中的突变Mcoln3公司与耳聋和变形金刚的色素沉着缺陷(弗吉尼亚州)老鼠

物理地图。

通过筛选ES-129/SvJ I构建物理图（Incyte Genomics，加利福尼亚州帕洛阿尔托）和C57BL/6J RPCI-23（罗斯韦尔公园癌症研究所）小鼠细菌人工染色体（BAC）库。我们用PCR和侧翼重组标记(D3Mit85型,D3Mit260型,D3Mit259型、和D3密特292). BAC端的探针ES-129/SvJ I BAC克隆用于筛选RPCI-23杂交文库。BAC克隆通过限制性试验确定大小内切酶消化不是I（NEB）后接Chef-DRII仪器上的脉冲场凝胶电泳（生物雷达）。我们使用载体特异性引物对BAC末端进行测序BigDye终止剂化学（应用生物系统）和ABI 377测序器（应用生物系统）。为了确认并确定Sp6和T7的方向最后，我们开发了序列标记位点（STS）、引物集和从BAC克隆的末端序列中提取探针，并将其映射到预测弗吉尼亚州^J型使用的物理间隔PCR交叉筛选实验和Southern印迹杂交。单个BAC克隆之间的重叠通过指纹识别得到确认具有Hin公司dIII和/或生态RI单或双消化。

基因鉴定和突变分析。

RP23-108E10和RP23-121J1 BAC克隆的草图序列为由阿尔伯特·爱因斯坦分子遗传学系生成医学院基因组中心，通过transnih公司美国银行排序程序(www.nih.gov/science/models/bacsequencing)和发布到GenBank（加入编号。AC068947型和AC079941型).爆炸用这些基因组搜索EST数据库序列鉴定出一组小鼠EST，与全长人cDNA克隆AK001868号.获得同源小鼠序列，我们测序了最长的EST克隆AI787597型和AA756265型.我们设计了引物并对其进行了RT-PCRC57BL/6J衍生脑cDNA建立小鼠模型麦科尔3cDNA序列（GenBank登录号。AY083531号). 我们推断出它的基因组通过将小鼠和人类cDNA与基因组对齐来构建序列，使用序列比对分析搜索和DNA-Pustell矩阵对齐(macvector公司版本6.0，牛津分子）。为了鉴定突变野生型（C57BL/10J和C57BR/cdJ）和突变型(弗吉尼亚州/弗吉尼亚州和弗吉尼亚州^J型/弗吉尼亚州^J型) 菌株通过PCR外显子特异性产物扩增与侧翼内含子序列互补的引物对。PCR是使用Advantage cDNA聚合酶混合物（CLONTECH）进行根据制造商的说明。PCR产物为凝胶按照Qiagen（Chatsworth，CA）凝胶萃取试剂盒进行纯化协议和使用ABI 377上的BigDye化学进行测序自动定序器。通过以下方法比较野生型和突变型序列使用排序器版本3.0（基因代码，密歇根州安阿伯）软件。引物在弗吉尼亚州1255G→C突变如下：5′-1138-TCAACTATGCTTCGTGTGGC-3′（正向），5′-1312-GGTAAGGGCCCCACAAATCC-3′（反面）。扩增引物穿过弗吉尼亚州^J型1085T→C突变为如下：5′-970-CACTACAAGAGAGAGATTCGG-3′（正向），5′-内含子-GCCCAGAATTTTTCACAGTTGG-3′（反向）。要识别中的突变+/弗吉尼亚州^J型和弗吉尼亚州^J型/弗吉尼亚州^J型-衍生cDNA，poly（A）⁺RNA是从大脑和脾脏符合Oligotex Direct mRNA试剂盒协议（Qiagen），并通过使用寡聚（dT）引物逆转录SuperScript预放大系统（Invitrogen）。进行RT-PCR直接对out和结果产物进行测序。

磷灰石染色。

在Leibovitz的L-15培养基（Invitrogen）中解剖耳蜗导管来自野生型，弗吉尼亚州^J型、和弗吉尼亚州老鼠。导管在室内用4%多聚甲醛固定2小时进行温度和显微解剖以分离OC。组织在0.5%Triton X-100中的PBS中渗透30分钟，在PBS中洗涤两次10分钟，然后用2μg/ml染色在PBS中加入荧光素结合的卵磷脂（Sigma）20分钟在PBS中进行三次10分钟的清洗，使用ProLong安装样品防褪色试剂盒（分子探针），并通过激光扫描进行检查共焦显微镜（LSM 510，蔡司）。

免疫细胞化学。

获取Mcoln3抗体（GenBank登录号：。AY083531号), 对兔子进行免疫（宾夕法尼亚州丹佛市Covance Research Products）合成肽1，全日空航空公司₂-446-RVSECLFSLINGDDMFS-COOH和肽2，全日空航空公司₂-529-KDLPNSGKYRLEDDPPGSLL-COOH（普林斯顿生物分子，宾夕法尼亚州兰霍恩）。免疫细胞化学检测如下描述(14). 如上所述解剖OC。之后在0.5%Triton X-100中渗透30分钟，清洗样品在PBS中三次培养10分钟，并在5%正常山羊血清中培养（纽约州格兰德岛生命科技公司）和2%的BSA（ICN）2小时阻断非特异性结合位点。与……孵育后3–6μg/ml的初级抗体在封闭溶液中放置2h在室温下，在PBS和在1:200稀释的荧光素结合抗兔血清中孵育IgG次级抗体（乌普萨拉Amersham Pharmacia Biotech）40min。使用ProLong Antifade试剂盒安装样品用激光扫描共聚焦显微镜（LSM 510，蔡司）进行检查。免疫前血清和一级抗体的预孵育免疫原性肽作为阴性对照。一些样品是用罗丹明缀合的鬼笔肽染色肌动蛋白。我们获得了结果相同（图。​（图4）4)亲合力纯化（Covance Research产品）针对肽1的抗血清PB221和PB220，以及抗肽2的抗血清HL4559和HL4560（图。​（图44).

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图4。

Mcoln3在小鼠和大鼠OC中的定位免疫荧光。所示为通过OC的横截面，显示了Mcoln3的IHC标签。(A–E)P11处的鼠标OC，以及IHC细胞体水平的光学切片。在一一行IHC和三行OHC（1、2和3） 显示了。(一,D类、和E类)Mcoln3的PB221标签。IHCs的细胞质是野生型密集标记(一),+/弗吉尼亚州^J型(D类)、和弗吉尼亚州^J型/弗吉尼亚州^J型(E类); 与免疫前血清(B类)和过量的特异性肽(C类). 在细胞浆中也观察到一些标记职业健康保险(一,D类、和E类)、和角质板下（未显示）。(F类–J型)老鼠4周龄时的OC和水平的光学切片细胞体(F类–H（H）)和表皮板(我和J型)国际水文中心。全部四个反-Mcoln3公司抗血清，PB220(F类和我)、PB221(J型)，HL4459(G公司)、和HL4460型(H（H）)在细胞浆中显示出免疫反应国际控股公司。在细胞质中，标记以标点形式出现(*,我)在IHC机构中在皮下区域检测到（虚线，我),表皮上的项链（白色箭头，J型)和中的IHC束（白色箭头，J型). 全部的特异性在细菌表达部分Mcoln3融合蛋白（数据未显示）。立体纤毛染色在小鼠OC上也观察到（数据未显示）。（棒材，80μm）

这个弗吉尼亚州^J型临界间隔为350 kb包含三个基因。

先前进行的联动分析弗吉尼亚州到远端第3染色体(15)，我们最近改进了弗吉尼亚州^J型将位置映射到0.14厘米间隔(13). 要克隆弗吉尼亚州，我们建立了一个物理地图使用BAC克隆，跨越的物理距离估计不超过超过350 kb弗吉尼亚州^J型重组间隔（图。​（图2）。2). 两个重叠的BAC克隆（RP23–121J1和RP23–108E10），重组阳性选择侧翼标记进行样品测序。同源搜索根据这些克隆的基因组序列已知溶血磷脂酸受体基因，第7版(16)，一个小鼠全长mRNA{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AK014467”，“term_id”：“12852339”}}AK014467和几个重叠的小鼠EST表示先前未描述的cDNA。AK014467号和小鼠转录本具有显著的氨基酸相似性（67%和分别为73%）对人粘脂质-1的敏感性(MCOLN1型,AF249319型)后来被指定为Mcoln2号机组(AY083532型) 和Mcoln3公司(AY083531号)分别是。

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图2。

的物理地图弗吉尼亚州^J型批评的区域。粗水平灰线(底部)代表弗吉尼亚州^J型临界区间由多态性定义米特鼠标上的标记3号染色体。厘米摩根。由15个重叠的BAC克隆组成用水平线表示；RPCI-23 BAC克隆以蓝色显示，Incyte Genomics BAC克隆为黑色，BAC克隆用于样本测序结果为紫色。出现坐标和相应的尺寸每个BAC克隆旁边。BAC的SP6和T7端用S或T、 分别是。BAC端用于衍生用于筛选RPCI-23 BAC库用^表示。红色虚线表示PCR交叉筛选中使用的锚定SP6和T7 BAC末端和/或Southern blot实验以确认BAC之间的重叠克隆。在候选区域内映射的基因显示为指示转录方向的箭头。Mcoln3公司外显子指示。基因组克隆包含Mcoln2号机组和Mcoln3公司,AC068947型（RP23-108E10），以及AC079941型（RP23-121J1）。

粘蛋白-3(Mcoln3公司)对预测离子通道进行编码。

Mcoln3公司ORF为1662 bp，编码553 aa，预测分子量≈64 kDa（图5，即作为支持信息发布在PNAS网站上，网址：www.pnas.org). 推导出的氨基酸序列与与Mcoln2（77%）和Mcoln1（74%）的相似程度最高。二级结构分析预测Mcoln3含有六个具有短胞质氨基和羧基末端（图。​（图3三一). 序列基序分析确定离子转运域（Pfam00520）和一个瞬态受体-类电位（TRPL）基序（PS50272）S3和S6，以及S5和S6之间的假定孔隙区域（PS50273）（图。​（图3三B类). Mcoln3与果蝇属CG8743（63%）和秀丽线虫杯-5（55%）同源物显著，最高程度为在TRPL基序中观察到的保守性（74%和73%，分别）。Mcoln3与Pkd2和Pkd3的氨基酸序列比较TRP仅显示有限但显著的相似性（49%和32%，分别）（图。​（图3三B类).

Varitint-Waddler表型与麦科尔3.

所有12个编码外显子Mcoln3公司通过以下方法分析突变家蚕基因组DNA扩增PCR产物的序列分析突变体(弗吉尼亚州/弗吉尼亚州和弗吉尼亚州^J型/弗吉尼亚州^J型) 和对照菌株（C57BL/10J和C57BL/6J；图。​图3三C类). 这个弗吉尼亚州等位基因在第10外显子携带1255G→C颠倒导致Ala419Pro在第五个预测中被替换蛋白质的跨膜结构域（图。​（图3三 一和C类). 中的突变弗吉尼亚州^J型是一个外显子8的1085T→C转换导致Ile362Thr替代在第二个预测的细胞外循环中（图。​（图3三 一和C类). 有趣的是，我们还检测到1255G→C核苷酸变化弗吉尼亚州^J型，表明弗吉尼亚州^J型在顺式中兴起弗吉尼亚州（图。​（图3三C类). 这些核苷酸变化与弗吉尼亚州^J型在关键重组体中在亲本或其他代表性近交系中不存在。不基因编码区发生突变第7版和Mcoln2号机组.

我们感谢Bill Pavan、Mark Fogg、Feng Qian、Emma Morton-Bours、KeithVokey和Susan Cole讨论，Doris Wu，Dennis Drayna，BobWenthold和Heinz Arnheiter对手稿的宝贵评论，Alfredo Calderon负责技术援助，Melissa Irby和Jimmy负责Fiallos用于动物群落管理。这项工作得到了国家耳聋和其他疾病研究所的校内项目沟通障碍。