果蝇的大规模突变筛选，黑腹果蝇，还有斑马鱼，达尼奥雷里奥，已确定了许多正常胚胎发生所需的合子遗传位点(1–3). 在大多数动物物种中，受精胚胎的基因组在早期发育阶段没有转录活性；因此，母体衍生产物在卵子发生过程中合成和积累，起着调节早期胚胎发育的作用。在果蝇属，许多最初在合子突变筛选中确定的基因也在母体中表达。研究表明，这种母体的贡献通常是早期胚胎模式形成所必需的（参考文献。4)可以部分补偿合子基因功能的丧失(5,6). 生殖系克隆的产生使得系统分析已知合子致命突变对母体的影响成为可能果蝇属(6,7). 通常，遗传镶嵌动物是通过使用显性雌性有丝分裂重组方法产生的(8). 在这种情况下，只产生纯合子突变生殖细胞的卵子。在第二种方法中，细胞移植技术用于将突变极细胞转移到无菌野生型（WT）宿主胚胎中(9). 这种方法产生了携带纯合突变细胞完全重新繁殖的生殖系的雌性。这些策略使得高效生产和分析母体突变后代成为可能果蝇属.
中的研究爪蟾斑马鱼已经证明，在这两种生物中，母体基因产物也有助于早期胚胎发育和模式化(10–13). 此外，母体合子突变体的产生单眼针头(14)或失去一个鳍(15)已经揭示了之前由合子突变表型初步鉴定的基因的意外作用。这些结果表明果蝇属母源RNA和蛋白质可以部分掩盖斑马鱼合子突变的影响。在这些研究中，通过将WT mRNA注射到突变胚胎中生成纯合子突变雌性，从而挽救早期胚胎表型。然而，通过信使核糖核酸注射进行挽救并不是研究母体表型所需的普遍适用的工具(我)一个突变被克隆(ii（ii）)mRNA的异位/过度表达不会导致致命表型，并且(三)基因功能在发育后期是不必要的。这种方法的局限性突出表明，需要改进系统分析可能的孕产妇影响的方法。克服这些缺点的一个潜在策略是产生生殖系嵌合体。斑马鱼嵌合体是通过将中囊胚期细胞，包括原始生殖细胞（PGCs），从有色供体胚胎移植到白化宿主而产生的(16). 然而，400多个中胚层移植只产生了5个种系嵌合体，供体细胞对嵌合体生殖系的贡献程度一般小于15%(16). 因此，尽管这项研究证明了在基因型不同的胚胎之间转移PGCs的可能性，但获得嵌合动物的低效率和高水平的种系嵌合体使其极为劳动密集，并且不适用于大量基因的分析。
近年来，人们对斑马鱼PGC的发展有了很多了解。斑马鱼的鉴定瓦萨同源物，在生殖系中表达(17,18)及其表达的详细时空特征(19,20)，为胚胎发生过程中PGC的发育和迁移提供了见解。此外，对转录后调控的分析纳米和瓦萨RNA已经产生了研究PGC发育的有用标记体内(21–23). 此外，已分离出对斑马鱼PGC发育至关重要的基因（参考文献。21; G.W.、B.T.、C.T.和E.R.，未出版作品）。在这里，我们利用这些最新进展高效地生产斑马鱼嵌合体，其中宿主生殖系已被突变供体细胞完全取代。我们描述了荧光标记技术，该技术可以有效筛选宿主胚胎中供体PGC的转移，并报道了吗啉寡核苷酸（MO）反义方法(24,25)这有效地消融了宿主生殖系。作为基本原理的证明，我们利用这项技术产生了母体合子突变株，用于合子致死相距数英里(百万)突变。
材料和方法
微量注射和细胞移植。
鱼类和胚胎维护(26)和细胞移植技术(27)已描述。供移植胚胎来自百万电话273/+鱼(28); WT鱼用于产生宿主胚胎。用Pronase处理供体和寄主胚胎。供体胚胎在一至两个细胞阶段注射100pl的5%若丹明右旋糖酐（10kDa；Molecular Probes）或80pg的GFP-编号1-3′UTR通过SP6转录合成的sense strand-capted mRNA不是I-线性化质粒(21)使用mMESSAGE mMACHINE系统（Ambion）。在单细胞至双细胞阶段向宿主胚胎注射3 ng吗啉反义寡核苷酸，以对抗死胡同mRNA（αPGC-MO，5′-GCTGGCATCCATGTCTCCGACCACCAT-3′；G.W.，B.T.，C.T.和E.R.，未发表的工作）。RNA和MOs在0.2 M KCl中用5 mg/ml酚红稀释；MO注射浓度根据制造商的规范（Gene Tools，Philomath，OR）计算。在囊胚中期阶段，从供体胚胎边缘将50-100个细胞移植到类似阶段宿主的边缘或动物极。供体和寄主分别在24孔培养板上培养至受精后30小时（hpf）；然后对宿主胚胎进行筛选，以转移荧光标记的供体或衍生PGC，并对供体胚胎进行筛选百万-突变表型(28,29).
PCR基因分型。
对胚胎进行基因分型百万使用5′-AGTGTTCATACGAGGGG-3′和5′-TAGTATCGTGAGGGG-3'引物对生成的260-bp PCR产物的限制性内切酶消化位点。典型的扩增条件包括在94°C、55°C和72°C下30秒的45次循环。放大后的产品包括百万电话273突变(30)，这将导致Aci公司我限制网站和创建幽门螺杆菌放大器中的CH4V位置。Aci公司I消化产生220-bp的产品百万电话273等位基因，以及WT存在时的130-+90-bp双基因百万等位基因；相反，幽门螺杆菌CH4V消化产生260-bp的WT产品百万等位基因和一条130-bp的带百万电话273等位基因。产品在3%琼脂糖凝胶上溶解。
结果
生殖系替代战略。
我们生成生殖系替代嵌合体的方法如图所示。和我们推断，用特异的反义MO阻断宿主PGC的发育，可以确保从供体胚胎移植的PGC完全重新繁殖生殖系。此外，将荧光标记引入供体细胞应能使体内筛选潜在PGC移植的宿主胚胎。这种方法将消除产生和筛选大量成鱼的需要，因为只有那些从纯合子突变供体胚胎中转移PGC的嵌合体才需要培育到成年。
使用GFP-编号1-3′UTR标记技术。(A类)细胞移植策略概述GFP-编号1-3′UTR-标记的突变供体胚胎进入αPGC-MO注射的WT宿主的边缘。在本例中，“m”指任何合子突变百万电话273. (B类)在30 hpf时，来自注入控制的PGC百万九胚胎被专门标记为GFP（箭头）。(C类)在30 hpf条件下对宿主胚胎进行筛选，以确定是否存在GFP标记的供体PGC，以及它们是否正常迁移到卵黄延伸前部的性腺中胚层（箭头所示）。
使用罗丹明-外显子标记技术的种系替换策略。(A类)移植策略概述，显示了将细胞从罗丹明-dextran标记的突变供体胚胎边缘转移到αPGC-MO注射WT宿主的动物极。(B类)在30 hpf时，对照供体胚胎内的所有细胞都被有效地标记为罗丹明提取物。(C类)30 hpf的嵌合宿主胚胎显示罗丹明-外显子标记的供体细胞对前神经外胚层谱系的体细胞贡献（*）。对宿主胚胎进行筛选，以确定是否存在已成功迁移至性腺中胚层的标记供体PGC（箭头所示）。
为了证明所提出的策略的基本原理，我们尝试用从百万-突变供体。百万与调节胚胎细胞迁移有关的鞘氨醇-1-磷酸受体的编码(30). 这个百万电话273等位基因是一种完全渗透隐性合子致命突变百万-突变胚胎发育为贲门裂和上皮尾部水疱(28,29).百万是母性表达的，并且之前试图营救百万-突变体表型因以下因素诱导的显性效应而失败百万mRNA注射(30). 这个百万因此，该基因座是生殖系替换方法产生母体突变体的典型候选基因。
寄主胚胎的移植和制备。
胚胎收集于百万电话273/+鱼(百万九供体）和WT鱼（宿主胚胎），并在长方形和球形阶段之间进行移植(31). 在中囊胚期，PGC前体细胞已被证明位于边缘附近(17,18). 因此，≈50–100个细胞从百万九供体胚胎转化为WT宿主。
确保嵌合胚胎的生殖系完全被密耳九供体细胞、WT宿主胚胎在单细胞期注射MO，以阻止死胡同mRNA。死胡同在就地表达筛选为PGC中表达的基因（C.T.和B.T.，未发表工作）。最近的研究表明，抑制死胡同通过使用反义MO抑制PGC的发育并导致不育而不影响生存能力（G.W.、B.T.、C.T.和E.R.，未发表的工作）。我们以1 ng、3 ng和6 ng的量滴定了αPGC-MO的活性，发现3 ng的MO阻碍了所有注射胚胎中的PGC发育(n个>30）因缺少瓦萨表达式(17,18)或GFP编号1–3′UTR记者表情(21)30 hpf（数据未显示）。
供者PGC转移的标记和筛选。
我们使用了两种策略来荧光标记和转移供体PGC。在第一个（图。A类),密耳九胚胎在单细胞期注射含有纳米3英尺UTR(GFP-编号1-3′UTR; 裁判。21). 尽管GFP在移植时广泛表达一氧化氮合成酶-3′UTR公司通过晚期原肠胚形成将GFP特异性表达导向PGC（图。B类; 裁判。21). 将供体胚胎边缘的细胞移植到注射αPGC-MO的WT宿主边缘。在30 hpf时，对宿主胚胎进行GFP阳性细胞筛选，这些细胞位于靠近卵黄延伸前部的性腺中胚层中（箭头，图。C类). 这些代表移植百万九迁移到生殖细胞发育的正常胚胎区域的PGC(19). 在某些情况下，GFP报告基因的表达在对照组中似乎是可变的百万九允许发育到30 hpf的胚胎，GFP的表达仅限于胚胎的一侧。因为转让未标记百万九PGC会被忽视，供体PGC标记不完整会降低成功的种系嵌合体的鉴定和选择效率。还观察到一些嵌合胚胎发生了贲门裂。这大概是由躯体疾病引起的百万-突变细胞对寄主胚胎as的贡献百万-突变细胞被移植到WT宿主的边缘，该区域注定会产生未来心脏场的内胚层和中胚层前体(32,33).
用于标记和筛选PGC传输的第二种策略如图所示。A.百万九供体胚胎在单细胞期注射罗丹明提取物，有效标记宿主胚胎的所有细胞（图。B类). 在这些实验中，细胞从百万九捐赠者进入WT宿主的动物极，该区域注定会成为前神经组织(32,34). 最近的研究表明，PGC被吸引迁移到性腺中胚层(35). 因此，我们推断，移植到动物区的体细胞应该有助于前神经外胚层(36)并且PGC会积极地从该区域迁移到假定的性腺。在30 hpf条件下筛选寄主胚胎，以确定荧光标记物的分布百万九供体细胞。如预期，身体百万九细胞的贡献主要局限于嵌合体胚胎的头部（图。C类). 通过卵黄延伸前部附近性腺中胚层中罗丹明-外激素标记细胞的存在，对供体PGC的成功转移进行评分（箭头，图。C类). 罗丹明-外显子标记的PGC比周围的供体衍生体细胞更大、更明亮，可能是因为PGC的有丝分裂指数较低(17). 这一发现使得筛选百万九即使供体细胞的贡献不完全局限于前神经组织（数据未显示），PGC也会转移。
表在我们最近的四个实验中总结了PGC移植的效率，使用罗丹明-外显子或GFP编号1–3′UTR标签策略。总的来说，这两种技术的总效率接近12%。
表1。
| 供体PGC标签 | 支出。 | 进行的移植总数 | 成功的PGC传输数 | 效率，% |
|---|
| GFP-编号1-3′UTR信使核糖核酸 | 1 | 160 | 18 |
| 2 | 180 | 22 |
| 总计 | 340 | 40 | 11.8 |
| 罗丹明提取物 | 三 | 144 | 12 |
| 4 | 144 | 22 |
| 总计 | 288 | 34 | 11.8 |
富饶的奇梅拉斯百万-突变衍生生殖系。
在鉴定PGC转移到宿主胚胎时，对相应的供体胚胎进行筛选百万-突变表型。所有接受过百万-选择突变体PGC培养至成年；一些接受WT捐赠者转移的PGC的嵌合体也作为对照保存。迄今为止，在39个选择的嵌合体中，有26个存活到成年：其中12个嵌合体来自百万-突变供体，14个来源于百万电话273/+或+/+捐赠者。在饲养的26只嵌合体中，有12只已被证明具有生育能力（4只雌性和8只雄性）。
为了测试供体或衍生细胞是否完全取代宿主的生殖系，将嵌合体鱼与百万电话273/+对砧木和后代进行WT或百万-突变表型（见表). 如果宿主胚胎的生殖系完全被百万电话273/百万电话273PGC，然后传给百万电话273/+鱼类应产生WT和百万-以1:1的比例突变后代。然而，如果+/+宿主的生殖系没有完全消融，那么应该观察到更多的WT胚胎。在这628个后代中百万-突变嵌合体×百万电话273/+交叉，320密耳-鉴定出突变体和308个WT胚胎；母体合子的表型百万-突变体并没有明显强于合子突变体。χ2分析表明，所有突变株与WT子代的1:1比率没有显著差异百万电话273/百万电话273测试的嵌合体（表).
表2。
间杂交后代的表型和基因型百万电话273/+鱼类和成虫嵌合体
| 奇梅拉 | 获得的子代总数
| 表型 | χ2价值
| WT基因型总数
| 基因型 |
|---|
| 供体基因型 | 身份证件 | 性别 | 百万-突变体 | 重量 | +/+ | 百万电话273/+ |
|---|
| 密耳电话273/百万电话273 | 22米 | F类 | 322 | 166 | 156 | 0.31 | 83 | 0 | 83 |
| 立方米 | F类 | 164 | 83 | 81 | 0.02 | 40 | 0 | 40 |
| 17米 | M（M） | 66 | 37 | 29 | 0.97 | 27 | 0 | 27 |
| m1米 | M（M） | 76 | 34 | 42 | 0.84 | 34 | 0 | 34 |
| | | 总计 | 320 | 308 | | 总计 | 0 | 184 |
| 百万电话273/+ | 26米 | F类 | 169 | 42 | 127 | 0.002 |
| 15米 | F类 | 70 | 18 | 52 | 0.02 |
| 20米 | M（M） | 82 | 25 | 57 | 1.32 |
| 9米 | M（M） | 73 | 18 | 55 | 0.004 |
| | | 总计 | 103 | 291 |
如果宿主生殖系完全消融并仅用百万电话273/百万电话273供体细胞，那么所有后代都会继承百万电话273来自嵌合体亲本的等位基因。为了验证这个假设，嵌合体和百万电话273/+伴侣进行PCR基因分型以区分密耳电话273/+来自+/+胚胎（图。). 迄今为止，0／184个WT胚胎的基因分型为+/+，这表明嵌合胚胎的生殖系已被百万电话273/百万电话273PGC（表). 此外百万-突变嵌合体只产生百万-突变胚胎(n个= 48/48). 这些结果表明，αPGC-MO处理可以有效地阻断宿主PGC的发育，转移的细胞可以完全取代宿主生殖系，产生功能性精子和卵子。
聚合酶链式反应基因分型百万-突变体和WT胚胎。所示为3%的琼脂糖凝胶分辨率幽门螺杆菌Ch4V和Aci公司从制备的基因组DNA扩增的PCR片段的消化产物百万电话273/百万电话273,百万电话273/+和+/+胚胎。
对来源于百万电话273/+供体胚胎（表). 如果宿主胚胎的生殖系完全被百万电话273/+PGC，然后与百万电话273/+鱼类应该产生百万-突变体和WT子代的比例为1:3。在这些杂交获得的394个后代中，有103个百万-鉴定出突变体和291个WT胚胎。χ2分析表明，所有突变株与野生型后代的比例均为1:3，与预期值无显著差异百万电话273/+测试嵌合体。这一结果强调了αPGC-MO介导的生殖系消融的效率。
讨论
据我们所知，这是脊椎动物中首次报道了一种方法，该方法允许从纯合子突变供体移植的PGC完全和功能性地替换宿主生殖系。虽然我们已经具体演示了百万电话273/密耳电话273通过嵌合体动物的生殖细胞，该方案应广泛适用于大多数合子突变体，前提是突变不会以细胞自主方式干扰PGC的存活。因此，它应该为筛查母亲影响和不太常见的父亲影响提供宝贵的工具(37)已知合子致命突变。我们还表明，对于宿主移植地点的谨慎选择（例如，在以下情况下，动物极点而不是边缘百万)可以帮助避免突变体细胞对嵌合体贡献的潜在负面后果，并进一步确保该程序的成功和普遍适用性。
方法效率。
使用两种方法来标记和筛选供体PGC转移到宿主胚胎中：(我)GFP编号1–3′UTRmRNA注射，通过晚期原肠胚形成将GFP特异性导向PGC(21)，以及(ii（ii）)罗丹明-dextran注射液标记所有细胞，因此需要能够区分标记的PGC和嵌合体胚胎中的胞体。有趣的是，我们观察到，即使在体外移植到宿主囊胚的动物极时，PGC也可以迁移到卵黄延伸的前部的正常靶组织。这一结果提供了罗丹明提取物标记的胞体和PGC的分离，这是筛查所必需的。这些观察结果支持了一种PGC迁移模型，该模型支持长距离位置线索的活动，而不是指导PGC迁移的位置相关局部因素(19,35).
PGC转移用于标记和筛选技术的效率相似。尽管GFP编号1–3′UTR注射并不能可靠地标记所有PGC，筛选宿主胚胎中是否存在GFP阳性PGC是简单而有效的。相反，若丹明右旋糖酐注射液对所有供体PGC进行了一致标记；因此，预计会有更高的PGC转移率。然而，并非所有转移的PGC都能从动物极的异位移植部位正常迁移。无论采用何种标记策略，在活体宿主胚胎中筛选突变PGC转移的能力消除了饲养和筛选大量成年鱼类供者PGC对生殖系的贡献的需要。
在饲养到成年的26条嵌合体鱼中，有12条被证明是可繁殖的。此外，在选择用于进一步分析的12个可育嵌合体中，所有8个嵌合体似乎都具有由供体PGC完全重建的生殖系。虽然在分析大量此类嵌合体动物时，可以更好地判断“完全”种系替换的效率，但我们的结果表明，αPGC-MO治疗可以有效抑制PGC的发育。获得的大量无菌嵌合体证实了这一结论。在这些情况下，在前卵黄延伸区附近观察到的罗丹明-外激素或GFP标记的PGC可能没有迁移到它们的实际靶点，因此可能被排除在发育中的性腺之外。我们预计，随着经验的积累，识别功能性PGC移植的熟练程度会提高，并且在未来的实验中，生育率会更高。或者，在一些嵌合胚胎中转移的PGC太少，以便有效重建宿主生殖系。虽然在果蝇属已经证明单个生殖细胞具有繁殖生殖系的能力（R.Lehmann，个人通讯），但对正常斑马鱼生殖系发育所需PGC的绝对数量知之甚少。本报告中概述的PGC标记和转移技术应允许此问题的实证解决。
综上所述，我们报告了在中囊胚期进行PGC移植的效率为12%。由于对于给定的隐性合子致死突变，预计只有25%的PGC转移来自纯合供体胚胎，纯合突变PGC转移的效率降低到3%。在我们的设施中，67%的选定嵌合体存活到成年，其中约50%已被证明是可生育的。考虑到我们每天例行进行150次移植，我们可以合理地期望每次移植实验产生1或2个可育成年生殖系替换嵌合体。
潜在应用。
生殖系替换策略应该为分析已知合子突变的母体效应提供强有力的手段。它没有与当前MO反义方法相关的固有缺点，这些方法不能消除母系负载的蛋白质，并且根据MO注射的时间和浓度，易受不一致和非特异性表型的影响(38,39). 此外，生殖系替换策略可以补充正向遗传分析，并允许调查尚未克隆的合子突变的母体效应。
我们已经报道了产生雄性和雌性斑马鱼嵌合体的能力，这些嵌合体的生殖系完全由供体PGC重建。一旦亲本生殖系中缺乏嵌合性，就可以产生大量完全由纯合子突变体组成的胚胎；这些胚胎随后可以用作供体胚胎，以便更有效地生产后代的生殖系替代嵌合体。
母体合子的表型百万突变体并没有明显强于合子密耳突变体。因此，基因的母体表达并不一定表明母体和合子基因功能之间存在显著冗余，种系替换嵌合体并不总是揭示先前确定的合子致命突变的母体效应。然而，通过使用种系替换策略产生大量完全纯合子突变体的能力将在胚胎学和遗传学分析中证明是非常宝贵的，因为这些分析需要在合子表型出现之前对突变胚胎进行阳性鉴定。例如，不同突变背景下的胚胎命运映射(40)以及对给定突变的细胞自主性进行镶嵌分析(27)，可以更高效地执行。可以收集大量突变组织用于生化或微阵列实验，而无需复杂的胚胎分选技术(41). 最后，纯合子突变体离合器为在任何特定突变背景下进行互补或修饰筛选或MO基因敲除分析提供了丰富的材料。虽然我们已经通过使用单个百万突变，协议的效率也应该允许双突变甚至三突变的传播。
据报道，从培养的胚胎细胞中产生斑马鱼生殖系嵌合体(42). 这一发现提出了以下可能性：在体外转基因和基因靶向技术将在鱼类中变得可行。生殖系替换将在这些策略中提供一个强大的工具：通过使用MO来清除宿主胚胎的PGC死胡同应允许遗传变异有效地传递到嵌合体胚胎的生殖系中，并用遗传变异材料完全替代宿主生殖系。因此，任何基因操作的表型都可以在下一代进行研究。这一结果将在速度和效率上与目前用于操纵小鼠基因组的转基因和反向遗传方法相匹敌(43,44).
