血清反应因子（SRF）是一种MADS（MCM1，Agaous，Deficiens，SRF）盒转录因子，通过结合DNA共有序列CC（a/T）调节肌肉特异性和生长因子诱导的基因6GG，称为CArG盒（参考。1; 在参考文献中进行了审查。2). SRF激活的基因谱由其对不同CArG-box序列的不同亲和力决定(三)及其与多种阳性和阴性辅因子的关联，其中许多是细胞类型特异性和信号反应性的（参考文献综述）。4).
除了在增殖和肌生成中的作用外，靶向灭活小鼠Srf公司该基因揭示了SRF在早期胚胎发生和中胚层形成中的需求(5,6). SRF缺陷[Srf公司（−/−）]胚胎干细胞保持其增殖能力(6,7)并为识别依赖SRF的转录程序以及分析SRF对其辅因子活性的潜在需求提供了强大的系统。
最近，我们描述了一种以前没有特征化的SRF辅因子，称为心肌蛋白，它在心脏和平滑肌细胞中特异表达(8). Myocardin通过一个碱性和富含谷氨酰胺的结构域与SRF的MADS盒相关联；这种相互作用将心肌蛋白强大的反式激活域（TAD）带到含有CArG盒的靶基因中，从而产生转录激活。肌卡蛋白含有一个SAF-A/B、Acinus、PIAS（SAP）结构域，存在于参与染色质重塑和基因表达的各种核蛋白中(9). 心肌蛋白的SAP结构域不需要与SRF关联，但它对靶基因激活具有特异性，并且对某些基因的激活是必需的，而对其他基因的激活则不是必需的(8). 中的表达式爪蟾与SRF相关但缺乏转录活性的心肌蛋白显性阴性突变体的胚胎阻止心脏形成，揭示了心肌蛋白在心脏基因表达中的早期重要作用(8).
由于SRF调节许多生长因子诱导的基因，这些基因在心肌蛋白不表达的细胞中表达，因此我们研究心肌蛋白相关蛋白是否可能调节心血管系统外的SRF活性。在本研究中，我们描述了两种心肌相关转录因子（MRTF），称为MRTF-A和MRTF-B，它们差异地刺激SRF依赖的转录。与心肌蛋白相反，MRTF-A和-B在胚胎和成人组织中广泛表达。在S中射频（−/−）ES细胞、肌球蛋白和MRTF不能反式激活SRF依赖性启动子，证实了SRF作为这些因子转录活性介质的专性作用。
材料和方法
生物信息学和cDNA克隆。
利用小鼠心肌蛋白cDNA序列搜索NCBI数据库以鉴定相关基因。几个人、老鼠和爪蟾鉴定了与心肌蛋白同源的cDNA克隆和EST。这些序列被用作探针来筛选全长cDNA的cDNA文库。基因结构心肌素,MRTF公司-A类、和MRTF公司-B类根据可用的小鼠基因组序列推断。
RNA分析。
将成年小鼠多组织Northern印迹（CLONTECH）与包含MRTF-A和-B完整ORF的cDNA探针杂交(8). 对于就地杂交，转录MRTF-A和-B的3′-非翻译区在体外在以下人员在场的情况下[35S] UTP产生反义和有义（作为对照）核糖探针。现场按照描述进行杂交(10).
转染试验。
SRF和心肌蛋白表达结构已被描述(8). 将编码全长蛋白或不同缺失突变体的MRTF-A和-B cDNA亚克隆到带有C末端Myc表位标签的pcDNA3.1表达载体（Invitrogen）中。对于GAL4转染实验，将全长蛋白或TAD（MRTF-A和-B的残基分别为692-929和784-1080）在框架中融合到GAL4-（1-147）DNA-结合域。除非另有说明，否则使用100ng的荧光素酶报告子和100ng的每个激活剂质粒。通过添加不含cDNA插入的表达载体，每个孔的DNA总量保持不变。巨细胞病毒lacZ被用作内部对照，以使转染效率的变化正常化。逆转录病毒SRF表达结构（pHeinz；D.Boos，O.Heidenreich和A.N.，未发表的数据）也用于一些实验中，使用Srf公司（−/−）ES电池，如图所示。
SM22-荧光素酶结构包含1434-bp启动子(11). 心钠素（ANF）-荧光素酶结构包含638-bp启动子(12). 描述了4xSM22 CArG-近荧光素酶结构(8). （mSm）2-tk80-荧光素酶报告子（O.Heidenreich和A.N.，未发表的数据）包含人类细胞的CArG-box序列-福斯启动子中三元复合因子（TCF）和AP-1结合位点的侧翼区域通过替换带下划线的核苷酸而发生突变，从而保持了一个强大的、中央定位的SRF结合位点：（CCTTACAACTA公司ATGTCCATAGGACATC公司燃气轮机CGT公司自动控制GCAT）。该序列是在前面描述的tk80-荧光素酶报告质粒上游串联复制克隆的(13). ES细胞转染使用脂质体（Invitrogen），相关荧光素酶检测如参考文献所述。13.100的生成和维护Srf公司已描述（−/−）ES细胞系(6).
DNA-结合分析。
凝胶流动性变化分析如所述进行(三). 一种与SM22型CArG远(11)序列被用作探针。肌球蛋白和MRTF-A和-B蛋白被转录和翻译在体外使用TNT T7-耦合网织红细胞裂解物系统（Promega）。蛋白质表达水平通过Western blot分析测定。
GST蛋白结合分析。
在pGEX-KG载体（Amersham Pharmacia）的GST框架中克隆了一个编码人类SRF的cDNA。GST-SRF融合蛋白按所述进行表达和纯化(14).35在T7-偶联网织红细胞裂解物系统中翻译S标记的心肌蛋白、MRTF-A和-B。对于GST蛋白结合分析，等量的GST-SRF或GST蛋白单独（作为阴性对照）与肌钙蛋白、MRTF-A或MRTF-B在GST结合缓冲液（20 mM Tris，pH 7.3/150 mM NaCl/0.5%Nonide P-40/蛋白酶抑制剂）中孵育1小时。用GST结合缓冲液洗涤三次后，用10%SDS/PAGE分析与GST-琼脂糖珠相关的蛋白质。
结果
MRTF家族。
通过使用与肌钙蛋白酶同源的EST筛选小鼠胚胎cDNA文库或应用基于PCR的克隆策略，获得编码两种肌钙蛋白酶相关蛋白（MRTF-A和-B）的全长cDNA。小鼠心肌蛋白和MRTF-A和-B的蛋白质结构如图所示。A类三种蛋白质之间的总氨基酸同源性约为35%，而它们在碱性、富含谷氨酰胺（Q）和SAP结构域中的氨基酸同源性大于60%（图。 A类和B类). 在这些区域之外，这三种蛋白质之间的同源性仅限于作为TAD的N末端区域和C末端区域。值得注意的是，MRTF-A和-B之间的氨基酸同源性（42%）大于MRTFs和心肌蛋白之间的氨基酸相似性。
肌球蛋白家族转录因子的结构。(A类)心肌蛋白、MRTF-A和MRTF-B蛋白的示意图。++，基础区域；NTD，N端结构域；Q、 富含谷氨酰胺的区域。右侧显示了每个蛋白质中的氨基酸数量，以及每个MRTF和心肌蛋白的指示结构域之间的百分比一致性。(B类)心肌蛋白和MRTF之间的氨基酸序列同源性。彩色条对应于中所示的保守区域A类. (C类)小鼠的基因组织心肌素,MRTF公司-A类、和MRTF公司-B类外显子的颜色对应于A类虚线表示另一个外显子。基因结构上方显示了基因组DNA的千叶。显示了翻译起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA和TGA）。
小鼠MRTF-A的人类同源物最近在一个复发性t细胞中被鉴定(1,22)急性巨核细胞白血病（M7）易位，命名为MAL1/MKL1(15,16). 我们还鉴定了部分人类cDNA序列（KIAA 1243），该序列似乎是MRTF-B的人类同源序列爪蟾如图6所示，该图作为支持信息发布在PNAS网站上，网址：www.pnas.org.
在表征MRTF序列的过程中，我们发现心肌蛋白在先前公布的序列中额外含有128个氨基酸N末端（图。 A类和B类). 这个区域，我们称之为N末端结构域，与MRTF-A和-B具有>65%的氨基酸同源性（图。 A类和B类).
老鼠的结构心肌素,MRTF公司-A类、和MRTF公司-B类基因也通过比较cDNA和基因组序列来确定（图。C类). 蛋白质编码区心肌素,MRTF公司-A类、和MRTF公司-B类小鼠11、15和16号染色体上的span≈93、37和50kb。
MRTFs的表达模式。
MRTF转录物存在于多种成人组织中（图。 A类和B类). MRTF-A有两个主要转录物（≈4.5和≈2.5 kb）存在于所有测试组织中，在心脏和肝脏中表达最丰富。MRTF-B明显有一个约9 kb的主要转录本，在心脏和大脑中主要表达。睾丸中也检测到≈3 kb的转录本，明显代表MRTF-B的选择性剪接形式。
心肌蛋白和MRTFs在成人和胚胎组织中的表达模式。(A类和B类)成年小鼠组织中MRTF-A和-B的Northern blot分析。(C类)心肌蛋白的表达(一–e（电子）)、MRTF-A(（f）–j个)和MRTF-B(k个–o（o）)在小鼠胚胎中检测到就地杂交。肌球蛋白在E13.5胚胎的心脏和平滑肌细胞中表达(一). 同一胚胎的高倍放大显示心肌蛋白在心脏、食管平滑肌和背主动脉中的表达(b条)，肺(c（c）)、膀胱和小肠(d日)和胃(e（电子）)如图所示。MRTF-A在舌中表达(（f）和克)、肺和隔膜(小时)，肾脏(我)，膀胱(j个)和E13.5的冒号(（f）)和E15.5(克–j个)小鼠胚胎。MRTF-B在E13.5中的表达(k个)和E15.5(我–o（o）)小鼠胚胎。注意肺部有较高水平的表达(米)，肾脏(n个)和嗅上皮(o（o）). 箭头输入小时和米指向肺部我和n个到肾脏。
与心肌蛋白的表达相反，在心脏和平滑肌细胞的子集中(8)在胚胎第（E）10.5天，在整个胚胎中检测到MRTF-A和-B转录物（数据未显示）。到E13.5，MRTF-A在大多数组织中继续以低水平表达，但在神经间充质细胞、舌头骨骼肌、结肠和小肠上皮细胞的子集中检测到较高表达（图。囊性纤维变性). 在E15.5，MRTF-A在上述组织中的表达变得更加明显（图。Cg公司). 在此阶段，在肺、肾、膀胱和结肠的上皮细胞中也检测到MRTF-A的表达（图。C小时–j个).
与MRTF-A一样，MRTF-B在肺、肾、结肠和睾丸的上皮细胞中表达（图。捷克–n个). 然而，与MRTF-A不同，MRTF-B在结肠和小肠的平滑肌中表达。MRTF-B在靠近嗅上皮的间充质细胞中也有表达（图。有限公司). MRTF-B在发育中的肺组织中的表达与MRTF-A的表达不同。虽然MRTF-A的表达仅限于上皮细胞，但MRTF-B似乎在上皮细胞和间充质细胞中都表达（对比图。 中国具有厘米).
鉴于心肌蛋白强烈诱导SM22表达的能力(8)作为许多需要成对CArG盒才能表达的平滑肌基因之一，我们比较了心肌蛋白和MRTF在平滑肌细胞系发育中的表达。在E13.5中，肌苷在食管、背主动脉、肺、小肠、膀胱和胃的平滑肌细胞中表达（图。C b类–e（电子）). 这些组织中平滑肌细胞的表达水平与发育中的心脏相当。肌球蛋白在出生后平滑肌细胞中表达下降，但在成年前主动脉平滑肌细胞仍能检测到（数据未显示）。
MRTFs刺激SRF-依赖性转录。
为了评估MRTF-A和-B的潜在转录活性，我们将它们的完整编码区与GAL4 DNA结合结构域融合，并测定它们在转染的COS细胞中激活GAL4依赖性萤光素酶报告基因的能力。在该试验中，心肌蛋白和两种MRTF的转录活性均增加（图。A类). MRTF-A和-B的C末端区域作为反式激活子比全长蛋白更有效（图。B类)如肌钙蛋白观察到的（图。B类; 裁判。8).
MRTF的转录活性。完整的ORF(A类)或TAD(B类)将心肌蛋白和MRTF融合到GAL4 DNA结合域，并使用GAL4依赖荧光素酶报告子（UAS-luc）在转染COS细胞中检测转录活性。(C类)荧光素酶报告子的反激活与SM22型或ANF公司启动子或CArG-的四个串联副本SM22型如图所示，肌钙蛋白和MRTF的启动子。WT是指野生型启动子，Mut是指两个CArG盒中发生突变的启动子。值表示为高于矢量表达背景水平的表达折叠激活。所有转染分析至少进行了三次，并显示了代表性数据。
因为MRTF-A和-B与与SRF相互作用的心肌蛋白的基本和富含Q的区域具有同源性(8)，我们使用与SM22型和ANF公司启动子，两者都包含一对CArG盒。MRTF-A和肌钙蛋白将这些报告者激活到类似水平（图。C类). 相反，MRTF-B在激活SM22型并显示几乎没有转录活性ANF公司尽管MRTF-B与GAL4 DNA-结合域融合时与心肌蛋白和MRTF-A一样有效。与肌钙蛋白类似，MRTF-A和-B需要在SM22型和ANF公司转录激活的启动子，因为这些因子无法与CArG盒突变的私人启动子进行相互作用（图。C类). MRTF-A还激活了一个荧光素酶报告子，该报告子包含Elb最小启动子和SM22型CArG-接近与心肌蛋白相当的水平，而MRTF-B仅激活了该报告者的最低水平（图。C类). 与肌钙蛋白类似，MRTFs没有激活c-福斯启动子有效，包含单个CArG框（数据未显示）。肌球蛋白、MRTF-A和MRTF-B的表达水平与转染细胞的Western blot分析结果相当（数据未显示）。
肌球蛋白和MRTF未能激活SRF-依赖性转录Srf公司（−/−）ES细胞。
为了进一步研究心肌蛋白和MRTF对SRF转录活性的潜在依赖性，我们比较了它们在野生型和Srf公司（−/−）ES细胞。肌卡蛋白，无论是全长还是缺乏N末端结构域的形式，都激活了SM22型启动子和一个包含四个c串联拷贝的人工报告子-福斯野生型ES细胞中的血清反应元件（SRE）（图。A类)但不在Srf公司（−/−）ES电池（图。B类和数据未显示）。MRTF也无法在Srf公司（−/−）ES细胞，而将SRF引入Srf公司具有表达SRF的鼠逆转录病毒结构的（−/−）ES细胞恢复了心肌蛋白和MRTF的转录活性。这些发现表明，心肌蛋白和MRTFs能够以严格依赖SRF的方式有效激活CArG-盒依赖性基因表达。
心肌蛋白和MRTFs转录活性缺乏Srf公司（−/−）ES细胞。野生型(A类)和Srf公司(−/−) (B类)将SM22-荧光素酶和（mSm）瞬时转染ES细胞2-荧光素酶报告子和编码肌球蛋白、MRTF和SRF的表达质粒，如材料和方法. (A类)缺少N末端域（NTD）的Myocardin被用于私有交易（mSm）2-萤光素酶。值表示为高于矢量表达背景水平的表达折叠激活。所有转染分析至少进行了三次，并显示了代表性数据。
SRF和MRTF的物理相互作用。
为了确定MRTF-A和-B是否与DNA上的SRF形成三元复合物，我们使用在体外-翻译的蛋白质和对应于SM22 CArG盒的标记探针。很容易观察到心肌蛋白和SRF之间的三元复合物形成，然而出乎意料的是，MRTF-A和SRF间的三元络合物形成几乎无法检测到，并且在我们的分析条件下无法检测到MRTF-B和SRF之间的复合物形成（图。A类).
SRF和MRTF的相互作用。(A类)凝胶流动性变化分析采用32P标记的寡核苷酸探针SM22型CArG-far和在体外在有无SRF的情况下，肌钙蛋白、MRTF-A或MRTF-B的翻译产物。星号表示SRF与肌钙蛋白或MRTF-A之间形成的三元复合物的位置。(B类)GST-SRF蛋白相互作用。Myocardin，MRTF-A和-B，翻译在体外带有[35S] 如图所示，蛋氨酸与GST-SRF-琼脂糖珠或GST-琼脂酶珠孵育。洗涤后，在10%SDS/PAGE上分离与珠子相关的蛋白质，并通过放射自显影术进行分析。的十分之一在体外-翻译后的蛋白质也直接在凝胶上分离，作为负载控制。
使用GST蛋白结合分析，我们发现GST-SRF与心肌蛋白、MRTF-a和MRTF-B相互作用（图。B类). 目前，我们无法调和凝胶迁移率变化分析和GST蛋白结合分析之间的差异。这一发现的一个可能解释是，凝胶迁移率变化分析比GST蛋白结合分析更严格，需要更高的亲和力复合物。事实上，肌钙蛋白和MRTF对SRF具有不同的亲和力，这可能解释（至少部分解释）为什么它们进行私人交易SM22型和ANF公司报告基因与GAL4 DNA-结合域融合时，尽管其转录活性相似，但存在差异。
讨论
Myocardin和MRTFs包含一个以前没有特征的SRF辅因子家族，具有非凡的转录效力。虽然心肌蛋白以心脏和平滑肌特异性的方式表达，但MRTF-a和-B广泛表达。它们不同的表达模式和对SRF活性的差异影响表明，心肌蛋白和MRTF参与了不同的SRF依赖性基因表达程序。
Myocardin家族。
Myocardin和MRTF与保守的N末端、基本、富Q和SAP域共享一个共同的结构组织。这些蛋白质在其C末端附近也含有TAD，其保守程度低于其他结构域（见图6）。本文报道的小鼠心肌蛋白序列在先前公布的序列的N末端有额外的128个氨基酸残基(8). 在我们迄今为止进行的所有检测中，这两种形式的心肌蛋白在功能上是相同的。
Myocardin和MRTFs构成SAP域转录因子的一个亚类。SAP结构域是一个保守的35-aa基序，包含两个类似同源结构域螺旋1和2的两亲性α-螺旋（参见参考文献。9). SAP结构域存在于多种核蛋白中，包括核基质附着因子SAF-a和-B(17,18)，Acinus，是caspase裂解的靶点，参与细胞凋亡过程中的染色质降解(19)和PIAS（活化STAT的蛋白抑制剂），一种与多种转录因子相关的转录抑制因子(20).
SAF-A和PIAS的SAP结构域与基质附着区域相互作用，基质附着区域被认为通过形成染色质活性结构域来刺激转录(20,21). Myocardin还可以通过其SAP域（D.-Z.W.、Z.W.and E.N.O.，未发布的数据）绑定矩阵连接区域。缺乏SAP域的心肌病突变体保留了处理SM22型启动程序，但无法激活ANF公司发起人(8). 心肌蛋白SAP结构域对转录特异性的这种差异要求是否反映了基质附着区结合或其他辅因子关联的作用尚待确定。
肌钙蛋白的富Q区与SRF相关(8)心肌蛋白和MRTF的转录效力与富Q结构域的长度相关。已在多种其他转录因子中鉴定出富含Q的结构域，并推测其可介导与转录机制其他成分的相互作用(22,23).
人类MRTF公司-A类据报道，该基因在复发性和特异性t细胞中易位到1号染色体(1,22)急性巨核细胞白血病的易位(15,16). 这种易位产生了一种与人类蛋白One-Twenty-Two（OTT）/RBM15（RNA-binding motif protein-15）的融合蛋白。OTT属于一个核蛋白家族，在假定的RNA结合基序中具有同源性(24,25). 我们发现MRTF-A是SRF的一个有效转录辅激活子，这增加了OTT-MAL可能通过SRF诱导异常生长的可能性。
Myocardin和MRTFs增强SRF活性。
我们的结果表明，心肌蛋白和MRTF不能激活SRF依赖的启动子Srf公司（−/−）ES细胞，证实SRF是这些因素的强制性伙伴，至少在测试的SRF依赖性启动子上，可能还有其他因素。心肌蛋白和MRTF能否与其他转录因子协同作用是未来一个有趣的问题。
与肌球蛋白和SRF之间的高亲和力结合相反，MRTF和SRF的相互作用相对较弱，并且在GST蛋白结合测定中可检测到，但在DNA结合测定中未检测到。由于这两种MRTF都能与CArG-盒依赖性启动子进行相互作用，并需要SRF来实现这一活性，我们认为，与心肌蛋白类似，MRTF通过SRF来激活转录。与这一概念一致，MRTF的显性阴性突变体可以干扰心肌蛋白的活性，反之亦然（Z.W.、S.L.和E.N.O.，未发表的结果），这表明它们可能会竞争与SRF的关联。
辅因子相互作用对SRF活性的调节。
SRF的活性通过其与过多转录辅因子的相互作用进行调节。其中，一个Ets结构域蛋白家族与SRF在c的血清反应元件上形成三元复合物-福斯发起人（参考文献。4). TCF家族包括普遍表达的蛋白SAP-1、SAP-2/Net(26,27)和Elk-1(28,29). 值得注意的是，尽管它们的名字，后一种蛋白质并不包含SAP结构域。除了与SRF的MADS结构域结合外，TCF蛋白还可以直接与Ets结构域结合的共有核心基序GGA（A/T）结合，GGA与CArG盒相邻-福斯发起人。SRF与心肌病/MRTF和TCF是否相互排斥尚待确定。
鉴于MRTF-A和-B表达的组织分布以及它们对SRF的不同亲和力，有理由推测MRTF-A和-B可能与心肌蛋白发挥不同的作用。考虑到TCF和SRF的功能依赖于信号(30,31)研究细胞和/或细胞外刺激如何调节转录辅因子的心肌蛋白家族的功能将是一件有趣的事情。
