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RNA。2006年2月；12(2): 256–262.
数字对象标识：10.1261/rna.2235106
预防性维修识别码：项目经理1370905
PMID：16373483

小干扰RNA的反义链指导人类细胞组蛋白甲基化和转录基因沉默

马克·温伯格,1 路易莎·M·维勒纽夫,2 阿里·埃萨尼,2 穆罕默德·阿玛兹古伊,2 LARS AAGAARD公司,2 赵西娅·陈,三 ARTHUR D.RIGGS公司,三 约翰·J·罗斯,2和凯文·莫里斯4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

为了确定siRNA如何在人类细胞中介导转录基因沉默（TGS），我们测量了靶向启动子处的组蛋白甲基化、对活性转录的依赖性，以及siRNA介导的TGS是否需要两条siRNA链。我们在这里报道，siRNA处理增加了靶向EF1A启动子的H3K9和H3K27甲基化，并且这种增加依赖于siRNA的核特异性递送。我们还发现TGS可以由反义链单独引导，并且需要通过人类细胞中的RNA聚合酶II进行活性转录，对α-阿马纳汀的敏感性证明了这一点。通过靶向HIV-1 LTR/启动子的U3区域，证实了EF1A的反义特异性siRNA-介导TGS的观察结果。此外，我们发现siRNA EF52的反义链与瞬时表达的标记DNMT3A、靶向EF1A启动子和三甲基化H3K27相关。本文报道的观察结果表明，siRNA-介导的基因组区域靶向（启动子）、RNA Pol II功能、组蛋白甲基化和DNMT3A之间存在功能联系，并支持一种范式，即仅siRNAs的反义链就可以指导人类细胞中序列特异性转录基因沉默。

关键词：siRNA、RNAi、siRNA介导的TGS、组蛋白甲基化、转录基因沉默（TGS）、HIV-1、启动子靶向

简介

首次在表现出转基因抑制表型的转化烟草植株中观察到由小干扰RNA（siRNA）引起的转录基因沉默（TGS）。进一步分析表明，靶基因的DNA甲基化参与了抑制(Matzke等人1989). 在感染细胞质dsRNA病毒的植物中也发现了由siRNA介导的TGS；发现带有与病毒序列同源的启动子的整合转基因被沉默(Wassenegger等人，1994年). 靶向启动子序列的siRNAs也被证明会导致TGS果蝇属(Pal-Badra等人，2002年). 在植物中，经常观察到siRNA诱导的与转基因同源的内源性基因沉默，并且伴随着同源序列的DNA甲基化。TGS输入拟南芥需要siRNA代谢因子(Zilberman等人，2003年；Chan等人，2004年)和维护绒球裂殖酵母着丝粒异染色质依赖于siRNA导向的组蛋白3赖氨酸9（H3K9）甲基化(Mette等人，2000年；Jones等人，2001年；Volpe等人，2002年).

直到最近，尚不清楚哺乳动物细胞中是否存在siRNA-介导的TGS。然而，最近的报告已经证明，靶向启动子处或附近三个不同基因的siRNAs可以诱导转录沉默(Morris等人，2004年a；Castanoto等人，2005年；铃木等人，2005年；Ting等人，2005年). 其中三项研究表明，转录抑制与siRNA-靶向序列中新发现的DNA甲基化增加有关(Morris等人，2004年a；Castanoto等人，2005年；铃木等人，2005年)，需要特定于核的交付(Morris等人，2004年a)通过分别使用DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂药物5′-氮杂胞苷（5′-AzaC）和曲古菌素A（TSA）治疗，可缓解(Morris等人，2004年a). TSA参与抑制siRNA-介导的TGS的观察(Morris等人，2004年a)以及其他人已经观察到在没有DNA甲基化的情况下与siRNA介导的转录沉默和组蛋白3赖氨酸9（H3K9）甲基化的相关性(Ting等人，2005年)，表明染色质修饰在观察到的沉默中起着更深远的作用。此外，在癌细胞中，DNA和组蛋白甲基化导致的基因沉默首先依赖于H3K9甲基化(Strunnikova等人，2005年)而在植物中，组蛋白3赖氨酸27（H3K27）三甲基化也是建立DNA甲基化和基因沉默所必需的(Lindroth等人，2004年).

结果和讨论

相对于EF1A启动子中的转录起始位点，siRNA EF52与序列−104至−125同源，并且先前被证明介导内源性EF1A基因的TGS(Morris等人，2004年a). 为了研究siRNA EF52诱导的组蛋白甲基标记，我们用EF52或对照CCR5 siRNA转染293T细胞(Morris等人，2004年a)使用肽MPG，将siRNAs转运到细胞核(Morris等人，1997年). 与对照组相比，EF52处理的培养物显示H3K9和H3K27甲基化增加（图1A▶). 此外，H3K9甲基化的诱导取决于EF52 siRNA的核特异性递送（图1B▶). 在哺乳动物的X失活中，沉默是由组蛋白甲基化介导的，已证明组蛋白甲基标记在长距离上表现出来(Sharp等人，2002年；Danzer和Wallrath 2004). 为了确定观察到的组蛋白甲基标记在EF52处理的培养物中扩散的程度，我们评估了EF1A转录起始点下游720 bp处的H3K9二甲基化。在EF52中EF1A转录起始位点下游至少720 bp处观察到H3K9甲基化大约增加了四倍，但在对照转染培养物中没有观察到（图1C▶)，类似于CDH1启动子的siRNA靶向观察结果(Ting等人，2005年).

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siRNA介导的组蛋白甲基化和RNA聚合酶II功能的需要。(A类)MPG转染的EF52 siRNA诱导组蛋白甲基化。从转染EF52或对照CCR5 siRNAs（10 nM）的293T细胞中，使用核特异性两亲性肽MPG测定组蛋白3赖氨酸9（H3K9）二甲基化和组蛋白3赖氨酸27（H3K27）三甲基化(Morris等人，1997年). 转染48小时后，针对EF1A启动子进行ChIP分析(Morris等人，2004年a). 结果表示至少两个独立的实验，范围如图所示。(B)组蛋白甲基化需要细胞核特异性递送。使用MPG和Lipofectamine 2000转染试剂将EF52-Cy3+siRNAs转染到293T细胞。转染48小时后，收集培养物并进行ChIP分析。(C)H3K9二甲基化可将靶向EF1A启动子下游720 bp扩散。在靶EF52启动子下游196或720 bp处通过定量PCR检测H3K9二甲基化。用MPG将siRNAs EF52和CCR5（10 nM）转染至293T细胞，48小时后进行ChIP检测。给出了该范围的两个独立实验。(D类)用siRNA EF52转染后24小时用α-amanatin（0.05μg/mL）处理293T细胞，可将H3K9甲基化降低到与非抗体对照组相当的水平。三个独立实验的结果显示出了标准偏差。

中的最近报告S.pombe公司已证明RNA聚合酶II（Pol II）转录是siRNA介导的TGS所必需的。为了确定人类细胞中siRNA介导的转录沉默是否需要RNA Pol II转录，我们使用MPG将EF52 siRNA转染293T细胞，24小时后用α-amanatin处理一半培养物以抑制RNA PolⅡ。然后我们检测H3K9甲基化，发现α-amanatin治疗确实抑制EF52 siRNA-介导的H3K8甲基化（图1D▶). 这些数据表明，类似于S.pombe公司(Kato等人，2005年)，RNA Pol II介导的转录是siRNA介导的人类细胞中某些基因座的TGS所必需的。

对于一些启动子，TGS与DNA甲基化的增加有关(Morris等人，2004年a；Castanoto等人，2005年；铃木等人，2005年). 我们发现TGS与H3K9和H3K27甲基化增加有关，DNA甲基转移酶被认为是含有与甲基化组蛋白相关因子的复合物的一部分(Fuks等人，2003年). 在植物中，H3K9和H3K27甲基标记提供了一个组合组蛋白代码，将DNA甲基转移酶CMT3招募到沉默位点(Lindroth等人，2004年). 此外，据报道，重组、纯化的小鼠DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）可结合双链siRNA(Jeffery和Nakielny 2004). 为了扩展我们对DNA甲基转移酶在人类细胞中siRNA介导的TGS中可能发挥的作用的理解，我们开发了一种siRNA下拉分析，并筛选了含有DNA甲基转移酶类DNMT1或DNMT3A的复合物。我们发现，在粗提物中，EF52的反义链与标记的DNMT3A结合，其效率与双链siRNA类似（图2A▶). 未观察到与DNMT1的相互作用（图2A▶)尽管标记的DNMT1和DNMT3A在转染细胞中的表达相似（图2B▶). 这些数据表明，反义链可能通过与还含有DNMT3A的复合物的相互作用来指导观察到的siRNA-介导的TGS。

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siRNA与DNMT3A的相互作用。(A类)生物素/亲和素下拉后的Western blot分析表明，反义和dsRNA EF52与DNMT3A相关，但与DNMT1无关。生成标记的DNMT1和DNMT3A转染的293T细胞裂解物，并与总共500 nM生物素标记的sense（S）、antisense（AS）或双链（S/AS）siRNA以及没有生物素标记（−）的对照dsRNA孵育。用抗Flag抗体进行免疫印迹。(B)Western blot分析显示转染293T细胞裂解物中标记的DNMT1和DNMT3A的表达水平具有可比性。

在含有标记DNMT3A的细胞裂解液中，观察到siRNA的反义链与DNMT3A结合，这促使我们测试反义链是否单独起到指导TGS的作用。我们设计了包含U6启动子的质粒，以表达针对HIV-1 LTR/启动子中U3两个区域的反义、正义或组合dsRNA（分别为LTR-247和362）（表1▶). 将这些质粒和HIV-1 tat表达质粒共转染到1G5细胞中，该细胞含有一个整合的HIV-1 LTR，可以用SV40 poly（A）代替3′-LTR表达萤火虫荧光素酶(Aguilar-Cordova等人，1994年)当HIV-1 Tat存在时。我们发现，反义LTR-247 siRNA在1G5细胞中产生TGS的水平与dsRNA转染的样品相当（图3▶). 在其他实验中，我们发现反义LTR-247也能够以RNA Pol II依赖的方式引导H3K27甲基化（数据未显示）。

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LTR-247正/反义和反义单独能够靶向HIV-1 LTR的U3区域并抑制Tat介导的1G5细胞中萤火虫荧光素酶的表达。结果来自转染后24小时测量的四个独立实验，具有所示平均值的对数相对表达和标准误差。数值表示相对于实验平均值的荧光素酶表达。

表1。

用于HIV-1 U3靶向的siRNA及其靶序列

siRNA（位置）序列（目标）%GC公司
247例（B型HIV长期耐药249-267例）gtgttagagtgaggtgtg47.4
362（在B型HIV的长期耐药中为354–372）CTTTCCGCTGGGGGACTTTC公司57.9
GFP（GFP mRNA中108–126）CGATGCCACCTACGAGAGAG公司63.2
R5对照组（CCR5 mRNA中787–805）TTCTTTGGCCTGAATAATT公司31.6

观察到（1）siRNA-介导的TGS在添加5-AzaC和TSA后是可逆的(Morris等人，2004年a); （2） siRNA EF52与细胞提取物中标记的DNMT3A相关（图2B▶；Jeffery和Nakielny 2004); 和（3）组蛋白3赖氨酸甲基化，K9和K27都存在于靶向启动子处（图1A–D▶)与TGS建立期间启动子处形成的复合物一致。为了进一步研究这种假定的复合物，我们进行了三次下拉分析。用标记的DNMT3A转染293T细胞，24小时后用MPG再次转染生物素标记的正、反义EF52 siRNA。48小时后，对H3K27进行ChIP，然后进行标记的DNMT3A免疫沉淀，然后进行siRNA生物素/亲和素下拉并在最终洗脱液中对目标启动子进行PCR。我们发现，反义EF52链相对于非抗体对照组和单抗对照组分别富集了两倍和3.5倍（图4▶).

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生物素标记的反义siRNA EF52（AS+生物素）与三甲基化的H3K27、标记的DNMT3A和靶向的EF1A启动子共沉淀，而正义EF52（S+Biotin）不共沉淀。结果代表了两个独立的实验。

最初发现启动子靶向的siRNAs可以导致人类细胞中的基因沉默，这表明哺乳动物中的小RNA，果蝇属,秀丽隐杆线虫植物可以通过三种保守机制调节基因表达：转录基因沉默（TGS）、转录后基因沉默（PTGS）和翻译抑制（microRNA抑制）(Lagos-Quintana等人，2001年；Lau等人，2001年；Lee和Ambros 2001). 虽然哺乳动物中siRNA-介导的TGS之间有许多功能相似性，S.pombe公司和植物的潜在机制可能有所不同。EF52共免疫反应物的反义链在体内与瞬时表达的标记DNMT3A、三甲基化H3K27和靶向启动子共沉淀，以及反义LTR-247在抑制HIV-1 Tat诱导的U3介导的转录中有效的观察，表明其作用机制。一种模型可能是siRNA的反义链在细胞核中转移到一个也包含DNMT3A的复合物中。然后，该复合物可能由启动子的RNA同源性和直接组蛋白甲基化作为主要沉默事件指导，随着时间的推移，可能导致DNA甲基化增加。H3K9和/或H3K27甲基化与染色质的转录沉默状态密切相关(Nguyen等人，2002年；Mutskov和Felsenfeld 2004年)，并且我们观察到由启动子靶向的双链siRNA或反义siRNA处理引起的H3K9和H3K27甲基化。有趣的是，DNMT3A已被证明与HDAC-1和Suv39H1密切相关(Fuks等人，2001年,2003；Datta等人，2003年)已知与沉默染色质相关的蛋白质。与这些蛋白的如此大的复合物是否参与观察到的反义介导的转录沉默仍有待确定。

利用人类细胞，我们发现EF1A和HIV-1启动子导向的siRNA，即使只是反义链，也可以介导转录沉默并增加组蛋白甲基化。我们还证明了EF52 siRNA的反义链在体内与DNMT3A、H3K27三甲基化组蛋白和靶向启动子共沉淀，而单独的有义链没有。重要的是，观察到siRNA指导组蛋白甲基化，并通过抑制RNA Pol II来阻止这种作用，这表明siRNA介导的TGS需要转录，并且siRNA，特别是反义链，可能起到指导和/或写入组蛋白密码的作用。综上所述，这些数据表明，启动子导向的siRNAs反义链通过表观遗传修饰首先涉及组蛋白3甲基化，以RNA Pol II依赖的方式调节基因表达的控制。这些发现表明，启动子导向的siRNAs的反义链在基因调控中发挥着关键和未被充分认识的作用，这一作用可以概念化为人类的治疗应用。

材料和方法

染色质免疫沉淀分析（ChIP）

染色质免疫沉淀在4.0×106293T细胞转染siRNA EF52或对照CCR5（Ambion Silencer，最终浓度10 nM），使用MPG以10:1的电荷比（MPG:siRNA），如Morris等人（1997年）,2004年a). 转染48小时后，收集培养物，并按所述进行ChIP分析(Strahl-Bolsinger等人，1997年). 简言之，对处理过的培养物进行甲醛交联（1%，10分钟，室温），然后通过添加最终浓度的甘氨酸（0.125 M，10 min，室温）停止培养。然后将细胞在1×PBS+1/1000 PMSF（0.5 M的PMSF储备液）中洗涤两次，再悬浮在600μL的ChIP裂解缓冲液中（50 mM HEPES，pH 7.5，140 mM NaCl，10%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，1/1000 PMSF），并进行孵育（冰上10分钟）。接下来，将样品离心（5000 rpm，5 min，4°C），再悬浮在600μl ChIP裂解缓冲液中，培养（冰上10 min），然后超声处理（Branson 50细胞仪，6个间隔，20秒脉冲，2 min休息）。然后对经超声处理的样品进行离心分离（14000 rpm，10 min，4°C），去除上清液并用30μL蛋白质A/鲑鱼精子进行预清除（上游目录#16-157；15 min，4℃，旋转平台）。然后对预先清除的上清液进行离心分离（14000 rpm，5 min，4°C），并使用等效等分液（从预先清除的上层清液中）去除上清液。样品由非抗体对照、抗二甲基H3K9下拉（H3K8）和/或抗三甲基H3K27下拉（H3 K27）组成，并在无抗体（无抗体对照）的情况下进行培养，或者对于H3K6样品，使用抗二甲基H istone H3（Lys 9）抗体（上游目录#07-441）；对于H3K27样品，使用了抗三甲基-Histone H3（Lys 27；上游目录#07-449）（3小时至过夜，4°C，旋转平台）。然后用10μL蛋白质A/鲑鱼精子（直立；15分钟，室温，旋转平台）处理样品，然后向下拉动（10000 rpm，1分钟，4°C）并清洗。保存非抗体对照上清液并用作输入对照。洗涤液包括两次用1mL ChIP裂解缓冲液洗涤，两次用2mL ChIP水解缓冲液高盐洗涤（50 mM HEPES，pH 7.5，500 mM NaCl，1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，1/1000 PMSF），然后用1mL ChIP洗涤缓冲液洗涤两次（10 mM Tris，pH 8.0，250 mM LiCl，0.5%NP-40，0.5%脱氧胆汁酸钠，1 mM EDTA）。每次清洗时，将样品培养（3分钟，室温，旋转平台），然后离心（14000 rpm，3分钟，常温）。最终清洗后，通过两次处理100μL洗脱缓冲液（pH 8.0下50 mM Tris，1%十二烷基硫酸钠，10 mM EDTA）在65°C下洗脱10 min，然后离心（14000 rpm，3 min，室温）。然后通过向每个样品中添加1μL RNase A（10 mg/mL）和20μL 5 M NaCl来反向交联洗脱的络合物以及用于非抗体对照（200μL）的初始等分样品，并培养（4-6小时，65°C）。然后用10μL的0.5M EDTA、20μL的1M Tris-HCl（pH 6.5）和2μL的10mg/mL蛋白酶K（1 h，45°C）处理反向交联样品，通过苯酚/氯仿萃取回收DNA，并用引物803和804在30:30秒用PCR检测94°：55°：72°C的30个循环，与靶向EF1α启动子特异性重叠(Morris等人，2004年a). 通过使用αInnotech凝胶成像仪或定量PCR（qPCR）分析确定的积分密度值（IDV）对PCR产物进行定量；35个94°：55°：72°C循环，30:30:30秒，使用引物803和804，并标准化为质粒pVEGFPwP(Morris等人，2004年a,b条). 为了确定H3K9在EF1A转录起始位点下游196 bp的扩散范围，使用引物783（5′-GTGTGGGGAGTTCGAG-3′）和785（5′-GCGTCGCAGCAGTCA-3′）；并且为了测量EF1A转录起始位点下游720bp处的H3K9甲基化，使用引物775（5′-GGCGCGTCCAGGCACCTCG-3′）和776（5′-CCCAAGATCCAAACTCAA-3′）。HIV-LTR ChIP检测涉及最终PCR扩增步骤，洗脱液作为模板，28个周期，94°：55°：72°C，15:15:30秒，使用引物5′-247-1（5′-CCCTGGAGCCTGCATGGAAGACCC-3′）和3′-362-2（5′-CCAGAGAGACCTACGAGCAAAAAGCAG-3′），并在αInnotech凝胶成像仪上进行可视化。

生物素标记siRNA下拉框中标记蛋白的检测

总计4.0×106使用Lipofectamine 2000将15μg表达载体转染293T细胞，用于标记DNMT1或DNMT3A。所有DNMT均由A.D.Riggs（希望之城贝克曼研究所[BRICOH]）提供。48小时后，在500μL裂解缓冲液中分离细胞裂解物（细胞质和核部分）；细胞质部分（1 mM PMSF，20单位RNasin，10 mM Tris-Cl，pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.5%NP-40）和核部分（1 mM PMSF，20单位RNasin，20 mM Hepes[pH 7.0]，150 mM NaCl，2 mM MgCl21 mM DTT和0.5%NP-40）。将250μL细胞质和核组分的混合物与500 nM 5′-生物素终末标记EF52（BRI/COH DNA/RNA/肽核心设施）在4°C下培养3小时。接下来，Dynal Avidin/磁珠（7×107珠）在裂解液缓冲液中洗涤，然后直接添加到含有siRNA/Flag标记的裂解液中，并在4°C下培养1h。通过磁珠结合将siRNA/Flag复合物拉下，并在裂解液中洗涤五次。最后，通过在100μL洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl，pH 6.0，1 mM EDTA，2.0 M NaCl，0.5 M MgCl）中培养，从Avidin-biotin结合珠/siRNA中洗脱结合蛋白复合物2)在65°C下保持5分钟。在SDS-PAGE中电泳洗脱的络合物，并用抗Flag抗体进行Western blot分析。

为了确定siRNA结合的特异性，如上所述，从转染的293T细胞生成标记DNMT1和DNMT3A。然后将含有标记DNMT的细胞裂解物与siRNA EF52、正（S）或反（AS）EF52（500 nM）5′-生物素终标记物在4°C下孵育3 h。用Dynal Avidin/磁珠（7×10）分离与S或AS或S/AS（dsRNA）siRNA EF52结合的合成复合物7珠），在裂解液缓冲液中洗涤五次，然后洗脱，蛋白质复合物在SDS-PAGE中电泳，并用抗Flag抗体进行Western blot分析。

HIV-1 U3-特异性LTR靶向

如前所述，使用5′U6+1通过PCR构建HIV-1 U3 LTR靶向siRNA并克隆到pCR4-TOPO（Invitrogen）中(Lee等人，2002年)带3′引物：

LTR-247（S），5′-AAAAAAAAA GTGTTAGAGTGGAGGTGTGCGGTTCGTCCTCTCCACAA-3′；

LTR-247（AS），5′-AAAAAAAAA CAAACCTCCACTCTATAACAGTGTTCGTCTTCCACAA-3′；

LTR-362（S），5′-AAAAAAAAA CTTTCCGCTGGGGACTTTCGGTTTTCTTCCACAA-3′；

LTR-362（AS），5′-AAAAAAAAA GAAAGTCCCCAGCGGAAGCGTTTCCCTTTCCACAA-3′；

GFP（S），5′-AAAAAAAAA CTTGCCGTAGGTGGCATCGGTTTCGTCTTCCACAA-3′；和

GFP（AS），5′-AAAAAAAAA CGATGCCACCTACCAGCGAGGTCTCCTTTCCACAA-3′。

对所得克隆进行测序，并将质粒与HIV-1 Tat表达质粒pTatdsRed2共转染（1:1比例，0.5至0.5μg）(Unwalla等人，2004年)变成2×106使用Amaxa Nucleofector的1G5 Jurkat细胞。1G5细胞是通过NIAID艾滋病司NIH艾滋病研究和参考试剂项目获得的(Platt等人，1998年；Wei等人，2002年). 20小时后，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）和Turner Biosystems的Veritas微板光度计，按照制造商的协议和活体细胞标准化荧光素醇表达，测定荧光素酶的表达。

α-Amanatin介导的对siRNA诱导TGS的抑制

染色质免疫沉淀在4.0×106用siRNA EF52和对照CCR5转染的293T细胞（使用如上所述的MPG的10nM终浓度）(Morris等人，1997年,2004年a)或在4×10上6NIAID艾滋病司NIH艾滋病研究和参考试剂项目获得的TZM-Bl细胞(Platt等人，1998年；Wei等人，2002年)用质粒pTatdsRed2（0.5μg）（33）和p-LTR-247（AS）（0.5μg）共转染。转染后24小时，将一半的培养物暴露于α-阿马纳丁（0.05μg/mL），24小时后收集处理和未处理的培养物，并如前所述进行ChIP测定(Strahl-Bolsinger等人，1997年). 用抗二甲基H istone H3（Lys 9）或抗三甲基H iston（Lys 27）对培养物进行免疫沉淀，并使用引物803和804（EF52特异性）对最终洗脱物进行PCR检测，检测周期分别为94°：55°：72°C和30、30和30秒（分别为αinnotech或qPCR）(Morris等人，2004年a)或使用U3 HIV-1 LTR-特异性5′-247-1和3′-362-2（如前所述）进行28次循环。

三重免疫沉淀：H3K27 ChIP/-标记-DNMT3A/生物素RNA

总计4.0×106将293T细胞接种，24小时后转染Flag-DNMT3A（15μg）。第二天，使用3.4μM MPG储备液（3μL/mL培养基）再次用100 nM EF52生物素标记的siRNA（反义或仅义）转染Flag-DNMT3A转染的培养物。在正义或反义siRNA/MPG转染48小时后，收集培养物，按照前面所述进行ChIP分析，并稍作修改。在用H3K27三甲特异性抗体（1μg）进行免疫沉淀后，洗脱物与40μL EZVIEW红色抗旗帜M2亲和凝胶珠（Sigma）孵育过夜。接下来，用TBS-Mod缓冲液（50 mM Tris HCl，400 mM NaCl，pH 7.4）洗涤结合珠三次，然后用3×标记肽（15μg）竞争洗脱。然后将所得洗脱液转移至100μL（6–7×108Dynabeads M-280 Streptaviden在2×洗涤缓冲液（50 mM Tris HCl，400 mM NaCl，pH 7.4）中预先洗涤。洗脱液/珠浆在轨道振动筛上在4°C下培养15分钟，然后用磁珠分离器捕获。将捕获的小球在2×洗涤缓冲液中洗涤三次，然后在100μL的2×洗脱缓冲液（pH 6.0下的10 mM Tris-HCL，1 mM EDTA，2.0 M NaCl）中在65°C下洗脱5分钟。然后，对所得洗脱物进行反向交联，并通过苯酚/氯仿萃取回收DNA，然后使用引物803和804（如前所述）对EF1α启动子进行PCR 30–35个94°：55°：72°C的循环。

致谢

我们感谢R.Allshire、S.Grewal和A.Verdel对siRNA-mediated TGS的评论，以及J.Longmate的统计建议。这项工作得到了NIH HLB RO1 HL07470至J.J.R.、R01 HL83473至K.V.M.以及NCI综合癌症中心拨款5P30 CA33572至J.J.R和K.V.M的资助。

注意事项

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.rnajournal.org/cgi/doi/10.1261/rna.2235106.

参考文献

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文章来自核糖核酸由提供RNA协会