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EMBO J。2006年1月25日；25(2): 290–301.
2006年1月12日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7600931
预防性维修识别码：项目编号1383514
PMID：16407977

TRPM7，一种新的肌动球蛋白收缩力和细胞粘附调节因子

克里斯托弗·克拉克,1 米歇尔·兰吉斯拉格,2 巴特·范·吕文,三 莱昂尼·兰,三 亚历克谢·龙扎诺夫,4 卡尔·G·菲多尔,1 Wouter H Moolenaar公司,三 基斯·贾林,2和弗兰克·范·吕文1,一
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摘要

肌动球蛋白的收缩性调节各种细胞生物学过程，包括胞质分裂、粘附和迁移。虽然在低等真核生物中，α激酶控制肌动球蛋白的松弛，但哺乳动物α激酶的类似作用尚未确定。在这里，我们检测了与α-激酶融合的阳离子通道TRPM7是否可以影响肌动球蛋白功能。我们证明缓激肽激活TRPM7导致钙2+-以及与肌动球蛋白细胞骨架的激酶依赖性相互作用。此外，TRPM7磷酸化肌球蛋白IIA重链。因此，TRPM7的低过表达增加了细胞内Ca2+水平伴随着细胞扩散、粘附和局部粘连的形成。TRPM7的激活通过激酶依赖机制诱导这些局部粘连转化为足小体，这种效应可以通过肌球蛋白II的药理抑制来模拟。总之，我们的结果表明，TRPM7对细胞粘附的调节是激酶依赖性和非依赖性途径对肌动球蛋白收缩性的联合作用。

关键词：细胞粘附、细胞骨架、肌球蛋白、磷酸化、TRPM7

介绍

非肌肉细胞中的肌动球蛋白收缩性在调节基本细胞功能（如细胞形状、胞质分裂、粘附和迁移）中起着基本作用(德拉罗什等, 2002;Geiger和Bershadsky，2002年;Burridge和Wennerberg，2004年). 肌球蛋白II是驱动收缩力的主要运动蛋白。基于肌球蛋白II的收缩反应的调节器包括Rho GTPase家族及其效应器、肌球蛋白轻链激酶和磷酸酶以及肌球蛋白重链（MHC）激酶(德拉罗什等, 2002;Burridge和Wennerberg，2004年). 这个粘液菌基因组编码几种MHC激酶，这些激酶在细胞分裂和迁移过程中对肌球蛋白II的正确定位和组装至关重要(科尔曼等, 1996;Rico和Egelhoff，2003年;海德等, 2004). 肌球蛋白II组装成双极性粗丝，通过将相反方向的肌动蛋白丝拉在一起产生皮层张力。MHC激酶通过磷酸化苏氨酸残基上的MHC尾部来抑制肌球蛋白II的功能，导致纤维断裂，从而释放皮层张力(埃格尔霍夫等, 1993). 这些MHC激酶过度表达或敲除的细胞生物学效应与此范式一致。MHC激酶过度表达导致的胞质分裂缺陷可通过表达不能磷酸化的MHC突变而逆转，从而形成稳定的肌球蛋白丝(Rico和Egelhoff，2003年). 因此，MHC激酶在肌动球蛋白重塑中起着关键作用粘液菌.

粘液菌MHC激酶属于一类罕见且新颖的激酶，称为α激酶，除了ATP结合位点外，它与蛋白激酶超家族的其他成员仅显示有限的序列相似性(梁赞诺夫，2002). 基于体内迄今为止已鉴定的底物，这些激酶优先磷酸化苏氨酸残基，出现在α螺旋的上下文中，因此命名为α激酶(梁赞诺夫，2002). 哺乳动物α-激酶是否也调节肌动球蛋白的收缩性尚待确定。

哺乳动物基因组编码几种α激酶，其功能除延伸因子-2激酶外未知(Drennan和Ryazanov，2004年). 值得注意的是，TRPM6和TRPM7是两种双功能蛋白质，编码与COOH末端α-激酶结构域融合的TRP阳离子通道。TRPM7的电生理特性表明，它是负责镁抑制电流的通道的一部分，与细胞镁有关2+体内平衡(纳德勒等, 2001;科扎克和卡哈兰，2003年;施密茨等, 2003). 然而，TRPM7也可能通过磷酸化下游效应分子来传递信号。根据TRPM7作为受体介导信号转导中活性成分的假设作用，据报道，TRPM7通道对钙具有高度渗透性2+TRPM7 COOH末端与磷脂酶C（PLC）亚型相关，PLC激活调节TRPM7通道开放(跑步者等, 2001,2002; 兰斯拉格等，手稿正在准备中）。我们之前发现缓激肽（BK），一种Gq-PLC偶联受体激动剂，诱导钙2+-MHC的依赖性磷酸化和细胞外周肌球蛋白IIA的分解，与哺乳动物细胞中的细胞扩散和粘附相关(范·列文等, 1999). 因此，我们假设在单个多肽中阳离子通道与α-激酶的偶联可以解释钙与钙之间的密切关系2+信号转导与钙2+-依赖性肌动球蛋白重塑。在这里，我们研究了TRPM7是否可以将受体介导的信号与细胞骨架收缩性和细胞粘附联系起来。

结果

TRPM7介导缓激肽诱导的钙内流

为了检测TRPM7在调节肌动球蛋白收缩性中的作用，通过逆转录病毒转导（一种允许重组蛋白低、接近生理表达的技术）将HA标记的编码野生型（TRPM7-WT）或激酶死亡突变体（TRPM7-D1775A）的TRPM7 cDNA引入N1E-115神经母细胞瘤细胞；补充图S1). TRPM7-WT和TRPM7-D1775A的表达均为内源性TRPM7水平的2-3倍(图1A和补充图S2; 兰斯拉格等，手稿正在准备中）。由于糖基化差异，TRPM7-WT和TRPM7-D1775A在216 kDa时均为双分子(补充图S3). 此外，荧光显微镜证实了TRPM7-WT和TRPM7-D1775A在质膜上的正确定位(补充图S3; 另请参见图4).

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TRPM7增强受体操作的钙内流。(A类)使用HA标签抗体通过IP–Western blot检测N1E-115神经母细胞瘤细胞中TRPM7-WT和TRPM7-D1775A的表达。所有实验均以含有空载体的细胞作为对照。(B类)TRPM7表达导致持续钙2+BK刺激后的内流与激酶活性无关。左侧面板，BK诱导Ca的典型时间过程2+对照组N1E-115细胞的变化；其他面板，BK诱导Ca2+N1E-115/TRPM7细胞的动员。持续流入取决于钙2+内流，因为它被细胞外La严重阻断3+和Gd3+（未显示数据）。(C类)钙的定量2+对照组和TRPM7-过表达细胞的数据（每个条件下至少20次实验的平均值±标准偏差）。重大差异(*)是P（P）在对照N1E-115细胞中获得的值<0.01。

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TRPM7存在于细胞表面，定位于细胞粘附结构。用BK刺激N1E-115/TRPM7-WT细胞（10 nM，30 min）。随后，使用抗HA（3F10）抗体和alexa 488-结合的抗鼠IgG检测TRPM7。肌动蛋白细胞骨架用指骨肽（德克萨斯红）可视化(A类)TRPM7存在于膜褶边中。比例尺=10μm。(B类)TRPM7在足小体肌动蛋白密集的核心周围形成一个环。比例尺=10μm。(C类)足小体内TRPM7环的高倍放大。比例尺=5μm。大鼠IgG对照抗体未显示任何特定染色（数据未显示）。

最初，我们由Ca进行调查2+荧光法检测TRPM7是否在BK刺激后被激活，BK是一种促进N1E-115细胞中肌动球蛋白松弛的肽激动剂(范·列文等, 1999). N1E-115细胞中TRPM7的低过表达导致静息Ca的中度升高2+水平（109±9对85±4 nM）。BK的添加触发了细胞溶质钙的快速增加2+来自亲本和TRPM7转导细胞的内部储存。引人注目的是，在N1E-115/TRPM7细胞中，最初的Ca2+瞬态之后是钙持续升高的阶段2+这种情况持续了几分钟才恢复到基础水平，在亲代细胞中没有观察到(图1B). 去除细胞外钙2+BAPTA立即终止了平台阶段（数据未显示）。斑贴试验和抑制剂分析确定TRPM7是Ca的通道2+流入（TRPM7通道功能的详细分析将在别处发布；Langeslag等，手稿正在准备中）。最后，与TRPM7-WT相比，BK对激酶头TRPM7-D1775A的通道激活没有改变(图1B和C)证明了TRPM7激酶活性对BK诱导的Ca不需要2+大量涌入。从这些结果中，我们得出结论，TRPM7作为BK调节的钙发挥作用2+N1E-115细胞中的通道。

TRPM7表达促进细胞扩散并增加细胞与基质的粘附

小鼠N1E-115神经母细胞瘤细胞是研究肌动球蛋白收缩性调节的良好模型系统，因为激活收缩或促进松弛的信号分别迅速转化为细胞圆形或细胞扩散反应(贾林克等, 1994;范·列文等, 1997,1999). 与TRPM7在肌动球蛋白调节中的作用一致，与亲代细胞相比，N1E-115/TRPM7细胞的扩散增强(图2A和B). 除了对细胞扩散的影响外，TRPM7的低过表达增加了N1E-115细胞的细胞-基质粘附(图2A和C). TRPM7的两种作用均不依赖于激酶活性，表明钙2+-依赖性机制解释了亲代和TRPM7转导细胞之间的形态学差异。

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TRPM7过表达诱导细胞扩散并增加细胞粘附。(A类)对照组、表达N1E-115细胞的TRPM7-WT和TRPM7-D1775A的相控图像。比例尺=50μm。(B类)N1E-115细胞覆盖的细胞表面积表达WT和激酶头TRPM7。对细胞进行F-actin染色，通过量化超过阈值的像素数量计算细胞表面积(n个>5). (C类)表达WT和激酶缺失TRPM7的N1E-115细胞的细胞粘附定量(n个=3). 重大差异(*)是P（P）在对照N1E-115细胞中获得的值<0.01。

TRPM7激活导致足小体形成

鉴于TRPM7对细胞形态和粘附的影响，我们通过共焦显微镜进一步研究了低水平TRPM7过度表达和激活对F-actin、肌球蛋白IIA和vinculin亚细胞分布的影响(图3A). 对照N1E-115细胞显示F-actin和肌球蛋白IIA主要分布在皮层，很少或没有局部粘连或应力纤维。在BK诱导的细胞扩散后，该外周肌动球蛋白的一部分丢失，而现在可以通过vinculin染色在细胞外周观察到小的局灶性粘连。在N1E-115/TRPM7细胞中，观察到肌动球蛋白的深度再分配。与亲代细胞相比，未刺激细胞中已经存在局部粘连，而肌球蛋白IIA分散地染色细胞质。BK刺激导致细胞进一步扩散，增加粘附复合物的数量和大小。这些反应在2分钟内显著，在BK刺激后约10分钟达到峰值(图3B和补充电影1). 这些粘附结构的结构和大小（～1μm）与在未刺激细胞中观察到的局灶性粘附显著不同，与足小体的局灶粘附相似(Linder和Aepfelbacher，2003年). 与足小体类似，TRPM7诱导的粘附位于细胞和基质的界面，直径约为1μm。此外，它们由一个肌动蛋白核组成，肌动蛋白核心周围环绕着小丘蛋白和明显的肌球蛋白晶格，这些晶格不再与肌动蛋白应激纤维相关(图3C). 因此，我们得出结论，TRPM7激活促进足小体的形成。

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激活TRPM7可诱导肌动球蛋白重组和足小体形成。(A类)TRPM7激活诱导N1E-115/TRPM7细胞中肌动球蛋白重组和足小体形成。细胞要么被血清饥饿（0.1%FCS），要么被BK刺激（10 nM，30 min），并被肌动蛋白（红色）、肌球蛋白IIA重链（绿色）和维酮（蓝色）染色。通过共焦显微镜分析细胞。比例尺=20μm。(B类)N1E-115/TRPM7细胞在BK刺激后几分钟内，细胞表面积增加，足小体产生。在BK刺激前后通过共焦显微镜观察表达GFP-β-actin的N1E-115/TRPM7细胞。按照材料和方法中的描述测量细胞表面积。使用公共领域软件Image J（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）的Fire LookUpTable（LUT）显示灰度值。左侧面板，休息细胞；中间面板，相同细胞在BK刺激后12分钟；右侧面板，BK诱导的细胞扩散动力学。电影提供为补充数据.比例尺=15μm。(C类)BK刺激后在N1E-115/TRPM7细胞中发现的肌球蛋白晶格的高倍放大。用GFP-肌球蛋白转染N1E-115/TRPM7细胞，用BK刺激并染色肌动蛋白。比例尺=2μm。

TRPM7存在于靠近细胞粘附结构的细胞表面

为了检测TRPM7是否会局部影响细胞粘附，我们用免疫荧光法研究了TRPM7的细胞分布。TRPM7明显存在于膜皱褶中，表明该蛋白定位于细胞表面(图4A). 此外，TRPM7与肌球蛋白IIA一起存在于足小体环结构中，富含细胞粘附(图4B和C). 我们的结果表明，TRPM7通过直接影响这些结构中的成分来调节细胞粘附。

TRPM7诱导足小体由激酶依赖机制介导

虽然TRPM7对细胞扩散和粘附的整体影响似乎与激酶活性无关，但我们测试了TRPM7激酶结构域是否影响肌动球蛋白细胞骨架的亚细胞组织。通过共焦显微镜，我们比较了表达TRPM7-WT的N1E-115细胞和表达激酶缺失TRPM7-D1775A突变体的细胞。未刺激细胞之间未发现明显差异（数据未显示）。然而，令我们惊讶的是，表达激酶头TRPM7的细胞未能诱导足小体对BK刺激作出反应(图5). 我们得出结论，TRPM7激活导致肌动球蛋白细胞骨架的激酶依赖性重塑，导致足小体的组装。

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TRPM7对足小体形成的调节依赖于激酶。用BK（10 nM，30 min）刺激N1E-115/TRPM7-WT和N1E-115/TRPM7/D1775A细胞，并对肌动蛋白（红色）、肌球蛋白IIA重链（绿色）和维库林（蓝色）进行染色。通过共焦显微镜分析细胞。比例尺=20μm。

肌球蛋白II功能的抑制导致在表达野生型和激酶缺失型TRPM7的细胞中形成足小体

肌动球蛋白的收缩性在调节粘附接触的组装和拆卸中起着核心作用(Geiger和Bershadsky，2002年). 值得注意的是，足小体的形成需要局部抑制肌动球蛋白的收缩性，这表明TRPM7可能通过促进肌动球酶细胞骨架的松弛来调节足小体组装(Burgsteller和Gimona，2004年). 为了进一步验证该模型，我们研究了直接抑制肌球蛋白II功能对表达TRPM7-WT和TRPM7-D1775A的N1E-115细胞粘附的影响。用blebbistatin（肌球蛋白II ATP酶活性的一种选择性抑制剂）处理细胞，导致局部粘连转变为独立于TRPM7激酶活性的足小体(图6A). 由于亲代N1E-115细胞也会产生足小体来响应肌球蛋白II的抑制，因此，布利司他丁的这些作用并不需要外源性TRPM7(补充图S4). 值得注意的是，布利司他丁处理后形成的粘附结构与BK刺激N1E-115/TRPM7-WT细胞后形成的结构非常相似(图6B). 这些发现表明，通过BK介导的TRPM7激活，正常局灶性粘连转变为足小体是由于激酶依赖性抑制肌球蛋白II功能。

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表达TRPM7-WT和TRPM7-D1775A的N1E-115细胞中肌球蛋白II功能的抑制导致足小体的形成。(A类)将N1E-115/TRPM7-WT和N1E-115/TRPM7-D1775A细胞在载体对照或50μM blebbistatin存在下孵育30分钟。对细胞进行肌动蛋白（红色）、肌球蛋白（绿色）和长春花蛋白（蓝色）染色，并通过共聚焦显微镜观察。比例尺=15μm。(B类)高倍镜显示，BK和blebbistatin在N1E-115/TRPM7-WT细胞中诱导的粘附复合物在结构上是相似的，因为它们由肌动蛋白密集的核心组成，周围是长春新碱和肌球蛋白IIA的环。比例尺=5μm。

TRPM7与肌动球蛋白细胞骨架相互作用

由于TRPM7是α-激酶家族的成员，我们假设它可能通过直接偶联到肌动球蛋白细胞骨架中存在的潜在磷酸化成分而影响肌动球球蛋白重塑和足小体组装。因此，我们用抗HA抗体沉淀TRPM7复合物，并通过Western blotting检测相关蛋白的存在。β-肌动蛋白和肌球蛋白IIA重链均存在于与TRPM7的复合物中(图7A). 重要的是，内源性TRPM7也与肌动球蛋白细胞骨架相关(图7B). 这种相互作用确实表明，TRPM7可以通过与细胞骨架蛋白的直接联系影响肌动球蛋白的功能。

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TRPM7激活通过COOH末端以钙和激酶依赖的方式促进其与肌动球蛋白细胞骨架的联系。在所有实验中（除B组外），将N1E-115对照细胞或TRPM7转导的细胞裂解，并在4℃下与抗-HA偶联蛋白G珠孵育3 h。通过Western blotting检测复合物中的蛋白质。(A类)TRPM7与β-肌动蛋白和肌球蛋白IIA的共免疫沉淀。Top，用抗HA抗体检测TRPM7；中间和底部，分别检测免疫复合物（IP，左）和总裂解物中的肌球蛋白IIA和β-肌动蛋白，以控制蛋白质水平（TL，右）。(B类)内源性TRPM7与肌动球蛋白细胞骨架相关。PC12裂解物与免疫前血清或抗TRPM7血清孵育，并使用蛋白G-Sepharose分离蛋白复合物。Western blotting检测肌球蛋白IIA的存在。Top，检测免疫沉淀物中的相关肌球蛋白IIA重链；底部，检测总裂解物中的相关肌球蛋白IIA重链。(C类)用肌球蛋白IIA重链在BK刺激前后共免疫沉淀TRPM7（10 nM，1 min）。Top，检测共免疫沉淀肌球蛋白IIA；中间，用抗HA抗体检测TRPM7；底部，检测总裂解物中的肌球蛋白IIA重链，以控制蛋白质水平。(D类)BK诱导的TRPM7与肌球蛋白IIA重链结合的动力学。用BK（10 nM）刺激细胞达到指定时间，并使用抗HA抗体免疫沉淀TRPM7。Top，Western blot显示共免疫沉淀肌球蛋白IIA重链；底部，检测总裂解物中的肌球蛋白IIA重链。(E类)TRPM7与肌球蛋白IIA重链Ca的相互作用2+依赖。在细胞裂解之前，用10 mM BAPTA或EDTA预孵育N1E-115/TRPM7细胞1分钟，并使用抗HA抗体免疫沉淀TRPM7。(F类)TRPM7-D1775A不与肌球蛋白IIA重链相互作用。用抗HA抗体免疫沉淀TRPM7-WT和-D1775A，Western blotting检测相关肌球蛋白IIA重链。(G公司)TRPM7的COOH末端与肌球蛋白IIA相互作用。用抗HA抗体从N1E-115/TRPM7-C细胞中免疫沉淀TRPM7的可溶性COOH末端（aa 1158–1864），并通过蛋白质印迹检测相关肌球蛋白IIA。顶部，相关肌球蛋白IIA重链的检测；底部，使用免疫沉淀物（IP，左）和总裂解物（TL，右）中的抗HA抗体检测TRPM7-C。

缓激肽导致TRPM7 COOH末端与肌球蛋白IIA的钙和激酶依赖性结合

BK激活TRPM7导致Ca2+我们研究了TRPM7和肌动球蛋白细胞骨架之间的相互作用是否受到调控。BK刺激N1E-115/TRPM7细胞导致TRPM7-相关肌球蛋白IIA的量短暂增加(图7C和D). 其动力学与TRPM7激活后钙内流的动力学密切相关（参考图1)在添加激动剂后约2分钟观察到最大关联。此外，钙的螯合作用2+使用BAPTA或EDTA，消除TRPM7和肌球蛋白IIA之间的关联(图7E). 这些结果表明，TRPM7和肌球蛋白IIA之间的相互作用严格为钙2+并提示TRPM7介导的钙2+内流增强了TRPM7/肌球蛋白IIA的相互作用。然而，除了Ca2+TRPM7与细胞骨架的关联需要一个活性激酶结构域，因为激酶头TRPM7-D1775A突变体不与肌球蛋白IIA相互作用(图7F). 含有TRPM7激酶结构域的可溶性COOH末端变体也与肌球蛋白IIA相互作用(图7G). 因此，我们得出结论，TRPM7和肌球蛋白IIA之间的相互作用是由COOH末端介导的，需要一个活性激酶域。

TRPM7磷酸化肌球蛋白IIA重链

迄今为止，我们已经证明TRPM7以调节方式与肌球蛋白IIA相关，并且TRPM7-WT（但不是TRPM7-D1775A）的激活和肌球蛋白II功能的抑制都会产生足小体，这表明TRPM7的激活促进了肌球蛋白的松弛。TRPM7如何介导肌球蛋白II功能的抑制？通过类比粘液菌肌球蛋白II的功能，我们先前提出Ca2+-依赖性MHC磷酸化促进细胞骨架松弛(范·列文等, 1999). TRPM7与肌球蛋白IIA共沉淀的发现，特别是在BK刺激后，使我们能够测试TRPM7是否能磷酸化肌球蛋白II A重链。当TRPM7和肌球蛋白IIA重链在SDS–PAGE凝胶上共同迁移时，TRPM7在有利于细胞骨架复合体结合和分离（低强度与高强度）的条件下被免疫沉淀，使我们能够区分TRPM7的自磷酸化和肌球酶磷酸化。签署人在体外激酶分析，TRPM7进行了自我磷酸化，与早期发现一致(跑步者等, 2001;施密茨等, 2003;梁赞诺瓦等, 2004) (图8A，底部面板）。引人注目的是，在这些激酶反应中还观察到相关肌球蛋白IIA重链（其运行速度略快于TRPM7）的明确磷酸化(图8A，底部面板）。相反，肌动蛋白没有磷酸化（数据未显示）。

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TRPM7磷酸化肌球蛋白IIA重链。(A类)体外用TRPM7检测相关肌球蛋白IIA重链磷酸化的激酶分析。在低（1%Triton X-100）和高（1%Trion X-100/0.5%脱氧胆酸盐/0.1%十二烷基硫酸钠）的严格条件下，用BK（10 nM，2 min）刺激N1E-115对照细胞和N1E-115/TRPM7细胞前后，分离出TRPM7/肌球蛋白IIA重链复合物。用[γ]标记蛋白质检测TRPM7底物-32P] ATP，分离产品在体外通过SDS-PAGE（6%凝胶）进行激酶分析，然后进行放射自显影。Top，沉淀蛋白的考马斯染色；底部，磷酸化蛋白的放射自显影。请注意，肌球蛋白结合在高严格条件下（1%Triton X-100/0.5%脱氧胆酸盐/0.1%十二烷基硫酸钠）丢失，而TRPM7自身磷酸化不受影响。(B类)TRPM7磷酸化重组肌球蛋白IIA。TRPM7-WT和-D1775A是使用抗HA抗体在高强度下从HEK293细胞中纯化的免疫亲和性，并在激酶缓冲液中与2μg GST或GST-肌球蛋白IIA混合。为了检测磷酸化肌球蛋白IIA，用SDS-PAGE（12%凝胶）分离蛋白质，然后放射自显影。顶部，GST融合蛋白的考马斯染色。请注意，GST与抗体轻链（Ig LC）共迁移。磷酸化GST融合蛋白的中间自射线照片。底部，放射自显影显示WT的自动磷酸化，但不显示激酶读取TRPM7。(C类)重组TRPM7激酶磷酸化肌球蛋白IIA。TRPM7激酶结构域（aa 1403-1864）产生于大肠杆菌与麦芽糖结合蛋白融合并在直链淀粉柱上纯化。纯化的激酶在激酶缓冲液中与2μg GST或GST-肌球蛋白IIA孵育。蛋白质在12%SDS-PAGE凝胶上溶解，并通过考马斯染色检测。通过放射自显影术观察磷酸化蛋白。左，凝胶考马斯染色；对，放射自显影。

为了证明TRPM7直接磷酸化肌球蛋白IIA重链，肌球蛋白尾部片段在大肠杆菌作为底物，而TRPM7是从哺乳动物细胞中纯化的免疫亲和性或TRPM7的COOH末端是从大肠杆菌.英寸在体外激酶分析，免疫亲和纯化的WT，而不是有效磷酸化重组肌球蛋白IIA的激酶死亡TRPM7(图8B). 值得注意的是，GST未被TRPM7磷酸化(图8B). 当使用TRPM7的可溶性COOH末端时，也获得了类似的结果（数据未显示）。重要的是，纯化的TRPM7组分中的污染肌动蛋白低于检测水平，并且在TRPM7纯化之前肌动蛋白细胞骨架的破坏对肌球蛋白II磷酸化水平没有影响，这与存在污染激酶的说法相矛盾(补充图S5). 最后，从大肠杆菌在缺乏其他真核蛋白来源的情况下，裂解物也能有效磷酸化肌球蛋白IIA(图8C). 因此，TRPM7本身而不是相关激酶负责肌球蛋白IIA重链磷酸化。总之，我们的结果表明，TRPM7与Ca中的肌动球蛋白细胞骨架相关2+-和激酶依赖性方式来调节肌球蛋白II活性，从而调节肌动球蛋白收缩性。此外，我们的在体外激酶数据表明，TRPM7对肌球蛋白IIA重链的磷酸化是一种调节机制。

讨论

在这项研究中，我们通过类比其α-激酶家族成员，验证了TRPM7的假设粘液菌影响肌动球蛋白的收缩力。我们提供证据表明，TRPM7通过肌球蛋白II的激酶依赖性抑制促进肌球蛋白细胞骨架的松弛，可能涉及肌球蛋白IIA重链磷酸化。证据包括（i）BK刺激后TRPM7通道开放的电生理测量，（ii）TRPM7复合体的生化分析表明，TRPM7在Ca2+-与肌动球蛋白复合物的激酶依赖方式，（iii）在体外激酶反应表明TRPM7磷酸化肌球蛋白IIA重链，（iv）细胞生物学研究表明，TRPM7通过激酶依赖机制促进皮质张力的丧失，导致足小体的形成。总之，我们的数据表明，TRPM7在将受体介导的信号与肌动球蛋白重塑和细胞粘附联系起来方面发挥了作用。此外，我们的观察首次揭示了TRP通道通过以高度调节的方式直接与细胞骨架蛋白结合来影响细胞骨架。

通道开放与激酶结构域之间的关系是什么？一些研究表明，激酶活性调节TRPM7通道开放(跑步者等, 2001;施密茨等, 2003). 然而，在我们的模型系统中，TRPM7通道开放与激酶活性无关，因为表达WT的细胞和激酶缺失TRPM7的细胞对BK刺激的反应是相同的。虽然TRPM7激酶活性并不直接影响通道开放，但不能排除肌动球蛋白重塑以间接方式调节TRPM7功能，正如其他TRP通道所报道的那样(洛克威奇等, 2001;板垣等, 2004). 根据我们的观察，与调节TRPM7通道功能的激酶结构域相反，存在相反的关系。在此模型中(图9)，下游靶点的磷酸化（肌球蛋白II、膜联蛋白I；Dorovkov和Ryazanov，2004年)TRPM7激酶结构域受离子内流（Ca2+，镁2+)通过TRPM7信道。为了支持这个模型，我们观察到Ca2+严格要求TRPM7与细胞骨架结合，增加Ca2+激动剂诱导激活时通过TRPM7的内流增强了其与肌球蛋白IIA的关联，MHC磷酸化严格来说是钙2+从属的(范·列文等, 1999). 最近，Dorovkov和Ryazanov（2004）表明TRPM7对膜联蛋白I的磷酸化作用增强在体外通过添加钙2+相反，被Ca的螯合作用抑制2+因此，我们提出通过通道孔的离子内流通过控制其底物的募集来调节TRPM7激酶结构域。

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TRPM7对肌动球蛋白收缩力的调节。(A类)在静息状态下，TRPM7与肌动球蛋白细胞骨架无关（1）。(B类)用PLC激活激动剂刺激细胞诱导TRPM7介导的钙2+内流（2）以及TRPM7激酶活性。自磷酸化（3）促进TRPM7内的构象变化，允许钙2+-与肌球蛋白IIA的依赖性关联（4）。(C类)随后，TRPM7磷酸化肌球蛋白IIA重链，可能导致肌球蛋白丝分离和细胞骨架重塑（5）。

激酶通过分子内和分子间蛋白质-蛋白质或蛋白质-脂质的相互作用保持活性状态(Van Etten，2003年;罗斯科斯基，2004). 激酶的激活通常涉及调节位点的自磷酸化或转磷酸化，诱导构象重塑，使催化域暴露于底物。我们假设TRPM7也受到类似的调节，因为其激酶活性似乎对其与肌动球蛋白细胞骨架的联系至关重要。TRPM7的自磷酸化，发生在丝氨酸和苏氨酸残基上(施密茨等, 2003;梁赞诺瓦等, 2004)，可能释放肌球蛋白IIA重链的隐秘结合位点(图9). 因此，TRPM7的自磷酸化可能是调节TRPM7与其底物相互作用的重要调控机制。

TRPM7激活的一个功能后果是细胞粘附和扩散增加，这涉及激酶依赖性和独立性途径。TRPM7激酶突变体的表达仍能促进细胞粘附和扩散，但不会在BK刺激下导致足小体的形成。事实上，TRPM7对细胞形态的整体影响独立于激酶活性或其与细胞骨架的关联，这可能反映了细胞溶质钙的增加2+在TRPM7转导细胞中观察到的浓度。的确，减少体内钙2+BAPTA-AM降低细胞扩散的浓度（数据未显示）。钙2+可能直接作用于整合素激活水平或影响肌动球蛋白细胞骨架。整合素的激活可导致肌动球蛋白细胞骨架的重塑，从而通过外部信号通路促进细胞扩散(德马里等, 2003). 或者，Ca2+是肌动蛋白重塑的重要第二信使，包括聚合、断丝和F-肌动蛋白-膜相互作用(福舍尔，1989年;太阳等, 1999). 此外，由于TRPM7可以直接与PLC亚型相互作用，它可能影响PIP2的局部浓度，从而影响肌动蛋白聚合(van Rheenen和Jalink，2002年).

TRPM7对细胞粘附的激酶依赖性作用与调节肌球蛋白IIA依赖性收缩反应的作用一致。值得注意的是，N1E-115/TRPM7细胞的BK刺激和肌球蛋白II抑制均诱导大足小体的形成。肌动球蛋白收缩力的时空调节对调节局部粘连和足小体的组装和拆卸至关重要(盖革和伯沙斯基，2002年;马里等, 2003;Linder和Aepfelbacher，2003年;Burgstaler和Gimona，2004年;Burridge和Wennerberg，2004年). 虽然收缩力的局部调节似乎由Rho GTPases控制(Burgsteller和Gimona，2004年)，α激酶也可能在肌球蛋白II活性的时空调节中发挥作用。事实上，在细胞表面表达的TRPM7富含细胞粘附结构。根据相似性，粘液菌肌球蛋白II的功能由MHC激酶家族精确调节，每个成员具有独特的空间分布(梁等, 2002). 因此，我们假设TRPM7介导的MHC磷酸化的增加有助于皮质细胞骨架的局部松弛，导致局部粘连转变为足小体。TRPM7激酶活性的消融可以维持肌球蛋白为基础的细胞骨架收缩能力，防止局部粘连的重组。因此，TRPM7通过以激酶依赖的方式调节肌动球蛋白的收缩性来调节细胞黏附，很容易推测这一现象是通过MHC磷酸化来实现的。

如何协调TRPM7表达的微小增加（两倍）与细胞形态和对BK反应的剧烈变化？尽管TRPM7的激酶活性与浓度呈线性关系在体外，它很可能不是线性的体内因为蛋白质会受到调控。为了支持这一假设，我们发现TRPM7通道通过斑贴灯和钙离子测定增加了活性2+N1E-115/TRPM7细胞的荧光测定实验。应该注意的是，基础钙2+TRPM7过度表达后，细胞中的水平显著升高，这可能影响其底物的磷酸化Dorovkov和Ryazanov（2004）此外，TRPM7介导的钙2+内流通过与肌动球蛋白细胞骨架结合，影响激酶底物的募集。因此，可以预计N1E-115/TRPM7细胞中TRPM7复合物的活性体内显著高于观察到的激酶活性的两倍增加在体外最后，如果TRPM7靶向细胞骨架的特定部分，包括细胞粘附结构，那么TRPM7激酶的局部活性很可能在细胞的这些区域显著增加两倍以上。

BK刺激N1E-115细胞导致细胞扩散和局部粘附形成，而促进N1E-115/TRPM7细胞中局部粘附转化为足小体。虽然N1E-115细胞表达内源性TRPM7，但这些细胞不会对BK产生足小体反应。我们认为这些结果反映了细胞的收缩状态，并且有必要过度表达TRPM7以实现BK介导的足小体形成所需的肌动球蛋白细胞骨架的完全松弛（参见补充图S6). 在亲代N1E-115细胞中，肌球蛋白II非常活跃，导致收缩表型。BK刺激这些细胞可以放松细胞骨架，但由于形成了局部粘连，肌球蛋白II必须至少部分激活，因为局部粘连生物发生需要张力(Geiger和Bershadsky，2002年). TRPM7的过度表达模拟了这些作用，而BK刺激这些细胞会导致肌球蛋白II的进一步抑制和肌动球蛋白细胞骨架的松弛，从而形成足小体（粘附结构，需要抑制肌球蛋白Ⅱ的形成；Burgsteller和Gimona，2004年). 为了支持这一模型，在亲代N1E-115细胞中，布利司他丁对肌球蛋白II的抑制同样会诱导足小体(补充图S4). 因此，由于TRPM7具有基础活性，其表达水平决定了肌球蛋白II的活性，从而决定了细胞表型。

虽然哺乳动物的非肌肉肌动球蛋白收缩性似乎主要由肌球蛋白调节轻链的磷酸化调节，但MHC磷酸化的作用正在显现。几项研究表明，在刺激哺乳动物细胞时，MHC尾部在苏氨酸残基上磷酸化(威尔逊等, 1998;范·列文等, 1999). 基于同源性粘液菌MHC激酶，我们假设TRPM7可能通过磷酸化MHCα螺旋尾来调节肌球蛋白II的功能。的确，在体外激酶分析表明，WT而非激酶头TRPM7直接磷酸化MHC尾部，表明在底物和功能方面存在广泛的进化保护，这是一个意外的结果，因为其他α激酶，α激酶1和EF2K，分别调节蛋白质运输和蛋白质合成(梁赞诺夫，2002;海涅等, 2005).

肌球蛋白II通过MHC尾部的静电相互作用形成双极粗丝(主持人等, 2004). 在粘液菌，α螺旋MHC尾部的磷酸化导致纤维分解，从而释放皮层张力(埃格尔霍夫等, 1993). TRPM7对哺乳动物肌球蛋白II重链的磷酸化是否会对纤维组装产生类似影响尚待确定(图9C). 重要的是，TRPM7磷酸化的肌球蛋白II区域对应于负责调节肌球蛋白丝组装的结构域(中泽一郎等, 2005). 此外，PKC和酪蛋白激酶的磷酸化以及影响该结构域内静电电荷（E1841K）的点突变影响肌球蛋白II的功能(杜利亚尼诺娃等, 2005;法兰克等, 2005). 因此，我们认为肌球蛋白IIA尾部这一区域的磷酸化影响肌球蛋白II的丝状形成，而不是ATP酶活性。未来的研究旨在绘制肌球蛋白IIA重链内的TRPM7目标残基，并定义MHC磷酸化的生理相关性，将进一步深入了解哺乳动物细胞中肌动球蛋白收缩性的机制。

总之，我们确定TRPM7是一种新的调节肌动球蛋白收缩力和细胞粘附的调节器，以响应激动剂的刺激。此外，我们已经证明TRP通道可以与肌动球蛋白细胞骨架相互作用，影响细胞粘附。未来的实验将旨在确定含TRPM7的蛋白组合在调节肌动球蛋白功能中的作用，并确定这些细胞骨架变化如何影响细胞粘附和/或TRPM7功能。

材料和方法

构件

pTracer-CMV2中的小鼠TRPM7和pEGFP-C3中的GFP-肌球蛋白IIA分别是David Clapham（哈佛、波士顿、马萨诸塞州、美国）和Robert Adelstein（NIH、贝塞斯达、马里兰州、美国）赠送的礼物。已在TRPM7的COOH终端插入HA标签(跑步者等, 2001). 为了生成逆转录病毒表达载体，将TRPM7 cDNA作为Xho公司我–不是I片段进入LZRS-ires-新霉素载体。激酶缺失突变体TRPM7-D1775A是使用Quickchange试剂盒（Stratagene）通过定点突变产生的。可溶性TRPM7 COOH末端构建体编码aa 1158–1864，并在NH处含有HA标签2-终点。该cDNA通过PCR扩增并作为Xho公司我–不是I片段进入LZRS-ires-新霉素载体。GFP-β-actin cDNA作为生态RI公司–不是I片段进入LZRS-ires-新霉素载体。通过RT-PCR从N1E-115细胞中扩增小鼠肌球蛋白IIA重链尾（aa 1795-1960），并使用巴姆夏威夷群岛–环保RI站点。pMAL-p2x中的TRPM7激酶结构域（aa 1403-1864）如前所述(梁赞诺瓦等, 2004). 所有结构均通过DNA测序进行验证。

细胞培养

小鼠N1E-115、HEK293和Phoenix包装细胞在含有10%FCS的DMEM培养基中培养，而PC12细胞则在含有10%马血清和5%FCS的RPMI培养基中生长。通过逆转录病毒转导产生表达各种TRPM7结构和GFP-β-actin的稳定细胞系(范·列文等, 1999). 用空载体转导的N1E-115细胞作为所有实验的对照。通过向培养基中添加0.8 mg/ml G418来选择细胞，并在7天内完成选择。对于瞬时表达，根据制造商的建议，使用Fugene 6（Roche）转染细胞。

细胞内钙测定

通过共焦比例成像法对细胞进行钙测量，该细胞装载了俄勒冈州绿488 BAPTA-1 AM和呋喃红AM（分子探针），基本上如所述(希尔德等, 1994). 实验在37°C的HEPES/碳酸氢盐缓冲盐水中进行，5%CO2pH值7.3（140 mM NaCl，23 mM NaHCO三，5 mM氯化钾，2 mM氯化镁2，1 mM氯化钙210 mM HEPES，10 mM葡萄糖），使用离子霉素（钙生物化学）进行校准。显示了至少10倍实验中的代表性痕迹；数据为平均值±标准误差。

粘附力测定

电池（5×105)接种在T25烧瓶中，并让其粘附16 h。为了定量细胞粘附，用PBS冲洗非粘附细胞。粘附细胞在3.7%甲醛中PBS中固定10 min，然后用PBS洗涤，然后用2%结晶紫染色50 min。通过在PBS中大量洗涤去除多余的染色。在含有1%NP-40的PBS中溶解细胞，并测量溶解液在570nm处的吸光度。聚乙烯上测得的最大附着力-L（左）-赖氨酸涂层的培养皿设置为100%。报告的数值代表了两个独立实验，一式三份。

显微镜检查

接种在玻璃盖玻片上的细胞在用BK或抑制素（Calbiochem）刺激前隔夜血清饥饿（0.1%FCS）。对于固定的标本，细胞如前所述进行染色(范·列文等, 1997). 用于免疫荧光的抗体为大鼠抗HA（3F10；1:100；Roche）、小鼠抗小病毒素（1:400；Sigma）、兔抗肌球蛋白IIA（1:100；BTI）、alexa 488-结合抗兔和抗鼠IgG以及alexa 647-结合抗鼠Ig G（1:200；分子探针）。用德克萨斯红或亚历克赛546标记的卵磷脂（1:50；分子探针）检测F-actin。使用配备Plan-Apochromat×63，1.4 NA浸油透镜的Zeiss-LSM 510-meta显微镜或配备×63，1.32 NA浸油镜的Leica-DMRA显微镜观察细胞。对于视频显微镜，细胞被转移到如上所述的碳酸氢盐缓冲介质中，并在37°C的温度和CO下保持2-受控阶段。使用配备TCS-SP2扫描头和×63，1.32 NA浸油透镜（徕卡）的DM-IRE2倒置显微镜对细胞进行成像。以30秒的时间间隔收集图像，并通过量化阈值步后使用二进制填充操作构建的数字掩模下的像素数量来计算表面积。

抗TRPM7抗体的产生

为了产生抗TRPM7抗体，在大肠杆菌并在谷胱甘肽-脑葡萄糖柱上纯化。将混合了弗氏佐剂的抗原注射家兔，每次接种后10天收集血清。免疫前收集的血清用作所有实验的阴性对照。

免疫沉淀

如图图例所示，细胞在刺激前隔夜血清饥饿（0.1%FCS）。刺激后，在裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，300 mM NaCl，0.5 mM DTT，1.5 mM MgCl）中在冰上裂解细胞20分钟2，0.2 mM EDTA，1%Triton X-100，补充蛋白酶抑制剂），通过离心清除提取物。为了免疫沉淀外源性表达的TRPM7，将蛋白G-Sepharose珠添加到N1E-115/空载体（对照）或N1E-115/TRPM7细胞的裂解液中，该蛋白G-Separose珠被0.5%BSA阻断，并与抗HA抗体（克隆12CA5）预偶联。样品在4°C下孵育3 h。通过将细胞裂解物与抗TRPM7抗体在4℃孵育3h，然后在4℃添加蛋白G-Sepharose珠15 min，免疫沉淀内源性TRPM7。随后，用裂解缓冲液洗涤珠三次，蛋白质复合物在Laemmli样品缓冲液中溶解并通过SDS-PAGE分离。使用以下抗体通过免疫印迹法检测蛋白质：抗HA（克隆3F10；1:1000）、抗肌球蛋白IIA（1:500）和抗β-肌动蛋白（1:20000；Sigma）。

体外激酶测定

重组TRPM7激酶结构域（aa 1402–1864）和肌球蛋白尾部片段（aa 1795–1960）分别表达为麦芽糖结合蛋白和GST融合蛋白大肠杆菌并用标准方法纯化。含有TRPM7的免疫复合物（含或不含相关肌球蛋白）或与2μg GST-肌球蛋白混合的TRPM7在激酶缓冲液中溶解（50 mM HEPES pH 7.0，4 mM MnCl2，5 mM DTT），无ATP。激酶反应是通过添加0.1 mM ATP和5μCi[γ-32P] ATP并在30°C下持续30分钟。激酶反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行检测。

统计分析

所有数据均代表至少三个独立实验。定量数据表示为平均值±标准偏差。使用Student’st吨-测试。如果P（P）<0.05.

补充材料

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补充电影

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补充数据-图S1

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补充数据-图S2

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补充数据-图S3

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补充数据-图S6

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致谢

我们感谢David Clapham、Loren Runnels和Robert Adelstein提供DNA构建。我们感谢Nannette Teunissen提供的技术援助和Frank de Lange在共焦显微镜方面的帮助。我们还感谢威尔詹·亨德里克斯和埃里克·达宁批判性地阅读了这份手稿。这项工作得到了荷兰癌症协会（WHM，FL，CF；NKB 2002-2593）的资助。

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