+Se和−Se BAEC中HO-1表达的差异水平通过剂量滴定刺激内皮细胞(一)15-HPETE或(B类)15-HETE 2小时，分离总RNA，然后进行HO-1 mRNA的QC RT–PCR。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并测量HO-1 mRNA的密度。结果表示为HO-1 mRNA相对于+Se未刺激BAEC（unsim）的倍数增加，平均值为±S。三个单独实验的E.M。(C类)在用15-HPETE的剂量滴定刺激内皮细胞2小时后，收集全细胞裂解物，并用SDS/12%PAGE溶解等量的蛋白质进行Western blot分析。(D类)密度测定结果来自于(C类)平均值为±S。显示了三个单独实验的E.M。不同小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05），由方差分析确定。
15-HPETE刺激诱导细胞凋亡
下一个目标是确定15-HPETE诱导的HO-1表达相对于硒状态的变化是否与凋亡标记物表达的变化相关。因此，将+Se和−Se BAEC与30μM 15-HPETE或15-HETE培养，并测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7的活性，作为细胞凋亡的生化指标。在用15-HPETE刺激6小时后，−Se BAEC的caspase 3/7活性增加了4倍，而+Se BAECs的凋亡水平没有变化(A） ●●●●。或者，在15-HETE刺激下，+Se和−Se BAEC中caspase 3/7活性保持不变。为了确定+Se BAECs中caspase 3/7激活水平较低是否部分是由于相同刺激后HO-1的上调，使用化学抑制剂SnPPIX抑制HO-1活性，并在15-HPETE刺激后测量细胞凋亡。在用SnPPIX预处理15小时和用15-HPETE刺激2小时后，+Se BAEC中caspase 3/7的激活量增加，超过了在−Se BAECs中观察到的水平(A） ●●●●。为了通过形态学变化证实凋亡信号通路的激活，在相同条件下使用Hoechst 33342染色测定染色质凝集。在用15-HPETE刺激后，与+Se BAEC相比，−Se BAECs的浓缩染色质显著增加(B） ●●●●。在用SnPPIX抑制HO-1并用15-HPETE刺激后，+Se BAECs中的细胞死亡显著增加，这与相同刺激后在−Se BAEC中观察到的水平相似(B） ●●●●。
HO-1活性调节缺硒时细胞凋亡+用指示剂量的HO-1抑制剂SnPPIX预处理Se和−Se BAEC 15 h，然后用30μM 15-HETE或15-HPETE处理6 h。(一)测定了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7的活性，结果表示为半胱氨酸蛋白酶3/7活性比+Se未刺激BAEC（unstim）增加了一倍，平均值为±S。四个单独实验的E.M。(B类)对于Hoechst 33342染色，根据是否存在核酸凝集，每孔大约200个内皮细胞，每个处理三次，手动对凋亡进行评分，结果报告为具有凝集染色质的BAEC的百分比。由不同的小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05），由方差分析确定。
抑制TrxR1逆转+Se BAEC中HO-1的诱导
为了验证Se介导的HO-1表达变化是否是由于TrxR/Trx系统活性改变所致，TrxR被抑制，HO-1表达被测定。在BAEC中使用化学抑制剂DNCB进行了初步实验，以平行于文献中在TrxR抑制研究中常规使用该化学品的其他研究[31,32]. 有趣的是，用10nM DNCB预处理+Se BAEC 3小时，逆转了15-HPETE刺激后HO-1的诱导，表明TrxR1在HO-1基因表达中发挥积极作用（+15-HPETE/−DNCB，HO-1 mRNA增加15.8±4.1倍；+15-HPETE/+DNCB，HO-1 mRNA增加3.9±3.1倍，P（P）<0.05). 由于DNCB治疗的非特异性以及其他研究中获得的有争议的结果，开发了一种使用siRNA抑制TrxR的替代方法来验证这些结果。针对牛TrxR1的N末端区域开发了一种siRNA结构，该区域已被证实存在于其他物种中鉴定的所有已知TrxR1的剪接变体中[26,27]. 在用TrxR1 siRNA和对照siRNA质粒稳定转染BAECs后，BAECs在+Se培养基中经抗生素选择培养汇合。通过台盼蓝排除和caspase 3/7活性测定，与对照siRNA细胞相比，TrxR1 siRNA转染细胞的存活率或增殖率没有差异（结果未显示）。通过使用QC RT-PCR测量TrxR1 mRNA和蛋白表达，确定TrxR1-水平下降(A） 和Western blot分析(B和C） 以及使用胰岛素还原法测量TrxR活性(D） ●●●●。这些结果证实了TrxR1 mRNA（减少87%）、蛋白质（减少63%）和活性水平（减少41%）的显著下降，这是siRNA研究中常见的现象，而不是与敲除系统相关的蛋白质表达的完全消除[32]. 此外，对照siRNA BAEC的结果与+Se亲本BAEC中观察到的水平相当，表明转染和抗生素选择过程不会干扰BAEC中该硒蛋白的表达或活性。与转染对照siRNA序列的细胞相比，稳定表达TrxR1 siRNA的BAEC显示HO-1 mRNA和蛋白质水平基本增加(A和B） ●●●●。在15-HPETE刺激后，TrxR1 siRNA BAEC显示HO-1表达减少，与在相同条件下刺激的−Se BAEC中观察到的效果类似。在有硒培养的对照siRNA BAEC中，15-HPETE刺激导致HO-1表达增加，达到与父母+Se BAEC中观察到的水平相似的水平。在分析用15-HPETE刺激后siRNA细胞的凋亡指标时，与对照siRNA BAEC或亲代BAEC相比，TrxR1 siRNA BAECs的caspase 3/7活性水平增加(C） ●●●●。
TrxR1 siRNA降低TrxR mRNA、蛋白质和活性BAEC被转染TrxR1或控制序列的siRNA，并在抗生素选择下生长汇合，以稳定表达siRNA构建物。(一)分离总RNA，然后对TrxR1 mRNA进行QC RT-PCR。在2%琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并测量Trxr1mRNA和内标物的密度。(B类)收集全细胞裂解物，用SDS/10%PAGE解析等量蛋白质，并进行Western blot。显示了一个具有代表性的斑点。(C类)中的结果(B类)表示为TrxR蛋白相对于肌动蛋白的倍数增加，为平均值±S。三个单独实验的E.M。(D类)采集全细胞裂解物，并使用基于胰岛素的方法测试TrxR1活性。结果以表示一412单位×1000/min每毫克蛋白质，为平均值±S。三个单独克隆的E.M。不同小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05）。
TrxR1 siRNA抑制15-HPETE刺激后BAEC中HO-1的诱导BAEC被转染用于TrxR1或控制序列的siRNA，并在抗生素选择下生长汇合以表达siRNA构建物。(一)收集来自对照细胞和TrxR1 siRNA转染细胞的全细胞裂解物，并用SDS/12%PAGE解析等量的蛋白质，以测量HO-1蛋白水平。(B类)年三次独立实验的密度测定结果(一)平均值，结果为平均值±S。显示了三个单独实验的E.M。(C类)在15-HPETE刺激2小时后，在TrxR siRNA和对照siRNA BAEC中测量Caspase 3/7激活，结果表示为Caspase-3/7激活比未刺激BAEC（unsim）增加了一倍。结果为平均值±S。四个单独实验的E.M。不同小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05），由方差分析确定。
15-HPETE刺激后Trx蛋白定位和活性的变化
下一个目标是确定15-HPETE刺激后氧化还原环境的差异是否与HO-1表达的差异相关。为了监测氧化还原环境的变化，测定了内皮细胞中的显著氧化还原蛋白。无论硒状态如何，在15-HPETE刺激前后，全细胞裂解物中GSH和GSSG水平的测量均无显著变化(). 然而，某些细胞隔室中的Trx蛋白水平发生了变化。在15-HPETE刺激后，从+Se和−Se BAEC中收集细胞溶质部分和核提取物，并通过Western blot技术测量Trx蛋白水平。在刺激前后，+Se和−Se BAEC之间的细胞溶质部分的蛋白质水平没有可测量的差异(). 然而，15-HPETE刺激后，−Se BAEC中的核Trx水平显著降低。由于Trx蛋白定位有显著变化，我们接下来试图确定Trx活性水平是否有伴随变化。经15-HPETE刺激后，与+Se BAEC相比，−Se BAECs（每mg蛋白质形成1897±822 ng硫醇）的核Trx活性显著降低（每mg蛋白形成3823±911 ng硫醇。
15-HPETE刺激后的Trx定位+用30μM 15-HPETE或15-HPETE刺激Se和−Se BAEC 2 h。(一)分离细胞液和细胞核提取物，用SDS/15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白质。(B类)用核提取物进行的三个单独实验的密度测定结果(一)平均值，结果为平均值±S。三个单独实验的E.M。不同小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05），由方差分析确定。
表2
15-HPETE刺激后的氧化还原电位BAEC在添加有和无硒（10 ng/ml）的5%（v/v）FBS的F-12K培养基中培养，并在无血清培养基中用30μM 15-HPETE刺激2小时。使用GSH/GSSG-412试剂盒测量GSH和GSSG水平。结果为平均值±S。三个单独实验的E.M。
| GSH水平 | GSSG水平 |
|---|
| +硒未刺激 | 37.5±1.9 | 1.5±0.8 |
| +硒15-HPETE | 40.0±9.7 | 1.3±0.7 |
| −未刺激硒 | 36.8±4.6 | 1.7±0.8 |
| −硒15-HPETE | 36.8±3.7 | 2.0±1.0 |
Trx在氧化应激期间恢复HO-1表达
为了确定15-HPETE刺激后细胞内氧化还原环境的变化是否与HO-1表达的差异激活有关，在15-HPETE刺激前向培养基中添加还原型rTrx。这种用rTrx处理细胞的方法以前已经证明可以改变HO-1转录的激活[33]. 最初，有必要通过Western blot分析测量全细胞裂解物中的总Trx来验证rTrx预处理后细胞内Trx水平的增加(B） ●●●●。为了消除外源性rTrx仅与质膜结合的可能性，通过离心方法从全细胞裂解液制剂中去除膜组分。结果证实，rTrx处理增加了细胞内Trx的表达，如Trx蛋白水平升高所示。接下来，在rTrx处理的BAEC中测量HO-1 mRNA，以确定外源性rTrx治疗BAEC是否改变HO-1表达。在用15-HPETE刺激−Se BAEC后，HO-1表达出现特征性下降。在15-HPETE刺激前用rTrx补充这些细胞能够恢复HO-1 mRNA和蛋白水平，接近+Se BAEC中观察到的HO-1表达水平(A和C） ●●●●。有趣的是，rTrx处理未刺激的−Se BAEC后HO-1水平增加，表明rTrx正向影响EC中HO-1表达的基础水平。
重组Trx在15-HPETE刺激后诱导−Se BAEC中HO-1水平(一)+Se和−Se BAEC用指定剂量的rTrx预处理3小时，然后用30μM 15-HPETE处理2小时。分离RNA，进行QC RT-PCR。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并进行密度测定以量化HO-1 mRNA的数量。三个单独实验的E.M。不同小写字母表示的值在统计上彼此不同(P（P）<0.05），由方差分析确定。(B类)用1或10μg/ml rTrx刺激BAEC 3 h，收集全细胞裂解物，用SDS/15%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）溶解等量的蛋白质。通过Western blot证实rTrx治疗后细胞内Trx蛋白增加。(C类)用10μg/ml rTrx预处理+Se和−Se BAEC 3 h，然后用30μM 15-HPETE处理2 h。收集全细胞裂解物，通过SDS/12.5%PAGE解析等量的蛋白质，并对HO-1蛋白水平进行Western blot。图中显示了三个代表性斑点。
讨论
在动脉粥样硬化过程中，暴露于血管壁中高水平的ROS后，血管内皮中的氧化应激增加[34]. 微量营养素硒的缺乏会导致硒蛋白抗氧化剂（包括GPX-1和TrxR1）活性的降低，这就要求内皮细胞使用替代抗氧化剂来对抗活性氧，以防止细胞损伤[1]. 最近的研究表明，HO-1在硒缺乏期间上调，并表明这种抗氧化剂可以弥补硒依赖性抗氧化剂的损失[19]. 然而，心血管疾病与硒缺乏之间仍存在正相关，这表明HO-1的代偿性增加不足以防止血管功能障碍[2]. 为了研究硒缺乏与血管损伤部位HO-1表达之间的关系，我们研究了主动脉内皮细胞HO-1激活的调节。在本研究中，主动脉内皮细胞缺硒期间HO-1水平升高，因此我们的研究与先前观察到的结果相关联体内其中，硒缺乏大鼠肝脏Kupffer细胞部分HO-1表达增加[19]. 然而，研究也表明，硒缺乏的BAEC表现出粘附分子表达增加、促炎细胞因子产生和凋亡水平升高，这与HO-1的细胞保护特性相矛盾[30,35]. 因此，我们认为，在促氧化环境中HO-1活化的程度可能对保护机体免受氧化应激期间观察到的损伤作用至关重要。
为了进一步研究氧化应激期间HO-1激活的相对水平，将−Se BAEC暴露于前氧化挑战，并测量HO-1的表达。先前的研究表明，反应性FAHP在动脉粥样硬化病变形成部位积聚，包括花生四烯酸15-LOX-1代谢物、15-HETE和15-HPETE[36,37]. 这些研究进行了就地在动脉粥样硬化病变中测量到高达微摩尔剂量的这些脂肪酸，证实在动脉粥样硬化期间高剂量的15-LOX-1代谢物与内皮细胞接触[38,39]. 因此，前氧化剂15-HPETE被用作激动剂，以模拟与动脉粥样硬化病变形成相关的微环境。在此刺激后，HO-1的激活水平不同，这取决于细胞的硒状态，HO-1表达水平与caspase 3/7激活水平相关。这些数据表明，虽然−Se BAEC具有较高的HO-1表达基础水平，但在15-HPETE暴露后，这些细胞并未上调该抗氧化剂的表达，而+Se BAECs在相同刺激期间显著增加HO-1的表达。我们认为，+Se BAEC在氧化损伤增加期间上调HO-1的能力可能部分保护这些细胞免受凋亡。或者，在硒缺乏期间，前氧化剂刺激后HO-1诱导的缺乏可能会引发促凋亡事件，这将为硒营养状态下降和心血管疾病相关的有害后果提供解释。总之，我们通过上调包括HO-1在内的替代非硒依赖性抗氧化剂的表达，为硒对抗氧化应激提供了证据。
Ejima等人之前的研究[20]证明在促炎条件下，Trx转染巨噬细胞促进HO-1蛋白的增加。一项单独的研究也确定了HO-1激活和TrxR活性之间的关系，尽管这项研究是在硒缺乏模型中进行的，并表明TrxR在调节肝脏HO-1表达方面起着负面作用[9]. 由于这些相互矛盾的报道，我们试图阐明在前氧化剂15-HPETE刺激后，内皮细胞中TrxR活性和HO-1表达之间的相关性。为了直接将我们的结果与之前的研究结果进行比较，我们评估了一种常用的TrxR化学抑制剂DNCB对HO-1表达的影响。结果表明，+Se BAECs的DNCB处理阻止了前氧化刺激后HO-1表达的诱导，表明TrxR活性与HO-1的上调有直接关系。由于DNCB的非特异性，包括其改变其他细胞抗氧化系统（如谷胱甘肽和GPX）的能力，我们选择采用siRNA技术开发一种更敏感和直接的抑制TrxR1的方法。siRNA针对位于TrxR1的ATG起始密码子下游30bp的区域，并且与非特异性加扰对照siRNA构建体相比，显示出显著降低TrxR1的mRNA、蛋白质和活性。已有许多关于其他物种中TrxR1变异体的报道，这些变异体是由于ATG起始密码子上游第一外显子的选择性剪接所致[26,27]. 虽然我们用于检测TrxR的方法无法区分剪接变异体，但我们能够确认siRNA构建物靶向的区域存在于所有报告的变异体中，因此对siRNA抑制敏感。因此，siRNA抑制后任何残留的TrxR活性都很可能是因为通常与siRNA技术相关的部分抑制或线粒体亚型TrxR2的残留活性，而不是对siRNA抑制不敏感的剪接变异体的表达[32]. 当研究TrxR1 siRNA对BAEC中HO-1激活水平的影响时，我们能够证实DNCB实验中观察到的结果，与对照siRNA BAEC相比，在15-HPETE刺激后，TrxR1-siRNA BAEC中缺乏HO-1诱导。这是首次报道使用siRNA直接抑制TrxR1，并最终证明了内皮细胞中TrxR1和HO-1表达之间的关系。TrxR1在促氧化剂激发下积极调节HO-1诱导的能力是硒蛋白抗氧化活性在调节其他细胞保护基因中的重要性的基础。此外，siRNA数据证实，任何对TrxR1活性的抑制，包括缺乏硒的营养状态，都可以显著削弱HO-1的激活，并使内皮细胞在氧化应激期间更容易受到促凋亡刺激。
TrxR1对HO-1激活的调节可能涉及TrxR系统控制细胞内氧化还原平衡的能力。先前的研究表明，通过促氧化剂刺激或谷胱甘肽补充剂治疗，GSH水平的降低与HO-1水平的增加相关[12,40]. 其他研究表明Trx的作用红色在HO-1基因激活的调节中[20,33]. 因此，重要的是要解决15-HPETE刺激对两个氧化还原对的影响，这两个氧化反应对是EC氧化还原平衡的主要调节器，GSH/GSSG和Trx红色/色氨酸公牛（氧化Trx）。虽然GSH/GSSG比率没有显著变化，但15-HPETE刺激的−Se BAEC的细胞溶质和核室中的Trx蛋白和活性水平都有显著变化，这可能会改变氧化还原敏感信号通路。此外，用rTrx补充BAEC恢复了−Se BAEC中HO-1的表达，表明Trx活性的降低在缺乏HO-1激活中起作用。例如，细胞溶质Trx活性的降低可能导致氧化还原敏感激酶和磷酸酶的氧化，这些酶与HO-1基因转录上游的信号转导途径有关，包括PKC（蛋白激酶C）和蛋白酪氨酸磷酸酶[41,42]. 与我们的发现相比，细胞核中较低水平的Trx活性可能支持氧化的核环境，这可能导致转录因子中抑制DNA与启动子元件结合的关键半胱氨酸残基氧化[43]. 有两种氧化还原敏感转录因子，即Nrf2（NF-E2-related factor-2）和AP-1（activator protein-1），与HO-1基因转录的控制有关，因此可能容易受到细胞核中Trx活性降低的影响[44–46]. 因此，15-HPETE刺激后Trx活性的波动为+Se和−Se BAEC之间HO-1诱导模式的改变提供了潜在的解释。我们系统中的Trx活性耗尽很可能是由前氧化剂15-HPETE刺激产生的ROS引起的。研究表明，15-HPETE是一种前氧化剂，通过刺激LOX和COX酶活性，增加脂质过氧化，从而通过产生ROS耗尽抗氧化防御能力，从而改变细胞内氧化还原状态[47,48]. 此外，最近的一项研究报告称，15-HPETE可以直接抑制TrxR1的活性，从而导致Trx进一步耗竭红色缺硒期间[48]. 因此，将硒缺乏的内皮细胞暴露于诸如动脉粥样硬化期间存在的促氧化代谢物中，可以对抗已经耗尽的硒依赖性抗氧化剂。内皮细胞维持TrxR1活性并提供充足Trx供应的能力红色在接触前氧化剂后，可能会决定提高替代抗氧化剂的调节能力，并进一步防止氧化应激。
本研究为与硒缺乏期间HO-1表达增加以及缺乏对动脉粥样硬化发展的保护相关的悖论提供了潜在的解释。即使在缺硒期间HO-1水平升高，但随后的前氧化挑战不会导致抗氧化剂进一步激活至保护水平。本研究表明，HO-1缺乏诱导是由于TrxR1活性降低以及由此导致的Trx水平降低红色进一步确定硒缺乏期间TrxR系统的调节将非常有意义，因为它可以深入了解硒蛋白调节其他氧化还原敏感基因反应的能力，并有助于我们进一步了解动脉粥样硬化进展的机制。
致谢
我们感谢Matthew J.Sylte和Sixtine-Pacifique Valdelievre在本手稿的技术援助中所做的贡献，并感谢Xi-Lin Chen博士提供HO-1–荧光素酶构建物。这项工作的部分支持来自Matilda R.Wilson基金会（美国密歇根州底特律）的捐赠。
工具书类
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