高危型人乳头瘤病毒（HPV）是90%以上宫颈癌病例的病因(41). 人类乳头状瘤病毒包括80多种不同类型，其中一些是通过性传播的，主要感染生殖器皮肤和粘膜。大多数生殖器疣是由6型和11型性传播HPV引起的，而16型和18型最常与宫颈癌相关(2). HPV相关恶性肿瘤是世界上癌症相关死亡的主要原因，在女性中，宫颈癌的发病率和死亡率仅次于乳腺癌(23). 事实上，在发展中国家，宫颈癌是35至45岁女性死亡的主要原因(40). 据报道，全世界每年新增50多万例宫颈癌病例。HPV还与阴茎、外阴、肛门、呼吸道和皮肤肿瘤相关(24,40). 不幸的是，目前对与HPV感染相关的癌前肿瘤的治疗并不充分(2,7). 仅在美国，每年筛查HPV引起的宫颈肿瘤的成本负担就超过50亿美元（D.R.Lowy，未发表的数据）。
预防接种是减少病毒感染相关发病率和死亡率的最有效公共卫生措施。由于HPV感染会导致宫颈肿瘤，因此针对HPV抗原的疫苗应该能够有效预防或治疗HPV相关肿瘤。zur Hausen假设HPV对免疫系统的刺激对控制宫颈肿瘤至关重要(41)事实上，对HPV的免疫反应可能控制感染的易感性、疾病的严重程度、缓解和致癌的可能性(12). 进一步的证据表明，与器官移植、妊娠、老年或人类免疫缺陷病毒感染相关的免疫抑制会增加HPV感染和宫颈肿瘤的发病率(32). 不幸的是，目前的HPV疫苗方法无法诱导免疫系统对该病毒的长期识别。由于HPV在粘膜中感染和复制，因此具有特定粘膜组织倾向性的疫苗将有利于产生粘膜和全身免疫。
棉尾兔乳头瘤病毒（CRPV）兔模型在HPV研究中具有一些优势。CRPV和HPV基因组具有显著的序列同源性，它们各自的基因编码具有类似功能的蛋白质(11). CRPV感染遵循高度可预测的疾病过程(4,5,17,34). CRPV通过家兔划痕感染表皮，导致接种后3-4周内形成多发孤立性皮肤乳头状瘤。这些乳头状瘤在接种部位形成，几周后发展为融合生长。恶性进展经历了一系列临床和组织学阶段，如HPV相关疾病(23,37). CRPV乳头状瘤的自发性消退发生在不到10%的感染兔中。随着时间的推移，60%至75%的兔子的乳头状瘤发展为鳞状细胞癌。诱导乳头状瘤的发病率与病毒剂量有关(5). 乳头状瘤可在特定动物的多个部位诱发，这些部位仍局限于接种部位。这允许在一只兔子身上重复检查和活检许多乳头状瘤，并为宿主基因型提供了内置的控制。
L1是一种55-kDa蛋白，是主要的病毒衣壳蛋白，占乳头瘤病毒病毒的90%至95%。L1既是病毒进入的主要附着蛋白，也是中和抗体的主要靶点。L1诱导强烈的类型特异性中和抗体反应，保护接种动物免受后续感染，从而将该蛋白确定为预防接种的主要候选疫苗靶点(31). 犬口腔乳头瘤病毒L1蛋白对犬的系统免疫(1,36). 在兔子中，用L1细菌融合蛋白和CRPV病毒样颗粒（VLP）免疫可防止乳头状瘤形成(6,8,9,15,21,22). L1融合蛋白免疫需要大量非变性蛋白（250μg）和佐剂，然后进行几次强化注射(21,22). 非变性L1 VLP，无论是否添加佐剂，以及随后的两次强化注射（每次50μg抗原），也能显著防止乳头状瘤的形成(6,8). 尽管HPV-VLP疫苗已进入早期临床试验，但由于VLP不会在体内复制，因此尚不清楚它们是否能在人体内诱导足够和持续的L1特异性免疫。
传统上，活病毒疫苗对病毒感染提供了最有效的保护。由于在长时间内细胞内高水平合成特定抗原，此类疫苗可诱导强烈的细胞和体液免疫反应。然而，在没有载体致病性的情况下实现足够的蛋白质表达是活病毒疫苗面临的主要挑战。在过去的几年里，Rose及其同事率先使用水泡性口炎病毒（VSV）作为表达和疫苗载体(三,18,19,26-28,30).
VSV是一种非片段、负链RNA病毒，其基因组为11-kb，编码五种主要蛋白质：核衣壳（N）、磷酸蛋白（P）、基质（M）、糖蛋白（G）和RNA依赖性RNA聚合酶（L）。每个蛋白的表达都来自一个单独的mRNA，这些mRNA在细胞质中顺序转录(28,29). 目前尚未确定插入VSV基因组的外源序列数量的上限。至少两个额外的转录单元，总计4.5 kb，可以添加到VSV基因组中并从中成功表达(18).
表达外源病毒蛋白的重组VSV（rVSV）被认为是良好的候选疫苗，因为VSV可引起强烈的体液和细胞免疫反应。此外，VSV可以通过粘膜表面感染，引起强烈的系统免疫，可能还包括局部粘膜免疫(26). 产生粘膜免疫的潜力是对HPV疫苗特别有吸引力的一个特征，因为感染和复制的部位通常是生殖粘膜。VSV重组体相对于野生型VSV减弱(27)甚至野生型病毒对感染者的致病性也微不足道(33). 此外，极少数人感染了VSV，这限制了普通人群暴露前免疫的流行。使用VSV矢量的实际优点很多。病毒生长到非常高的滴度（5×109PFU/ml），可在几乎所有哺乳动物细胞以及许多其他类型的细胞中繁殖。它可以在过夜的菌斑分析中进行分析，并且很容易以毫克数量制备。用表达CRPV主要衣壳蛋白（VSV-L1）的rVSV免疫家兔可能为非注射性预防接种和预防乳头瘤病毒诱导的疾病提供模型。
材料和方法
病毒和接种物。
培养rVSV，并按照之前所述测定rVSV血凝素的滴度(26). 培养质粒纯化的重组VSV-L1，并在幼仓鼠肾脏（BHK）细胞上测定其滴度（BHK-21；美国型培养物收集）。重组体解冻并用Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）稀释（用我-谷氨酰胺、丙酮酸钠、高水平葡萄糖和碳酸氢盐[3.7 g/升]）（产品编号56499；JRH Biosciences，Lenexa，Kans.），在接种前立即达到适当的滴度。对于实验2中的病毒增强注射，使用SW41转子，在Beckman L8-70M超离心机中以38000 rpm在4°C下离心1 h，通过10%蔗糖半纯化VSV-L1。将颗粒重新悬浮在400μl Tris-EDTA缓冲液（pH 7.6）中。
CRPV库存K216用于挑战(35). 在激发前立即解冻并稀释CRPV。
pVSV-CRPV-L1的产生。
从CRPV pLAII克隆中扩增出L1基因（1510bp）(38)上游底漆5′-GCGCTCGAGATC自动液位计GCAGTGTGGCTGTCTACG-3′和下游引物5′-CCCAGCGCGGCCGCTAGCTTA公司AGTACGTCTTTGCG-3′引入限制性内切酶位点Xho公司我和Nhe公司一、 促进定向克隆到全长VSV质粒（pVSVMXA2XN2）。带下划线的序列分别对应于L1开放阅读帧的开始和结束密码子。全长VSV质粒和L1 PCR产物在Xho公司我和Nhe公司我通过限制性内切酶消化克隆位点。L1片段被连接到Xho公司我和Nhe公司VSV的I位点（用T4 DNA连接酶编码G和L蛋白的基因之间）。
如上所述，在BHK-21细胞（美国典型培养物保藏中心）上回收VSV-L1(19). 简而言之，用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3感染BHK细胞(10)感染倍数为10，在含有5%胎牛血清和100 U青霉素-链霉素（维持培养基；Life Technologies，Gibco-BRL，Grand Island，N.Y.）/ml.全长pVSV-CRPV-L1和支持质粒（pBS-NT0、pBS-PT0和pBS-LT0）的DMEM中孵育1小时，均受T7启动子控制，转染到痘苗病毒感染细胞中，并在无血清DMEM中培养4至5小时。然后用维持培养基替换培养基，培养2天。收集上清液，通过0.2μm孔径的无菌过滤器过滤，以去除剩余的痘苗病毒，并将其传代到新鲜的BHK-21细胞上。当发现细胞质效应（CPE）时（～2天后）收集培养基，并再次通过0.1-μm孔径的无菌过滤器过滤。
间接免疫荧光分析。
将BHK细胞接种在5×10的玻璃盖玻片上4电池/3.5-cm2板。第二天，用VSV恢复试验的上清液（1 ml/板）感染细胞。将细胞在37°C下培养4至16 h，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并在室温下在3%多聚甲醛中固定20 min，然后用PBS-甘氨酸（10 mM）洗涤两次。取下盖玻片，并在37°C下与一级抗体（针对VSV-G蛋白的小鼠单克隆抗体I1和I14）孵育30至45分钟【北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆威克森林大学医学院微生物和免疫学系Douglas Lyles赠送】或CRPV-L1蛋白特异性多克隆兔血清[35])在含有10 mM甘氨酸和5 mg牛血清白蛋白（BSA）/ml（PBS-甘氨酸-BSA）的PBS中以1:100稀释。与一级抗体孵育后，将盖玻片在PBS-甘氨酸中冲洗两次，在37°C下与二级抗体（异硫氰酸荧光素结合的山羊抗鼠[Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pa.]或德克萨斯州红结合山羊抗兔[Jackson-ImponResearch]）以1:50在PBS-glycine-BSA中孵育30至45分钟。与二级抗体孵育后，盖玻片在PBS-甘氨酸中漂洗两次，并在-0.1 M的甘油中固定n个-没食子酸丙酯溶液放在玻片上，试管面朝下。细胞用尼康Microphot-FX荧光显微镜和40×平面复消色差物镜进行检查。
放射性标记免疫沉淀分析。
用rVSV感染BHK细胞（感染的多重性，5到10），并在37°C的维持培养基中培养1小时。抽吸培养基并用1毫升维持培养基替换，然后再培养平板3小时。用PBS洗涤细胞两次，和1 ml标记培养基（15%DMEM，80%DMEM减去蛋氨酸，100μCi35将S-Translabel（Easy Tag EXPRESS蛋白标签混合物，产品编号NEG772；NEN Life Sciences，Boston，Mass.]，5%胎牛血清）添加到每个板中。对于放射性标记的细胞提取物，将细胞培养1 h，在PBS中洗涤两次，并在500μl冰镇十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液（50 mM Tris[pH8.0]，0.5%SDS，1 mM二硫苏糖醇）中在冰上裂解20至30 min。将裂解液在100°C下加热2 min，然后添加4体积的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（1%NP-40，1%脱氧胆酸盐，0.1%SDS，150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl[PH7.4]）。将裂解液剧烈涡旋并转移到1.5-ml的冷Eppendorf管中，并在4°C下通过离心将碎片制成颗粒。将上清液转移到新鲜的预冷1.5 ml Eppendorf试管中，并在−20°C下储存。
将L1的一级抗体以1:100的稀释度添加到200至300μl放射性标记细胞提取物中，并添加SDS以达到0.2%的最终浓度。抗体提取液在37°C下培养45分钟。通过添加30μl固定剂沉淀样品金黄色葡萄球菌（Pansorbin；Calbiochem）并在37°C下培养30分钟。通过离心将沉淀颗粒化，并在1.5 ml RIPA缓冲液中清洗三次，然后再次造粒。将颗粒重新悬浮在含有2-巯基乙醇的30至40μl样品缓冲液中，煮沸3至5分钟，然后再次造粒。小心取出上清液，并将其装入SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-10%PAGE）凝胶中。
ELISA法。
酶联免疫吸附试验（ELISA）用于测定CRPV VLP（在杆状病毒表达系统中制备，由CRPV L1和L2蛋白组成；VLP-L1）的特异性血清抗体滴度。对VLP-L1抗原反应的特异性血清L1抗体与CRPV中和作用之间的关联先前已被证实(35). 通过在100μl PBS/well中添加50 ng VLP-L1或绿色荧光蛋白（GFP；Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，Calif.），对96个平底聚苯乙烯微孔板（Nunc MaxiSorp，Roskilde，Denmark）进行涂覆。在4°C培养过夜后，用PBS-0.5%吐温20（洗涤缓冲液）清洗平板，并用3%明胶-PBS在37°C下封闭1小时。每孔加入最终体积为100μl的0.5%BSA-PBS的兔血清稀释液的两倍滴定，并将平板在37°C下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液冲洗。随后，将100μl 1:10000多价辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔免疫球蛋白（Biosource，Camarillo，CA）加入每个孔中，然后将每个平板在37°C下孵育1小时。清洗平板，并通过向每个孔中添加100μl 3,3′，5,5′四甲基联苯胺（TMB）过氧化物酶底物（Kirkegaard&Perry Labs Inc.，Gaithersburg，Md.）来进行分析。通过添加100μl 1 N HCl终止反应，并在Benchmark Microplate Reader（Bio-Read Laboratories，Hercules，Calif.）中使用415 nm的波长测量吸光度。从实验兔的对照值中减去对照值，并将吸光度值0.2设置为VLP-L1阳性滴度的临界值。
兔子免疫。
所有动物程序均由耶鲁大学动物护理和使用委员会批准。两公斤重、无特定病原体、随机繁殖的新西兰白兔（Millbrook Farm Inc.，Concord，Mass.）抵达后被单独安置在一个隔离的房间里。在研究开始前，对兔子进行1周的驯化。给兔子皮下注射1毫克乙酰丙嗪（Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph，Mo.）/千克体重，并通过耳朵上的永久纹身或不可磨灭的墨水进行识别。在免疫日和免疫后的不同时间点收集血清。
对于实验1，VSV-L1，VSV-GFP（5×105将PFU/兔子置于200μl DMEM中）或培养基中经鼻给药。在初次VSV-L1免疫后7周，通过将10μg变性L1蛋白注入3M尿素中[使用BL21（DE3）用pET-20b+表达系统（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）纯化]，在接种VSV-L1-疫苗的兔子中测量延迟型超敏反应。
实验2中的兔子接种了VSV-L1（5×105PFU/兔200μl DMEM）通过鼻内、皮内、肌肉内或阴道内途径。初次免疫后8周，兔子接受高剂量的同源VSV-L1（1.1×10）加强注射7PFU/rabbit in 150μl DMEM），按相同路线给药。接受阴道内VSV-L1的兔子没有接受强化免疫。每天观察所有兔子的不良临床症状、食欲不振或腹泻。
从鼻拭子中回收病毒。
对于实验1中的兔子，在免疫后第1天到第14天收集鼻拭子，使用用无血清DMEM润湿的无菌棉签，并转移到含有1.5 ml DMEM-青霉素-葡萄霉素的试管中。样品储存在4°C下。为了从重组病毒的初始感染中检测可回收病毒，在收集后24小时内，用200μl（每孔）10倍系列稀释的鼻拭子培养基感染BHK细胞（6孔板中约80%融合）。细胞在室温下培养1小时，并在PBS中清洗。向每个孔中添加2毫升维护培养基，并在37°C下培养平板，每天观察病毒相关CPE 2至3天。为了确认回收病毒的身份，从病毒CPE阳性细胞中收集上清液，并通过直接免疫荧光法筛选GFP表达或通过上述间接免疫荧光法筛查L1表达。
VSV中和试验。
将血清在56°C下加热灭活30至60分钟，并在96孔板中用PBS连续稀释两倍。通常，将25μl血清与75μl PBS混合，然后转移50μl所得混合物进行连续稀释。稀释液在37°C下在200个野生型rVSV（rwtVSV）PFU的存在下培养30至45分钟。每个孔中添加大约500个BHK细胞，并在37℃下用5%的CO培养平板2持续2天。在每次检测中，稀释血清并进行两次分析。中和效价通过病毒CPE对细胞的总抑制来测定。
CRPV挑战。
如前所述，在初始VSV-L1免疫后10至13周，用CRPV对兔子进行攻击(25). 在每个实验中，还对三只未接种疫苗的兔子进行了挑战。家兔皮下注射每公斤2至3毫克乙酰丙嗪进行镇静。右侧剪下一块4英寸宽、6英寸长的毛皮。CRPV储备在PBS中稀释至1:50、1:200和1:800浓度（分别针对高、中、低激发剂量）。每只兔子用30μl的稀释液感染三个部位，然后进行松土处理。激发后每周监测乳头状瘤的形成，持续8周。对于单个兔子，通过平均CRPV激发后每个部位（共九个部位）无乳头状瘤的天数总和来确定乳头状瘤形成的平均天数。整个研究中乳头状瘤阴性的部位被视为56天（8周）无乳头状瘤。对每个乳头状瘤进行三维测量（长度、宽度和高度）。保护水平由以下方程式确定：[1−（接种兔的乳头状瘤总体积/对照兔的平均乳头状瘤体积）]×100。
结果
CRPV-L1在rVSV中的表达。
为了确定基于VSV的疫苗预防乳头瘤病毒诱导疾病的潜力，我们构建并恢复了一种rVSV，该rVSV编码G和L基因之间的CRPV主要衣壳L1基因（图。). 通过间接免疫荧光分析和放射免疫沉淀分析在体外对VSV-L1表达55-kDa CRPV-L1蛋白进行了表征。使用间接免疫荧光法，在rwtVSV-和VSV-L1感染细胞中检测到VSV-G蛋白的表面和细胞质表达（图。). 相反，L1的表达明显局限于VSV-L1感染的BHK细胞的细胞核。CRPV-L1在感染的全细胞提取物中无法区分（数据未显示）。由于L1的表达低于预期，因此使用放射免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE分析，以浓缩蛋白质。55-kDa蛋白存在于VSV-CRPV-L1感染的全细胞提取物中，但不存在于感染的细胞上清液或rwtVSV-或模拟感染的BHK细胞中（图。).
（A） VSV-L1基因组示意图。VSV-L1的基因组显示为3′→5′取向，并指出了主要VSV蛋白的开放阅读框。将CRPV-L1基因插入VSV G和L基因之间。对照VSV-GFP中的GFP基因也插入VSV G和L基因之间。（B） VSV-L1 L1表达的免疫荧光。VSV-G蛋白在VSV-L1和rwtVSV感染的细胞中均有表达，主要定位于质膜（下两个面板）。相反，L1蛋白表达高度局限于核室，仅在VSV-L1感染的细胞中可见（左上角）。（C） 从VSV-L1免疫沉淀L1表达。在rwtVSV和VSV-L1提取物中都存在VSV蛋白（L、G、N、P和M）（左面板）。相反，L1仅存在于VSV-L1提取物中（右侧面板）。
低剂量鼻腔rVSV免疫。
在评估rVSV免疫的安全性和有效性的初步实验中，兔子要么用VSV-L1或VSV-GFP进行单次、低剂量的鼻内疫苗接种，要么用培养基（未接种疫苗）接种。在免疫后的第一周内，在一些兔子的鼻分泌物中检测到VSV脱落，持续时间从0天到3天不等。然而，VSV脱落的持续时间是疫苗接种后血清VSV中和抗体滴度和随后对CRPV攻击的保护的不敏感预测因子。兔子接种疫苗没有不良反应。在所有VSV-GFP-和5只VSV-L1-免疫兔中的4只中，均出现阳性血清VSV-中和抗体滴度（定义为>1:8）（表). 然而，接受VSV-GFP的兔子的滴度明显高于接受VSV-L1的兔子(对= 0.0316; 学生的t吨测试，假设方差相等）。在组织培养中，与VSV-L1相比，VSV-GFP也表现出更强的复制动力学（数据未显示），这表明L1蛋白的产生可能会减缓病毒的复制。
表1。
| 疫苗接种策略 | 疫苗一
| 兔子没有。 | VSV中和抗体滴度（相对于免疫时间）d日
|
|---|
| 初级（PFU，5×105) | 增压器（PFU，1×107) | 第3周 | 第5周 | 第7-8周 | 第10-13周 |
|---|
| 出口1 | VSV-GFP（识别号） | | 1 | 1:4,096 | 1:4,096 | 1:8,192 | 1:8,192 |
| | | 2 | 1:1,024 | 1:2,048 | 1:2,048 | 1:2,048 |
| | | 三 | 1:2,048 | 1:4,096 | 1:4,096 | 1:16,384 |
| | | 4 | 1:4,096 | 1:1,024 | 1:4,096 | 1:2,048 |
| | | 5 | 1:1,024 | 1点1024分 | 1:2,048 | 1:2,048 |
| VSV-L1（识别号）b条 | | 6 | 1:2,048 | 1:2,048 | 1:2,048 | 1:8,192 |
| | | 7c（c） | - | - | - | - |
| | | 8 | 1:2,048 | 1:1,024 | 1:2,048 | 1时16384分 |
| | | 9 | 1点128分 | 1:256 | 1:512 | 1:512 |
| | | 10 | 1:1,024 | 1:512 | 1:2,048 | 1:8,192 |
| 出口2 | VSV-L1（身份证） | VSV-L1（身份证） | 1 | ND（无损检测） | 1:256 | 1:256 | 1:1,024 |
| | | 2 | ND（无损检测） | 1:512 | 1:1,024 | 1:4,096 |
| | | 三 | ND（无损检测） | 1:512 | 1:512 | 1:8,192 |
| VSV-L1（识别号） | VSV-L1（识别号） | 4 | ND（无损检测） | - | - | 1:1,024 |
| | | 5 | ND（无损检测） | 1:128 | 1:128 | 1:2,048 |
| | | 6 | ND（无损检测） | 1点1024分 | 1:512 | 1:4,096 |
| VSV-L1（i.m.） | VSV-L1（i.m.） | 7 | ND（无损检测） | 1:256 | 1:128 | 1:8,192 |
| | | 8 | ND（无损检测） | 1:256 | 1:256 | 1:8,192 |
| | | 9 | ND（无损检测） | 1点1024分 | 1分512秒 | 1:8,192 |
| VSV-L1（静脉注射） | | 10 | ND（无损检测） | - | - | - |
| | | 11 | ND（无损检测） | - | - | - |
| | | 12 | ND（无损检测） | - | - | - |
所有接种VSV-GFP的兔子都产生了抗GFP的血清抗体（数据未显示），5只接种VSV-L1的兔子中有3只产生了高水平的VLP-L1血清抗体（表). 为了评估对L1蛋白的迟发型超敏反应，给接种了VSV-L1的兔子皮内注射变性L1蛋白。由于抗原中存在尿素，因此结果不确定。然而，该程序后的血清VLP-L1抗体滴度没有受到影响，保持在先前滴度的两倍稀释范围内。
表2。
| 疫苗接种策略 | 疫苗一
| 兔子编号。 | ELISA VLP-L1抗体滴度（相对于免疫时间）d日
| 防护等级（%）e（电子） |
|---|
| 初级（PFU，5×105) | 增压器（PFU，1×107) | 第7-8周 | 第10-13周 |
|---|
| 出口1 | VSV-L1（识别号）b条 | | 6 | >1:12,800 | 1:6,400 | 100 |
| | | 7c（c） | - | - | 79.3 |
| | | 8 | >1:12,800 | 1:6,400 | 100 |
| | | 9 | - | - | 0 |
| | | 10 | 1:6,400 | 1:3,200 | 98.3 |
| 出口2 | VSV-L1（身份证） | VSV-L1（静脉注射） | 1 | 1:6400分 | >1:12,800 | 100 |
| | | 2 | >1:12,800 | >1:12,800 | 99.4 |
| | | 三 | 1:1,600 | 1:6,400 | 100 |
| VSV-L1（识别号） | VSV-L1（识别号） | 4 | - | 1:6,400 | 100 |
| | | 5 | - | 1:3,200 | 100 |
| | | 6 | >1:12,800 | >1:12,800 | 100 |
| VSV-L1（i.m.） | VSV-L1（i.m.） | 7 | 1:3,200 | 1:3,200 | 100 |
| | | 8 | 1:3,200 | >1:12,800 | 100 |
| | | 9 | >1:12,800 | >1:12,800 | 100 |
| VSV-L1（静脉注射） | | 10 | - | - | 不适用 |
| | | 11 | - | - | 不适用 |
| | | 12 | - | - | 不适用 |
单次低剂量鼻内接种VSV-L1疫苗对CRPV诱导的乳头状瘤形成具有显著的保护作用（图。). 一只VSV-GFP免疫兔的乳头状瘤消退，与远交系兔CRPV感染中观察到的自发消退率一致(14,17). VSV-GFP疫苗接种的免疫反应并没有改变对CRPV挑战的反应。单剂量鼻内接种VSV-L1后，兔的VSV-中和和VLP-L1抗体滴度存在显著差异。在另一项实验中，用低剂量（5×105PFU）鼻内VSV-L1在校正滴度变异性方面无效（数据未显示）。如果检测到主要的VSV中和抗体，则VSV或VLP-L1滴度没有改善。因此，我们试图通过低剂量VSV-L1疫苗接种和高剂量（107PFU）增压。
保护免受实验1中的CRPV挑战。在用鼻内VSV-L1疫苗（灰条和▴）免疫一次的兔子、用鼻内VSV-GFP疫苗免疫一次（斜线条和▪), 和未免疫对照兔（黑条和×）。显示了高激发（A）、中等激发（B）和低激发（C）CRPV剂量的结果。误差条表示平均值的标准误差。
通过不同途径接种疫苗后对VSV的反应（实验2）。
为了比较不同途径接种VSV-L1的效果，对兔子进行了VSV-L2免疫，并通过皮内、鼻内或肌肉内途径进行增强。一组兔子也接受了一剂阴道内VSV-L1，但没有增加剂量。病毒浓度增加了20倍用于增强，因为在早期的实验中，我们已经表明，用低剂量的VSV-L1增强病毒是无效的，可能是因为病毒的中和作用。接种任何疫苗后，在所有兔子中均未观察到不良临床症状。初次免疫后5周，通过皮内或肌内途径免疫VSV-L1的所有兔子（6只中的6只）、通过鼻内途径免疫的3只兔子中的2只以及通过阴道途径免疫的0只兔子（表). 阴道接种疫苗在技术上具有挑战性，导致剂量不一致。由于这些挑战以及该组中任何一只兔子都未能血清转化为VSV或L1，这些兔子没有得到增强。
初次免疫后5周和8周，通过任何途径接种VSV-L1的兔子之间的VSV中和抗体滴度没有显著差异(对>0.38，方差分析[单因素]；α < 0.1). <0.1).>同种VSV疫苗通过相同途径增强所有兔子的VSV中和抗体滴度（皮内途径，对< 0.0919; 鼻内途径，对< 0.0387; 肌内途径，对<0.0006[学生的t吨测试；两个样本配对表示平均值]）。在强化免疫后，通过肌肉途径（肌肉途径与皮内途径）免疫的兔子中，VSV中和抗体滴度显著升高，且最为一致，对< 0.0725; 肌肉注射与鼻内注射，对<0.0015[学生的t吨测试；两个样本，假设方差相等）。通过鼻内或皮内途径免疫的兔子在增强后VSV中和抗体滴度之间没有差异(对> 0.2).
疫苗接种诱导的L1免疫应答（实验2）。
初次接种后，通过皮内（3/3）或肌肉内（3/3）途径用VSV-L1免疫的所有兔子中都产生了L1特异性抗体，但只有1/3的兔子通过鼻内途径免疫（图。). 两个无反应者（兔子4和5）的VSV中和抗体反应也最差。在同源性VSV-L1增加后，所有血清VLP-L1滴度相等或增加，所有最初无应答的兔子血清转化为高VLP-L2滴度（表). 因此，鼻腔给药途径存在相当大的变异性，而这种变异性是通过增加高剂量的同源疫苗来克服的。
实验2兔体内VLP-L1抗体。通过皮内（A）、鼻内（B）或肌肉内（C）途径免疫兔子，并使用VLP-L1蛋白通过ELISA测定抗体滴度。显示了免疫前（免疫前）、初次注射后8周（初次注射后）和初次注射后13周（即同源VSV-L1加强剂注射后5周）兔子的测试结果。
保护免受CRPV挑战（实验2）。
所有通过肌内（第3个，共3个）或鼻内（第三个，共三个）途径免疫VSV-L1的兔子和通过皮内途径免疫的兔子中的2个都能完全防止CRPV诱导的乳头状瘤形成（图。). 然而，皮内注射组的3只兔子中有1只在一个激发部位发生了乳头状瘤（高激发剂量）。乳头状瘤发病时间延迟，免疫兔在CRPV激发后35天出现，而对照兔为29.7±4.6天（平均值±标准偏差）(对<0.0003[学生的t吨测试；假设方差相等]）。在所有VSV-L1-免疫组中，无乳头状瘤部位的数量显著增加，通过鼻内或肌内途径接种VSV-L1的兔子27个部位中有27个部位无乳头状癌，通过皮内途径接种的兔子27个中有26个部位无乳突状瘤，而对照组27个中只有1个（图。). 经皮内VSV-L1免疫的唯一一只兔的乳头状瘤总体积为18.4mm三挑战后，与平均2918毫米相比三用于对照兔(对<0.0680[学生的t吨测试；假设方差相等]）。从这些数据中，我们得出结论，疫苗的免疫途径和剂量水平显著影响VSV-L1疫苗接种反应。肌肉内或鼻内接种VSV-L1疫苗可以完全防止CRPV诱导的乳头状瘤形成。我们的鼻内VSV-L1疫苗是目前候选的乳头状瘤病毒疫苗中唯一的疫苗，是第一种完全预防乳头状瘤形成的非注射方法。
实验2中对CRPV挑战的保护。显示了经皮内接种VSV-L1疫苗的兔子的无乳头状瘤部位的平均百分比和平均乳头状瘤体积（自然对数）（浅灰色条和♦), 鼻内（深灰色条形和▪), 肌肉注射（斜线棒和▴）路线和未接种对照兔（黑棒和×）。显示了高激发（A）、中等激发（B）和低激发（C）CRPV剂量的结果。误差条表示平均值的标准误差。
讨论
用表达CRPV-L1蛋白的VSV重组疫苗接种兔子，可诱导对CRPV-L蛋白的特异性体液免疫，并对随后的乳头瘤病毒攻击起保护作用。在使用单一低剂量鼻腔给药的初始实验中，发现对兔子的保护不完全，但在随后的实验中，用高剂量给兔子助推，发现了对兔子的完全保护。这种剂量反应观察只能通过鼻腔给药途径推断，因为单剂量疫苗接种没有使用其他给药途径进行评估。
在对表达GFP的rVSV和L1的rVSVs作出反应的兔子中，发现VSV中和抗体滴度显著升高。L1蛋白表达可能抑制VSV复制或具有细胞毒性。支持这一假设的是，VSV-L1在组织培养中的复制滴度低于VSV-GFP（滴度降低了10到100倍）。与rVSV系统中其他外源蛋白的表达相比，rVSV体外细胞L1表达水平也较低(26,27). 这通过需要从感染的细胞提取物中免疫沉淀L1蛋白来进行蛋白质检测来证明，这对于VSV重组体来说通常是不必要的。低表达水平的解释尚不清楚，但可能与CRPV-L1中密码子的使用有关，因为对于牛乳头瘤病毒和HPV16-L1，更常见的tRNA的密码子取代显著增加了表达(20,39).
对小鼠rVSV免疫的研究表明，VSV和外来抗原的特异性抗体滴度随着时间的推移而持续上升，无需随后的强化注射；然而，原因尚不清楚(27). 在实验1中，我们还观察到VSV中和滴度在13周内逐渐升高，但间隔时间不短。滴度增加的一个可能解释是VSV的抗体亲和力增加，而不是抗体量增加。VLP-L1抗体在免疫后7至8周表现出最高滴度，并且在激发时仍保持较高水平。在实验2中，在加强注射后，VSV和VLP-L1的滴度显著而急剧地升高。增强剂剂量增加了20倍，以帮助克服初始疫苗接种中产生的VSV抗体的即时中和作用。只对那些对初次接种无效的兔子来说，注射等量的同源病毒增强剂是有利的。VSV-L1免疫所产生的免疫持续时间尚待确定。
免疫途径是兔模型中对VSV-L1产生反应的一个重要变量。通过皮内和肌肉内途径给予VSV-L1可提供显著的抗体反应和对抗挑战的保护。鼻腔给药为优化黏膜免疫提供了一种有吸引力的方法，这对于预防HPV病例非常重要，因为HPV感染的主要部位是生殖粘膜。此外，非注射性分娩方式可能有助于疫苗接种并降低总体成本，特别是在发展中国家，宫颈癌是35至45岁女性死亡的主要原因(40). 虽然通过鼻内途径给予低剂量疫苗对小鼠非常成功，但对兔子来说可能需要更高剂量，因为在这些实验中，低剂量疫苗会产生高度可变的VSV-和VLP-L1滴度。这种变异性可能会限制这种途径作为一剂免疫的使用，尽管使用更高滴度或更高水平的表达载体可能会克服这个问题。用高滴度病毒增强以克服初始鼻内接种问题的成功支持了这一观点。我们尝试用VSV-L1进行阴道内免疫，但实验2中接种物的输送和保留存在技术问题，无法评估通过该途径进行免疫的效果。
在未来的研究中，对几个因素进行优化，可以使用单剂量进行完全保护。这些因素包括增加rVSV的L1蛋白表达水平，改变L1从核内到胞质内的表达位置，和/或改变接种的剂量、时间表和数量。L1的核定位可能会限制其表达或呈现，以进行抗体产生的免疫监测。我们在VSV-L1感染的BHK细胞的感染上清液中未检测到L1蛋白（通过免疫沉淀分析和SDS-PAGE分析进行测试）。哺乳动物细胞中表达的L1可能不像昆虫细胞中那样以VLP的形式从细胞中释放出来(16). 改变L1序列以允许L1从细胞中释放，可能会增强L1向免疫系统的呈现。此外，根据表达位点的3′→5′取向，VSV蛋白和表达在VSV中的外源蛋白的表达水平逐渐减弱，其中3′取向位点的表达水平减弱最少，5′取向位点表达水平减弱最多(27). 因此，将L1插入上游N基因附近的位置可能会改善蛋白质表达并增强对L1蛋白的免疫反应。
减毒rVSV活载体在接种疫苗的动物中诱导非常强的体液和细胞免疫，并提供针对外来病毒抗原的持久保护性免疫(13,27,30). 本报告的结果证明了在rVSV系统中从DNA病毒中表达病毒蛋白的可行性，以及使用非注射性鼻内VSV-L1活疫苗预防乳头瘤病毒诱导的疾病的潜力。
