结果
果蝇属幼虫是连续的取食者,在相对较短的时间内表现出较大的生长。产卵后约5天,它们停止进食,离开食物进入游荡期,不久后便蛹化(图A) ●●●●。在这种正常的发育过程中,有几个显著的变化在不同的环境条件下变得明显。一项有趣的观察是由Beadle等人(1938年)。当幼虫在AEL 70小时前饥饿时,它们会在几天内死亡,而如果在此时间点后饥饿,它们不会生长,但仍能存活并分化为小型成虫。作者得出结论,“幼虫在大约70小时左右发生组织变化”,并称之为“70小时变化”(Beadle等人,1938年). 70小时变化期后的存活率与幼虫是饥饿还是吃糖无关;然而,在70小时之前,放在糖中的幼虫比饥饿条件下的幼虫活得长得多(一周以上,而不是~2天;另见Britton和Edgar,1998年;Zinke等人,1999年). 显然,在营养状态发生变化时,代谢程序在这一点上被激活是有区别的。由于70小时之前的时间对生存至关重要,我们决定在此之前进行实验。在每一次和营养条件下,使用两个芯片,每个芯片与独立采集的样品杂交(图B) ●●●●。
图1。幼虫生长模式和实验大纲。(A类) 果蝇属在标准条件下,即25°C,非拥挤条件下,幼虫蛹化5天AEL。它们经历了两次蜕皮并迅速长大。与瞳孔化、游荡行为或停止喂食相比,70小时点不是一个形态或行为上可识别的阶段(详见正文)。(B类)将在苹果汁琼脂平板上的酵母糊上生长的幼虫清洗并转移到适当的营养条件下。在1、4和12小时后,分离总RNA并与微阵列杂交。(C类)根据饥饿(st 4h)和糖(su 4h)条件下处理4 h后的基因表达谱,形成了三类基因(详见正文)。
营养依赖基因的分类
我们首先确定了饥饿或吃糖4小时的动物中哪些基因上调或下调。我们没有仅仅列出一种营养条件下的调节基因,而是根据它们在两种条件下的行为对基因进行分类(图C) :在饥饿幼虫中受调控的基因,但在糖食幼虫中不受调控(I类);在饥饿幼虫中不受调控,但在糖食幼虫中受调控的基因(II类);以及在饥饿和糖食幼虫中受调控的基因(第三类)。我们决定使用这种双截止方法,因为它可以更好地了解受调控基因的假定功能。
(一) 在饥饿状态下进行调节,但不含糖第一类基因的表达受饥饿影响,但不受糖的影响,即饥饿的影响可归因于缺乏糖。应用以下标准:我们列出了所有受饥饿调节的基因,将倍数截止值设定为4.0倍。从该列表中,我们提取了糖中表达不变的基因(我们将其定义为折叠变化值≤1.0或≥-1.0;另请参阅欧洲分子生物学组织在线),或反向调节(图). 表达仅部分受糖影响的基因被编入“复杂调控”组,在研究中没有进一步考虑。大约35%的饥饿上调基因进入I类;在饥饿下调的基因中,<10%的基因出现在这个列表中(见补充表S1)。符合该标准的基因如图所示。在上调列表的顶部是唇3,我们之前通过northern分析显示,该基因在饥饿时被上调,在糖中被完全抑制(Zinke等人,1999年).
图2。饥饿时受调控的基因列表,但在糖分条件下不受调控。因此,对饥饿的调节完全依赖于糖。治疗4小时。基因及其折叠调控的列表。基因名称来自FlyBase注释(Flybase,1999年); 括号中的数字是Affymetrix探针集名称。右侧显示了所选基因的RT-PCR。nc,无变化;折叠变化值≤1.0或≥-1.0。
RT-PCR分析进一步证实了唇3以及其他几个选定的基因(图). 许多上调的基因显然与脂肪分解代谢有关(Lehninger,1970年;Stryer,1975年)包括BcDNA:GH02901(脂肪酸CoA连接酶;激活脂肪酸进行β-氧化)、CG6113(溶酶体脂肪酶/胆固醇酯酶)和CPTI(线粒体肉碱棕榈酰转移酶,将脂肪酸CoAs运输到线粒体进行β-氧化)。还有其他可能参与能量稳态的因素。这些包括淀粉-d(α-淀粉酶)、胰岛素受体和Ucp4a(解偶联蛋白样4a);哺乳动物线粒体载体蛋白的一些成员与调节胰岛素分泌有关(波伦斯基和塞门科维奇,2001年). 编码脂肪酸合成酶的基因也下调,使脂肪酸从丙二酰辅酶a中产生(我们注意到,我们没有观察到RT-PCR在糖中上调,如微阵列所示)。脂肪酸合成酶基因在哺乳动物饥饿时也被下调(Sul和Wang,1998年).
(二) 在糖中调节但不饥饿在比较饥饿和糖的数据时,我们注意到了一个意想不到的模式:大多数对糖条件调控最高的基因在饥饿时根本没有受到影响(见补充表S1)。因此,使用与上述相同的严格标准,我们列出了所有受糖调节的基因(截止值为4.0倍),但不受饥饿(或相反方向的调节)。大约30%的糖上调基因进入II类;进入该列表的下调基因的百分比大致相同(图; 补充表S1)。
图3。受糖调节但不受饥饿调节的基因列表。基因及其折叠调节的列表,以及选定的RT–PCR分析。我们只包括那些用糖调节的,在饥饿状态下没有变化的。同样,我们包括了那些调控方式与糖相反的基因,例如ATPCL和脂肪酶CG6277。请参见图用于颜色代码。
这一类别中信息最丰富的一个特征是,在上调组中发现的八种可识别酶中,有五种被预测在脂肪酸合成中具有明确的作用(Lehninger,1970年;斯特莱尔,1975年). 这些酶包括乙酰辅酶A羧化酶(脂肪酸生物合成中的速率限制酶)、酰基辅酶A硫酯水解酶(减少线粒体中的脂肪分解;Poupon等人,1999年),ATP-柠檬酸裂解酶(产生用于脂肪酸合成的细胞质乙酰辅酶A),茨威辛酵素(Zw公司; 编码葡萄糖6磷酸脱氢酶,生成脂肪酸合成所需的NADPH还原力)和乙酰辅酶A合成酶(生成乙酰辅酶a从头开始醋酸盐和辅酶A)。四种三酰甘油脂肪酶(CG6271、CG6277、CG6283和CG8093)也下调。有趣的是,这类基因中上调程度最高的两个基因编码一个10-跨膜受体(CG14205)和一个推测的锌指转录因子(CG3850,我们将其命名为甜菜,或糖; 见下文)。
(三) 在饥饿和糖分中进行调节第三类包括受饥饿影响的基因,糖不会改变这种影响(图). 这背后的原因是,无论是在饥饿还是糖的条件下,幼虫的生长都会完全停止,我们希望确定控制细胞生长的基因,特别关注那些可能受饮食氨基酸调节的基因。在这里,我们包括了糖的折叠变化值与饥饿值(截止值为4.0)相比差异不超过2.0的基因。这一类中一个信息量特别大的基因是托尔,编码哺乳动物PHAS1/4E-BP的同源物。该基因在饥饿和糖分条件下被上调到类似程度,这与它对细胞生长信号而非糖依赖信号的反应一致。有趣的是,该因子参与翻译控制,是mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)的靶点,而mTOR又被认为受氨基酸调节(参见Schmelzle and Hall,2000年).
图4。饥饿和糖分状态下受调控的基因列表。基因及其折叠调控列表,以及选择性RT-PCR分析。我们从饥饿数据中提取了受调控的基因,并列出了与此差异不超过2倍糖分的基因。见图用于颜色代码。
许多下调基因编码RNA解旋酶或核糖体蛋白,这一事实进一步支持了这一类别识别参与蛋白质生物合成和细胞生长的基因的观点。还有三种假定的转录因子(CG6770、CG18619和最大值)高表达上调基因。CG6770与哺乳动物P8转录调节因子具有同源性,与胰腺生长和再生有关(Mallo等人,1997年)CG18619与人cAMP反应元件结合蛋白样2(CREBL2;73%氨基酸同源性;Hoornaert等人,1998年). 在营养缺乏的情况下,可能需要激活这些转录因子来阻止细胞生长。
对营养信号的早期反应
上述微阵列数据是在营养处理4小时后获得的。接下来,我们对不同的时间段进行了相同的实验,即1小时和12小时的处理,以区分早期和晚期调节基因(图). 图中所示的列表A–C仅限于在4小时时间点进行RT–PCR的基因(有关所有基因的数据,请参阅补充表S1)或就地杂交(见下文)。在饥饿而非糖调节的基因类别中,最早上调的基因之一是CPTI(图A) ●●●●。该酶的活性对脂肪酸合成的关键中间体丙二酰辅酶a的抑制非常敏感(Jackson等人,1999年). 在糖调节但不饥饿的基因类别中,最高和最早上调的基因是糖,一种推测的转录因子,而最早下调的基因之一是CG6277,一种三酰甘油脂肪酶(图B) ●●●●。请注意,该脂肪酶与该类别中的其他三种脂肪酶(CG8093、CG6283和CG6287)具有不同的阻遏动力学。在饥饿和糖调节的基因类别中,最高和最早上调的基因之一是假定的翻译调节因子托尔(图C) ●●●●。两个转录因子编码基因CG6770和CG18619也在营养剥夺后1小时内上调,支持了它们在信号通路中很早就起作用的观点。
图5。基因调节的时间过程:在适当的营养条件下1、4和12小时。面板显示在4小时或就地杂交。(A类)第一类基因:在饥饿时受调控,但在糖中不受调控(按第4小时的调控排序)。(B类)第二类基因:在糖中调节,但在饥饿时不调节(按su 4h的调节排序)。(C类)第三类基因:受饥饿和糖调节(按第4小时调节排序)。(D类)的规定佩普克和ppl公司:注意这些基因的后期调控(详见正文)。(E类)维恩图显示,随着饥饿(左)或糖分条件(右)时间的增加(1、4和12小时),受调控的基因数量增加(截止值为4.0倍)。请参见图用于颜色代码。st1h,饥饿1h;su1h,加糖1h;第4小时,饥饿4小时;su4h,糖饲喂4h;第12小时,饥饿12小时;su 12h,糖饲喂12h。
这些数据有助于进一步表征不同类别的营养依赖基因的早期和晚期反应。在这方面,我们注意到无泵的(ppl公司)northern分析显示,它编码一种氨基酸分解代谢酶,在饥饿24小时后被下调,而佩普克基因上调(Zinke等人,1999年). 在当前的微阵列分析中,ppl公司在4小时的饥饿期内,没有达到4倍的截止值,但在12小时时可以看到其下调(图D) ;在以下情况下佩普克饥饿4h时无变化,但饥饿12h时略有上调。作为佩普克这是糖异生的速率控制步骤,可能是该基因只有在较长时间的饥饿后才上调,此时储存的能量首次耗尽。在1、4和12小时调节的基因数量的文氏图(图E) 结果表明,正如预期的那样,受调控基因的数量随着饥饿或糖处理时间的增加而增加。
由糖而非饥饿调节的基因:在糖向脂肪转化中的作用
从三类营养素依赖基因中,我们决定更详细地研究第二类基因,即那些受糖调节但不受饥饿影响的基因。这是因为这些基因中的许多可以被置于一个确定的代谢途径中,即将碳水化合物转化为脂肪的代谢途径(图A) ●●●●。与这一观点一致的是,有四种脂肪酶基因被下调,这在生理上有意义,因为生物体在加速脂肪酸合成程序时会想减少脂肪分解。其中一种脂肪酶CG8093与两种在饥饿时上调的脂肪酶非常相似(唇3和CG6113;图B) ●●●●。这些脂肪酶属于脊椎动物溶酶体酸脂肪酶/胆固醇酯酶家族,人类同源脂肪酶a的突变可导致沃尔曼病和胆固醇酯储存病(安德森等人,1994年). 其他三种属于分泌型胰脂肪酶,在脂肪代谢中也有重要作用(Lowe,1997年; 图B) ;这些物质将膳食脂肪分解成可被肠道吸收的形式。如前所述,这些脂肪酶具有不同的下调动力学,有趣的是,三个脂肪酶在较大的脂肪酶簇中串联排列(图C) ●●●●。长链脂肪酸转运蛋白也下调(CG11659;图和B) ●●●●。基于这些观察结果,我们对这类中两个最高上调的基因特别感兴趣:糖和CG14205。前者编码C2H2锌指蛋白,与爪蟾、老鼠和人类(图D类;Lamar等人,2001年)而后者编码一种10-跨膜蛋白,属于苍蝇和蠕虫中发现的高度相关家族(图E和F)。家族中的一个基因是nrf-6型在氟西汀(百忧解)耐药性筛查中发现(Choy和Thomas,1999年). 这些观察结果表明,这两个基因可能在对糖信号作出反应的调节级联中发挥作用。
图6。参与糖到脂肪酸转化的候选基因。(A类)从糖分解到脂肪合成的代谢途径示意图。以红圈表示的基因在糖中上调,而以蓝色表示的基因则下调。(B类)脂肪酶基因家族,其成员在饥饿或食糖动物中受到调节。CG6277、CG6271、CG6283和CG8093在糖食幼虫中均下调,但在饥饿幼虫中未受影响;唇3和CG6113在饥饿幼虫中上调,而在糖食幼虫中未受影响。使用NCBI Blastp使用CG6277和CG8093执行爆炸搜索。(C类)Tandemly将基因定位在脂肪酶簇中(3R;染色体位点97D15-E1)。黑框表示脂肪酶基因,箭头表示转录方向。三种下调的脂肪酶以黄色波浪线表示。白框表示该基因座上最近的非脂肪酶基因。以千基(kb)为单位的数字与Flybase中定义的数字相对应。(D类)的同源性糖其他转录因子基因。最接近的是Gli锌指转录因子爪蟾(x) ,小鼠(m),人类(h)。锌指域显示在灰色框中;糖该蛋白有五个C2H2基序(序列数据未显示)。(E类)CG14205的水势图,显示了10个跨膜结构域;TMHMM(跨膜螺旋区预测程序)的图形输出Sonnhammer等人(1998年). (F类)CG14205与其他的同源性果蝇属(d) 和线虫(c) 基因。所有这些都是NCBI的爆发。星号表示这三个基因是并列的。这个nrf-6型的基因线虫被确定为抗氟西汀所必需的药物被装箱。
为了对此进行调查,我们首先检查了糖以及CG14205与不同的糖。处理4小时后,二糖麦芽糖和海藻糖以及单糖葡萄糖和果糖将这两个基因上调至与蔗糖相同的程度(图A) ●●●●。这些结果表明糖CG14205基因的表达依赖于糖酵解的代谢流量。相比之下,双糖乳糖和单糖半乳糖几乎没有影响,这表明它们可能不是果蝇属幼虫。然后我们监测了不同蔗糖浓度下的表达水平(图B和C)。随着糖浓度的增加,表达量呈浓度依赖性增加,强调了膳食糖对糖和CG14205法规。
图7。糖依赖性激活糖和CG14205。(A类)激活CG14205和糖通过RT-PCR分析显示不同的糖。正常食物条件(N)、蔗糖(Su)、葡萄糖(Glu)、果糖(Fru)、半乳糖(Gal)、麦芽糖(Mal)、乳糖(Lac)和海藻糖(Tre)。所有糖溶液的浓度为20%。注意,与其他测试的糖相比,半乳糖和乳糖对这两个基因的激活作用要小得多。(B类)浓度相关激活糖通过实时PCR分析糖。(C类)通过实时PCR分析糖对CG14205的浓度依赖性激活。(D–I)现场与…杂交糖探查。(D类)正常食物中生长的幼虫;未检测到染色(Mg,中肠;Fb,脂肪体)。(E类)糖养幼虫;注意脂肪体和中肠部分的染色。(F类)中肠前部;前胃(Pv)未染色。(G公司)Malpighian小管染色(MT);箭头指示MT从肠道延伸的点。(H(H))中肠细胞特写。(我)脂肪体特写。(J–M)现场用CG14205探针杂交。(J型)正常食物中生长的幼虫;未检测到染色(Mg,中肠)。(K(K))糖养幼虫;注意肠道三个部分的染色(箭头)。(L(左)和M(M))肠道细胞特写。请注意,CG14205在肠道的特定部位高度诱导,但在脂肪体中不诱导。
然后我们问哪些组织中的基因糖表达CG14205。因此,我们执行了就地在正常食物和糖中生长的幼虫上进行杂交(图D–M)。糖在酵母糊中生长的动物的幼虫组织中没有表达(图D) 。然而,该基因在糖食幼虫的肠道、脂肪体和马尔菲管中特异表达(图E–I)。脂肪体中也有斑点状细胞质表达,我们在肠道中没有观察到,但其意义尚不清楚。CG14205在正常喂养的幼虫中也没有表达(图J) ,但糖食幼虫在肠道的三个特定区域表现出高表达(图K–M)。在脂肪体中未检测到表达。作为肠道,脂肪体和马尔菲小管在果蝇属代谢,这些结果与基因糖和CG14205参与营养信号传递。
转录因子sug的潜在靶点
的表达式配置文件糖之所以引人注目,是因为它是食糖幼虫中最高、最早上调的基因(见图B类;补充表S1)。实时RT-PCR分析证实了微阵列数据(糖糖处理1h后上调约25倍,而CG14205仅上调~2倍;数据未显示)。此外,它在肠道、脂肪体和马尔皮基亚小管中表达,表明该基因可能参与代谢控制。例如,在这种情况下,它可能激活糖中上调的脂肪合成基因,或抑制下调的脂肪合成蛋白,或两者兼而有之。它也可以通过首先激活潜在的信号受体(如CG14205)发挥作用。为了区分这些可能性,我们想确定糖通过微阵列。因此,我们使用了热休克Gal4无人机系统来过度表达糖在正常的食物条件下对幼虫进行检测,以确定哪些基因上调或下调。热冲击-Gal4/UAS-糖-在二龄期,对生长在正常食物上的窝藏幼虫进行热休克40min。我们注意到,一次40分钟的热休克导致蛹化延迟1天,男性死亡率增加(数据未显示)。热休克后6h分离RNA并与基因芯片杂交。从结果数据中,我们寻找了与糖食幼虫表现出类似消耗特征的基因。因此,在每个受调控的基因旁边,我们还列出了其在4小时糖喂养条件下的相应表达(图A) ●●●●。我们立即发现,在最高调控基因中(截止值为10.0倍),没有一个对应任何上调基因,而有三个匹配下调基因:CG8093(溶酶体脂肪酶/胆固醇酯酶)、CG11659(长链脂肪酸转运蛋白)和CG6277(胰脂肪酶)。然后,我们使用双重截止策略将潜力分组糖-调控基因:我们列出了所有受热休克调控的基因糖以2.0倍为界,然后询问哪些基因属于受糖调节的基因类别,而不是处于饥饿状态(图B) ●●●●。上调的基因糖过表达,没有一个脂肪合成基因,如乙酰辅酶A羧化酶,在列表上(除了糖,位于此列表中)。相比之下,有10个基因处于下调状态,包括一种鞘磷脂分解代谢酶(鞘磷脂酶,CG15533)和另一种胰腺脂肪酶(CG6271)。
图8。潜力的识别糖通过微阵列靶基因。(A类)热休克处理结束后6 h分离RNA,并与Affymetrix基因芯片阵列杂交。列出了在过度表达的幼虫中受到强烈调控(截止10.0倍)的所有基因糖(无人机-糖; 左栏)。其次是在4小时糖食幼虫中观察到的相应基因的折叠变化(右栏)。注意,两种脂肪酶(CG8093和CG6277)和一种脂肪酸转运蛋白(CG11659)在这两种情况下都显示出类似的模式(下调)。请参见图用于颜色代码。(B类)所有基因上调或下调>2.0倍糖过表达(左栏),并且在糖食幼虫中也受到类似的调控(图中的II类基因; 右列)。注意编码脂肪酶和其他脂肪分解代谢相关基因的下调。(C类)三种脂肪酶基因在幼虫中过度表达的RT-PCR糖(D–I)现场选择电位杂交糖靶基因。(D类)CG6277,胰脂肪酶(Pv,前胃;Mg,中肠)。(E类)CG8093,溶酶体脂肪酶/胆固醇酯酶(MT,Malpighian小管;箭头指示MT从肠道延伸的点)。(F类)CG6271,胰腺脂肪酶。(G公司)CG11659,长链脂肪酸转运蛋白。(H(H)和我)CG15533,鞘磷脂酶。(J型——哦) 现场在正常(Norm,左栏)和糖(Su,右栏)条件下对CG6277、CG8093和CG11659进行杂交。Pv,前胃;MT,Malpighian小管。注意,糖抑制幼虫组织中所有三个基因的表达。(P(P))糖信号激活基因的模型。有关详细信息,请参阅文本。
许多基因受糖过表达在糖食条件下没有变化,甚至显示出相反的调节(图A) ●●●●。然而,应该记住糖过表达研究是在正常的食物条件下进行的,不同的营养信号组合可能会导致不同的结果。在这种情况下,我们发现有趣的是CG14219基因被下调糖过表达,但在糖食幼虫中不受影响(图A) ●●●●。CG14219编码一个10-跨膜受体,与CG14205具有很高的同源性(这两个基因也分别位于基因组中;见图F) ,这是糖食幼虫中上调程度最高的基因之一(见图). 反过来,CG14205在糖过度表达。因此,与脂肪酶一样,高度同源的基因对营养信号的反应可能具有非常不同的调节行为。
RT-PCR分析证实三个脂肪酶基因(CG8093、CG6277和CG6271)对糖过度表达(图C) ●●●●。为了了解这些脂肪酶以及其他几个可能参与脂肪代谢的基因在何处表达,以及它们是否与糖,我们表演了就地正常幼虫的杂交。胰腺脂肪酶基因(CG6271和CG6277)均表达于中肠的前部,即前胃的后面(图D和F);溶酶体脂肪酶/胆固醇酯酶CG8093和鞘磷脂酶CG15533也在肠道中表达(图E、 H和I),而脂肪酸转运蛋白CG11659在马氏体小管中表达(图G) ●●●●。所有这些网站糖也表示为(见图E–I)。然后,我们提取了三个最高调控基因CG6277、CG8093和CG11659,并测试了它们在这些组织中的表达在糖处理后是否确实下调。糖处理后,它们在适当的组织中都被抑制(图J–O)。综上所述,这些结果支持了以下观点:这些参与脂肪代谢的基因是锌指蛋白的假定转录靶点糖.
讨论
我们已经使用微阵列来识别果蝇属受营养信号调节的幼虫。在这种类型的实验中,有多种组织数据的方法。我们选择使用双截止法,比较饥饿和糖喂养动物在特定时间段后基因表达水平的变化。然后,根据基因在两种营养条件下表达谱的相似性,我们将这些基因分为不同类别。这种方法在突出与糖依赖性和非依赖性代谢过程的特定方面有关的基因方面非常有效。
饥饿反应和脂肪酶
对营养缺乏的一种反应是分解脂肪,这与脂肪酶的两个基因是一致的,唇3和CG6113,在饥饿时被上调。然而,其他脂肪酶,如CG6277、CG6283、CG6271和CG8093,在饥饿条件下根本不受影响,但在糖条件下会下调。这两个脂肪酶基因均属于溶酶体酸脂肪酶/胆固醇酯酶家族。其中一种脂肪酶在饥饿状态下不受影响,但在糖的作用下下调,也属于这种脂肪酶家族;然而,其他三种具有相同调控模式的聚簇脂肪酶属于不同的家族,即分泌型胰腺脂肪酶。因此,不同脂肪酶基因的调控行为并不取决于它们编码的脂肪酶类型。此外,四种下调的脂肪酶具有不同的表达动力学,这取决于幼虫在糖上花费的时间,值得注意的是锌指基因的抑制作用糖对这四种脂肪酶的研究也相当丰富。这些结果指出了一个微调的体内平衡系统,该系统可以根据不断变化的生理需求来协调各种脂肪酶的活性。这个果蝇属基因组包含60多个编码脂肪酶的基因(Rubin等人,2000年)很明显,脂肪酶的特殊生理作用和转录调控本身就形成了一个有趣的问题。
将碳水化合物转化为脂肪的基因
在动物中,有一种将碳水化合物转化为脂肪的有效机制(Lehninger,1970年;斯特莱尔,1975年). 许多在糖中上调但在饥饿状态下保持不变的基因显然与脂肪酸合成有关,包括乙酰辅酶A羧化酶和ATP柠檬酸裂解酶。其哺乳动物同源物的转录也受葡萄糖信号调节(纽加德和麦加里,1995年). 因此,在存在高糖的情况下,即使没有其他营养物质果蝇属这与观察到的情况一致,即食用糖的幼虫的脂肪体中仍然存在油脂,而饥饿时油脂会完全分解(Zinke等人,1999年). 编码这些酶的基因的转录调控必须位于糖依赖信号启动的信号级联的末端。转录因子是这类基因中上调程度最高的两个基因糖以及10-跨膜受体CG14205是在该级联中操作的良好候选。CG14205是一个大家族的成员,其成员之间具有很高的同源性。还有一个类似的家族线虫基因。有趣的是,这个家族的决定性成员,nrf-6型在筛选耐氟西汀突变体时发现。这种抗抑郁药物,俗称百忧解,是一种选择性血清素摄取抑制剂。这个nrf-6型中的基因线虫在肠道中表达(Choy和Thomas,1999年),CG14205也表达于同一组织果蝇属这些蛋白质不同于任何其他已知蛋白质,我们在果蝇属和线虫在这一点上,我们只能猜测CG14205的功能,但有一种可能性是它作为无脊椎动物特异性神经肽或激素的受体。
糖与C2H2类胶质锌指转录因子同源性最高(Lamar等人,2001年)并且在脂肪体和中肠部分的食糖幼虫中被高度诱导。当果蝇属幼虫从正常状态转移到糖分状态。的过度表达糖导致脂肪分解代谢相关基因的显著抑制。潜在直接目标糖包括脂肪酶CG8093、CG6277和CG6271,这些脂肪酶也在糖食幼虫中下调。事实上,胰腺脂肪酶(CG6277和CG6271家族所属)是用于减肥治疗的药物奥利司他丁(Xenical)的靶点(Hill等人,1999年). 基于这些观察结果,我们提出了一个模型(图P) 其中一个未知转录因子被糖信号激活。然后激活该因子糖以及一组参与脂肪酸合成的基因,如乙酰辅酶a羧化酶和ATP柠檬酸裂解酶。糖然后抑制一组脂肪酶基因和其他参与脂肪分解代谢的基因。作为糖这是最早诱导的,这种调控机制的目的似乎是激活一种阻遏物,在脂肪酸合成途径激活之前抑制脂肪分解。目前一个悬而未决的问题是识别糖(以及CG14205和脂肪酸合成基因)和导致其激活的相应信号通路。在这种情况下,我们发现了五个紧密聚集的C/EBP蛋白结合位点,它们位于糖(我们未发表的观察)。由于C/EBP蛋白已被证明对调节脊椎动物的各种代谢基因很重要(Roesler,2000年),果蝇属C/EBP同源物可能参与糖激活。
营养信号和喂养行为
改变营养条件会使大多数动物产生不同的进食反应,许多化合物对食欲有不同的影响(布伦德尔,1991年;Rosenbaum等人,1997年). 因此,一个问题是,饮食的特定成分,如糖、脂肪和氨基酸,如何不同地改变进食行为。对于果蝇属将幼虫放在单独用盐水或糖浸泡过的滤纸上,会立即扩散。如果添加一团酵母,幼虫会迅速向这个来源移动;当酵母供应耗尽时,它们会再次散开。显然,糖不足以消除幼虫的这种觅食或“饥饿”反应。这两种情况的关键区别在于,动物靠糖生存的时间要比饥饿时长得多。因此,改变糖代谢程序的目的似乎是为了争取时间:幼虫停止生长,开始将可用的糖储存到脂肪中,同时分散,以增加找到更好食物的机会。虽然我们不知道这里确定的任何营养素控制基因是否影响进食行为,但有一些迹象表明它们可能会影响。例如,脂肪酸合成酶活性抑制剂已被证明可以减少小鼠的进食,可能是丙二酰辅酶a依赖性信号,通过神经肽和神经递质发挥中枢作用(Loftus等人,2000年). 此外,缺乏乙酰辅酶A羧化酶2基因的小鼠脂肪减少,但食物摄入量增加(Abu-Elheiga等人,2001年). 我们还发现有趣的是,跨膜受体CG14205与线虫该基因是在氟西汀抗性筛选中确定的,因为氟西汀已被证明影响蠕虫和哺乳动物的进食行为(伍特曼和伍特曼,1977年;Choy和Thomas,1999年;Sawin等人,2000年).
我们的研究还为研究“70小时变化”奠定了基础,该变化最初由贝德尔等. (1938)在这种情况下,幼虫在70小时龄前饿死,而那些在70小时后饿死的幼虫存活下来,并产生小苍蝇。比较70小时变化之前和该时间点之后的营养素依赖性基因表达的当前数据,可以深入了解幼虫生长期间代谢程序变化的机制。最后,由于糖、脂肪和蛋白质是普遍的饮食成分,我们的分析为比较基因组学方法提供了一个起点,以阐明不同生物体中营养信号的保守机制。
材料和方法
幼虫生长条件
正常食物由苹果汁琼脂平板和酵母组成,幼虫在25°C下饲养。在47–49 h AEL下收集幼虫,用水彻底清洗,然后将其放在用磷酸盐缓冲盐(PBS)或PBS以及适当浓度和类型的糖浸泡过的皮氏培养皿上的滤纸上。为了对正常食物进行控制,将幼虫进行相同的清洗程序,并放在含有部分酵母糊的PBS浸泡过的滤纸上。
RNA纯化
用水彻底清洗50至200只幼虫,将其转移到裂解缓冲液(与RNA分离试剂盒一起提供)中,并全速均质(Ultra-Turrax T25basic)2分钟。然后在室温下将裂解产物旋涡1小时。通过使用NucleoSpin RNA II或NucleoSpin RNA L试剂盒(Macherey&Nagel;包括DNase I处理)分离总RNA。对于实时PCR,使用NucleoSpin RNA II(包括DNase I处理)第二次清除总RNA。
微阵列分析
基因芯片杂交由Affymetrix授权的服务提供商进行(Affymmetrix服务供应商,Steinbeis-Transferzentrum Proteom-Analysis,德国罗斯托克)。使用的协议如下。使用50µg全RNA样品,通过T7-(dT)24引物和SuperScript II逆转录酶(Gibco)进行第一链合成。根据上标选择系统(Gibco)进行第二链合成。安在体外进行转录反应(BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit;Enzo),并将片段cRNA与Affymetrix杂交果蝇属基因组阵列(14010个基因,包括对照)。根据制造商的协议,使用基因芯片流体站(Affymetrix)执行清洗程序。通过R-藻红蛋白–链霉亲和素(分子探针)进行染色,然后使用生物素化抗链球菌亲和素抗体进行抗体扩增程序(Vector Laboratories)。使用GeneArray扫描仪(Hewlett-Packard)进行扫描。使用Affymetrix提供的软件收集数据,并在GeneSpring(Silicon Genetics)和Microsoft Excel中进行分析。我们将给定的倍数变化用于具有不同调用增加(I)或减少(D)的基因。根据Affymetrix服务,I或D中的错误数据被设置为未确定(nd)且未考虑在内。每个基因的值都是平均值,类别如文中所述。有关数据处理的更多详细信息,请参阅补充数据。
RT-PCR、实时PCR和原位杂交分析
对于RT-PCR和实时PCR,使用1µg总RNA在42°C下使用寡核苷酸d(T)引物(Amersham)和Superscript II逆转录酶(Gibco/Invitrogen)进行第一链cDNA反应50分钟。对该反应的等分试样进行PCR,总体积为25µl。根据使用的引物使用不同的周期(见补充表S2)。
对于实时PCR,反应由cDNA第一链模板(对于RT-PCR)、引物混合物(5µM,不同于RT-PCR引物,见补充表S2)和SYBR Green PCR Master mix(Applied Biosystems)组成,总体积为25µl。每个模板平行进行三个反应。用来自不同卵子采集的独立分离RNA样品重复这些步骤。这些实验是用来自Applied Biosystems的ABI Prism 7000 SDS进行的。按照制造商提供的说明,使用肌动蛋白5C对数值进行标准化,并使用Microsoft Excel进行分析。
现场杂交是用一个单链RNA探针通过修改标准程序进行的(Tautz和Pfeifle,1989年). 使用12小时卵子采集中的二龄幼虫,并将其置于糖条件下12小时。经过适当的营养处理后,将幼虫解剖,用甲醛(1:10)固定,并按胚胎处理。省略了甘氨酸处理。
过度表达分析
这个糖通过PCR从幼虫中获得cDNA,克隆到TOPO载体(Invitrogen)中,然后放入p{UAST}载体中。获得了八条独立的线,其中两条用于分析(UAS-糖1和UAS-糖3). 将平板置于37°C下40分钟,对44–48小时AEL龄的幼虫进行热休克。对于控制,热冲击-Gal4与白色苍蝇。微阵列数据是通过UAS获得的-糖-3行。