向水泡性口炎病毒RNA基因组中添加基因：位置对表达稳定性的影响

摘要

控制非片段负链（NNS）RNA病毒转录的许多关键原理单核糖核酸使用原型弹状病毒进行了鉴定，水泡性口炎病毒（VSV）。VSV有一个11-kb的负义RNA基因组。在基因组的3′末端，有一个47-核苷酸（nt）先导RNA序列，依次是编码病毒核衣壳蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、附着糖蛋白（G）和病毒RNA依赖性RNA聚合酶（L）的五个基因，以54-nt 5′末端RNA序列结束(23). 先导序列包含聚合酶结合和信号复制和转录所必需的元素(16,35). 拖车包含复制所需的序列以及顺式-新复制RNA组装成粒子的作用信号(15,35).

VSV首次表明，NNS RNA病毒的转录起始于单个3′-近端启动子位点，单顺反子mRNA是由每个基因的强制顺序转录产生的(1,三). 在单个聚合酶进入位点的框架内，在每个基因的开始和结束以及基因连接处都有保守的序列，这些序列是每个信使核糖核酸启动和终止的信号(4-6,29,30). 此外，每个上游基因的转录终止是在下一个下游基因启动所必需的，这与转录的顺序性质一致(5). 转录是控制VSV基因表达的主要步骤。启动子近端基因转录量最大，每个后续下游基因转录量逐渐减少(31). 这种转录产物产量的减少被称为衰减(14). 当聚合酶穿过每个基因连接点时，会导致下游产物减少约25-30%，这被认为是由于聚合酶在终止或再启动的某个步骤中解离所致(14).

每个基因末端、基因间二核苷酸和下游基因起点的序列统称为基因连接，在VSV中保存良好(23). 基因连接的广泛突变已确定了mRNA多聚腺苷化、终止和下游启动及修饰所需的序列(5,6,13,28-30). 终止和多聚腺苷化所需的序列是每个基因末端发现的保守的3′…AUACUUUUU…5′序列和基因间二核苷酸3′的第一个核苷酸。。GA.5′(5,6,29). 改变AUAC的任何核苷酸都会降低终止效率，而将C残基改变为任何其他核苷酸都会取消终止。类似地，甚至用一个单核苷酸缩短U7束，或用一个异源核苷酸打断它，都可以消除终止和多聚腺苷化(5). 此外，AUAC四核苷酸的碱基组成控制聚合酶在U7束上滑动并生成聚腺苷酸尾部的能力(4).

每个下游mRNA的转录最初显示需要序列3′…UUGUCNN…5′在每个基因的起始处保持不变，并受基因间二核苷酸的第二个核苷酸的影响(6,29,30). 最近的工作表明，还涉及其他上游序列(第9页). 如上所述，聚合酶需要终止每个上游基因才能转录下游的基因。如果聚合酶未能在基因末端终止，它就会读取基因连接并合成一个通读RNA，而不是下游基因的单顺反子mRNA。

基因的受控表达对病毒的生命周期至关重要。例如，N蛋白的数量对最佳基因组复制至关重要，正如前面通过产生工程VSV所示，其中N基因的位置从3′-近端位置改变为连续的远端位置(33). 我们发现，当N基因被转移到连续的启动子远端位置时，N基因的转录以逐步的方式减少，相应地，病毒基因组的整体复制也以逐步的形式减少(33). 因此，这些病毒的复制能力可以通过改变这个关键基因的转录水平来控制。

在目前的工作中，我们通过在每个VSV基因连接处插入一个额外的转录单位来测试负链RNA病毒基因表达的转录控制原理的几个方面。这使我们能够测试基因的位置是否控制了表达水平，以及是否所有的病毒基因连接都能同样容易地接受另一个基因。

异源基因已从VSV和许多其他NNS RNA病毒的基因组中的不同位置表达，其表达水平不同(7-9,17,24). 此外，添加额外基因对复制的影响差异很大，在某些情况下影响很小或没有影响，在其他情况下导致复制减少100倍以上。在某些复制受损的情况下，添加的基因的产物可能会抑制复制。在其他情况下，序列改变，如克隆过程中引入的限制性内切酶位点，可能会影响复制或表达水平。然而，迄今为止，在任何情况下都没有从所有可用的位置检查过相同基因的表达和稳定性。

在本文报道的工作中，我们比较了以相同的方式在每个基因连接处插入相同的转录单位而不改变基因连接序列对基因组稳定性、表达稳定性和病毒复制的影响。重要的是，添加的转录单位被设计为不表达可能对病毒产生选择性优势或劣势的蛋白产物。在每个内部VSV基因连接处添加的转录单位包含保守的VSV转录起始和终止序列，但缺少翻译起始序列或主要开放阅读框，从而避免了蛋白质产物反馈影响任何转录或复制步骤的可能性。此外，通过信使核糖核酸的代谢标记来检测转录，这使我们能够直接比较病毒转录物，并避免了在测量蛋白质产物或酶活性时可能出现的相对翻译效率、功能或蛋白质稳定性问题。

我们的结果表明，插入位置决定了附加基因的表达水平，而且，添加的基因在基因组中的所有位置都保持稳定。然而，只有基因组中的某些位置稳定地保持了额外转录单位的表达。对进化为抑制添加基因表达的病毒群体基因组的分子分析表明，抑制添加基因的机制是快速选择突变，从而消除上游基因的终止，从而沉默下游单顺反子mRNA的启动。这些数据进一步加深了我们对转录控制的理解，并表明转录终止是在单个转录启动子范围内有效调控下游基因表达的关键步骤。

这些结果与NNS病毒作为载体和疫苗递送剂的使用直接相关，因为它们表明，添加基因的表达水平可以由其插入位置控制；然而，他们也表明，并非所有插入位置对于外源基因的表达都是稳定的。

材料和方法

RNA合成分析。

通过直接代谢标记感染5倍病毒的细胞来分析RNA合成（见图。​图1）1)或10（见图。​图3）。三). 细胞暴露2.5小时[^三H] 放线菌素D（10μg/ml）存在下的尿苷（33μCi/ml）。如前所述，收集细胞，制备细胞质提取物，并通过凝胶电泳分析RNA(33). 使用PDI密度计320i定量荧光凝胶的自动放射自显影。根据尿苷含量定量RNA种类的摩尔量。给出的结果代表了至少三个独立实验。如前所述，在用特定寡核苷酸（[基因，核苷酸，极性]N，336至351，−；P，1420至1437，−，PhiX插入物，5′GCGCCAGTTAACAGTCG3′，−：L，7580至7599，+）退火后，对RNA进行RNase H定向切割，并通过凝胶电泳和荧光分析回收和分析切割产物(6).

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图1。

在每个VSV基因连接处插入和表达一个额外的、相同的转录单位。（A） 四个VSV基因连接处661-nt非编码转录单元插入位置的图示。携带额外基因的回收工程病毒根据插入的I基因的添加位置命名：NIP、PIM、MIG和GIL。（B） 由病毒NIP、PIM、MIG和GIL引导的RNA合成，以及从没有额外基因的亲本cDNA克隆中回收的野生型病毒。VSV特异性RNA被标记为[^三H] 从感染后1.5小时开始，在放线菌素D存在下放置尿苷2小时，并通过凝胶电泳进行分析。图左侧显示了基因组RNA、五种VSV mRNA和插入的I基因的mRNA的位置。P和M mRNA合并。（C） 基因组中不同位置表达的I mRNA的摩尔量。通过放射自显影的密度分析对RNA进行定量，并计算与N mRNA表达相关的摩尔量。

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图3。

由在两次额外传代后在每个病毒基因连接处插入额外基因的病毒所引导的RNA合成。（A） 由NIP-P2、PIM-P2、MIG-P2、GIL-P2和野生型病毒引导的RNA合成的比较。RNA被标记为[^三H] 放线菌素D存在下的尿苷（如图图例所示。​图1）1)并用凝胶电泳进行分析。（B） 通过将N或I mRNA序列特异性的负义寡核苷酸或L基因特异性的正义寡核苷酸退火为来自NIP-P2感染的RNA（标记为面板a中的标记），然后在有（+）或无（−）的条件下培养，分析N-I RNA的身份（箭头所示）核糖核酸酶H和凝胶电泳。

结果

插入额外基因对病毒复制的影响。

通过分析培养的BHK-21细胞中的子代病毒产生来检测病毒复制。所有具有额外基因的病毒复制到与野生型病毒相似的水平（从没有额外基因的亲本cDNA中回收），病毒NIP的情况除外（图。​（图2）。2). 与野生型病毒相比，NIP病毒的复制减少了10到30倍，这反映在病毒爆发规模的减少。

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图2。

在每一个VSV基因连接处插入一个额外基因的病毒复制。通过在感染3个PFU的BHK-21细胞中单步生长，与野生型病毒相比，检测插入了额外基因的病毒的复制潜力。对来自P0和P2的所有病毒进行分析。为简单起见，显示了NIP-P0、NIP-P2、PIM-P2、MIG-P2和GIL-P2的结果。PIM、MIG和GIL病毒的复制水平在P0和P2时基本上无法区分。插图显示了感染后24小时每个细胞的产量。

NIP病毒复制减少的一种解释是，向基因组插入额外的基因将引入额外的连接特异性转录衰减步骤，这将降低所有下游基因的表达水平。N和P蛋白的适当相对摩尔比对VSV的复制很重要(12,21). 在N和P基因之间插入一个额外的基因不应影响N基因的表达，但有望从野生型水平减少P蛋白的摩尔量。这一点得到了确认，如下所示。

回复病毒基因组序列。

我们使用RT-PCR来确定回复病毒的基因组序列。扩增了从N基因末端延伸至M基因起点的基因组片段，包括N-I、I-P和P-M基因连接（图。​（图4）。4). 该产品的序列通过两种方式进行分析。首先，通过凝胶纯化分离批量PCR产物，并直接分析每个基因连接处的序列，以检查病毒群的序列。通过I-P基因连接的批量PCR产物的序列为野生型（图。​（图4），4)与P-M接头的情况一样（数据未显示）。然而，在最初的病毒中，N-I连接处的序列明显是野生型，带有一个不间断的U7道，在两次传播的病毒中明显存在异质性（图。​（图4C4摄氏度).

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图4。

插入基因两侧基因连接处的序列分析。（A） VSV保守基因连接序列及其与子代mRNA的关系。（B）用于RT-PCR分析初始和P2病毒基因组的引物位置图。（C） NIP-P2基因组RNA批量PCR产物的序列分析。

为了确定异质群体中单个病毒物种的基因连接处的序列，对来自上述两个独立传代的病毒群体的基因组进行了两个独立的RT-PCR：NIP-P2和NIP-P2.2病毒。对RT-PCR产物进行了分离和克隆，并对35个独立的DNA克隆（15个来自NIP-P2，20个来自NIP-P2.2）进行了分离，并在N-I、I-P和P-M连接的两个方向上进行了测序。序列分析总结如表所示​表1。135个无性系中有34个的P-M连接序列为野生型。非野生型的一个P/M连接克隆将P-M U7区延伸至U8。在35个克隆中，33个克隆的I-P连接处的序列为野生型。在两个非野生型克隆中，I-P结合处的U区一个为U8，另一个为U2CU4。相反，35个克隆中只有4个克隆的N-I连接序列为野生型；在其他31个克隆中，有几种类型的突变（表​（表1）。1). 最常见的变化是C残基（U2CU4或U4CU2）阻断了U7束，在35例患者中有14例发生这种变化。第二个最常见的变化（35例中的11例）是U段缩短为U6。先前的研究表明，转录终止需要U7区。异源核苷酸阻断U束或单核苷酸缩短U束可消除滑移和终止(5). 第二个最丰富的变化涉及U7束之前的AUAC四核苷酸的改变（表​（表1），1)，任何变更都会减少终止(5).

表1。

NIP-P2病毒35个cDNA克隆的基因间连接序列^一

连接顺序	IG连接处显示变化的克隆数量			更改
	N-I型	I-P公司	P-M公司
3′. . AUACUUUUU UUUG AUGUC。5′	4	33	34	重量
U型
..auacuuuuuugauguc。	三	1	1	U型8
▴
..AUAC公司.UUUUU GAUGUC。	11	0	0	U型6
..AUACUU公司C类UUUGAUGUC。	13	1	0	U型2铜4
..AUACUUUUC类UUGAUGUC。	1	0	0	U型4铜2
..澳大利亚。。UUUUU GAUGUC。	1	0	0	澳大利亚。
..答C类ACUUUUU UUG AUGUC。	2	0	0	ACAC公司

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^一IG，基因间；WT，野生型。

这些数据表明，已知能够抑制转录终止的突变是在经过两次传代的病毒的N-I基因连接处被选择的。在每个相同的DNA克隆中检测到的两个下游连接，即I-P和P-M基因连接，积累了一个突变，在检测的70个连接序列中，只有一个会消除终止。由于VSV基因连接处的序列高度保守，这些数据提供了强有力的内部控制，表明在N-I连接处观察到的变化不是由RT或PCR中使用的酶对这些序列的滑移或错误引起的。

与NNS病毒转录的强制性顺序性相一致，上游基因转录的终止失败会导致该连接处的聚合酶通读，并阻止下游基因的聚合素启动。伴随这些序列发现，我们观察到单顺反子I mRNA的合成在两次传代中受到抑制，而在传代病毒中合成了双顺反子N-I RNA（图。​（图3A）。3A级). 这些结果与N基因末端突变消除终止一致，因此，聚合酶通过基因连接读取以生成多顺反子RNA。这应具有消除添加基因转录引入的额外衰减步骤的效果。为了确定这是否属实，我们比较了原始病毒分离物和两次传播病毒的蛋白质合成。

讨论

许多NNS RNA病毒在基因组中的不同位置表达了外源基因(7-9,17,24,32). 在所有情况下，添加的基因在基因组中都保持稳定，但添加的基因对病毒复制的影响有所不同。在某些情况下，例如在P和M基因之间向牛瘟病毒添加绿色荧光蛋白，复制速度减慢，但最终滴度与野生型病毒相当(32). 在其他情况下，如将萤火虫荧光素酶添加到仙台病毒的最3′位点，复制减少了两到四倍，斑块较小，而在新城疫病毒的情况下，在最后两个基因HN和L之间添加氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因，复制减少100倍(8,17). 从这些报告中，对于插入额外基因的位置的影响以及对病毒复制潜力的潜在影响，没有发现明显的相关性。评估这些报告时的另一个考虑因素是，在某些情况下，野生型序列保持在添加的基因连接处及其周围，而在其他情况下，在可能具有调节作用的序列中引入了变化。NNS基因组中所有可用位置的同一基因的稳定性和表达此前尚未进行过检查。

在本文报道的工作中，我们以相同的方式在VSV的每个基因连接处插入了一个相同的转录单位，这样就不会在基因连接序列中引入任何变化。然后，我们检查了基因组中添加基因的稳定性、转录单位表达的稳定性以及在不同位置添加基因对病毒复制的影响。该实验的关键在于，添加的转录单位被设计为不表达可能对病毒产生选择性优势或劣势的蛋白产物。报告的结果表明，插入位置决定了添加基因的表达水平，并且添加的基因在基因组中的所有位置都保持稳定。此外，只有在N和P交界处插入一个额外的基因，才会导致病毒复制潜力的显著降低；在单步生长分析中，所有其他连接处的插入对复制没有可测量的影响。

在传代后，NIP病毒在两次传代内恢复到野生型水平。与此同时，两次传递的NIP-P2病毒失去了作为单顺反子mRNA的插入基因的表达。相反，它被表达为双顺反子可读RNA的下游一半。当病毒聚合酶未能在上游基因连接处终止时，会产生可读RNA。当这种情况发生时，下游基因作为离散的单顺反子mRNA的转录受到抑制，因为下游启动需要上游终止(6). 这反过来导致衰减步骤的丢失和所有下游基因的表达增加。

对插入基因之前和之后的病毒基因连接以及下游的下一个连接（N-I、I-P和P-M基因连接）的序列分析表明，虽然I基因端的序列仍然是野生型，但插入基因之前的N基因端序列快速累积突变。观察到几种类型的突变。最常见的突变是在基因末端中断U7束或缩短1nt。第三种突变是基因末端四核苷酸AUAC的改变。在以前使用亚基因复制子的研究中，缩短U区或中断U区的突变都表明可以消除转录终止，而改变四核苷酸的四个核苷酸中的任何一个都会降低终止效率(5). NIP-P2病毒N基因末端突变的积累与N基因末端终止的缺失以及插入基因作为单顺反子mRNA的表达缺失相关。这些数据通过病毒种群中的自然选择，对之前对单个核苷酸在终止中的作用进行的诱变分析，提供了引人注目的遗传确认(5,6,13,29). 未发现N-I基因间二核苷酸和I基因启动序列累积变化。此外，插入物下游的I-P和P-M基因连接的序列没有累积突变。这些发现提供了内部控制，即在N基因末端观察到的突变不是涉及分析恢复基因组的RT-PCR的伪影。他们进一步表明，基因间连接在本质上并不容易出错。

来自N和P基因之间的插入基因表达不稳定的原因可能是由于N蛋白与P蛋白的摩尔比的破坏引起的复制缺陷以及该比率对有效基因组复制的影响(12,21). 基因组复制需要持续供应可溶性N蛋白来包裹新生复制RNA(20). 以前的工作表明，氮磷蛋白摩尔比的改变会影响功能性氮蛋白的水平，因为P蛋白是一种伴侣，可以防止氮自我聚集并在复制中失去功能(12). 另外，改变需要相互作用的其他蛋白质的相对摩尔比也可能是关键的。以前的工作中，将VSV三个中心基因的顺序重新排列为所有可能的排列，并没有在氮磷比受到干扰的每一种情况下导致复制劣势。特别是，在细胞培养中复制了一种基因序列为3′-N、G、M、P、L-5′的病毒以及野生型病毒，这表明还有许多复杂的相互作用有待了解。

这里的数据表明，在任何基因连接处插入一个额外的基因都会导致插入下游所有病毒蛋白的表达下调（表​（表2）。2). 这是由于添加的基因转录引入了额外的衰减步骤。虽然在P-M、M-G或G-L基因连接处具有插入物的所有病毒的复制与没有插入物的野生型病毒的复制相当，但P蛋白摩尔量减少了30%以上的NIP-P0病毒的复制减少了一个数量级，这表明它的复制处于不利地位。NIP-P2病毒具有野生型复制水平，所有病毒蛋白的野生型相对量约为，尤其是N/P蛋白摩尔比。因此，N基因末端的突变抑制了转录终止，因此产生了可读RNA，消除了额外的衰减步骤，并将下游基因的表达恢复到接近野生型水平。

相反，PIM、MIG和GIL病毒保持插入基因的表达至少10代。这一发现与之前的报告相似，之前的报告显示，来自VSV G和L基因之间的CAT基因或CD4的表达分别在至少15或26代中保持稳定(22,24). 然而，一株表达G和L之间麻疹病毒融合蛋白（F）基因的VSV在三代后失去了F基因的表达(22). 原因尚不清楚，但作者推测F蛋白对VSV生长有毒。F表达的缺失与先前基因末端的突变积累和聚合酶阅读有关，如本文所述。这使得作者认为转录停止序列可能是突变的热点。然而，我们对三个此类信号的序列分析表明，基因末端突变仅在沉默插入基因表达的地方积累。因此，我们的数据表明，基因末端不是突变热点，而是在添加基因的转录不利于病毒复制的情况下，将迅速选择沉默附加基因表达的最有效方法。在转录是强制性顺序的NNS病毒中，每个基因的有效终止是下游基因表达的关键。VSV的最佳终止需要包含基因末端和基因间连接的第一个核苷酸的第12 nt处的野生型序列，改变这些核苷酸中的任何一个都可以减少或废除有效终止。

众所周知，VSV的RNA依赖性RNA聚合酶的聚合酶错误率约为10⁻³到10⁻⁴每轮拷贝的错误公司百分比(25-27). 这种错误率加上缺乏校对机制，导致这些病毒以准种的形式存在(11). 从cDNA克隆中回收病毒是一个严格的克隆过程，但这无异于通过从单个病毒颗粒中提取子代产生的单个斑块进行生物克隆。当病毒复制到10滴度时⁸每毫升PFU，可以预期它作为准物种存在。从cDNA中回收的工程病毒经过两到四次传代后，其扩增倍数已达数百万倍。因此，它们很可能是由于聚合酶错误事件而存在多种突变的准种。可以很容易地选择对病毒有利的突变(11,18,19).

野生型序列是在第一个大传代NIP-P0中恢复的病毒的N-I连接处的优势序列，PCR产物的批量序列分析显示了这一点，并且从该病毒群大量合成了单顺反子I mRNA这一事实证明了这一事实。然而，在两次传代后，单顺反子mRNA的表达几乎完全被抑制，从基因组的独立RT-PCR扩增中获得的单个克隆序列的分析结果与病毒准种一致，在准种中，群体中的大多数病毒代表的病毒具有复制的选择性优势，因为突变消除了N端终止这些变化与消除连接特异性衰减事件、恢复蛋白摩尔比率以及病毒复制到野生型水平有关。综上所述，这些数据表明，在单个转录启动子和强制顺序转录的范围内，选择改变上游基因终止效率的序列是NNS RNA病毒中下游基因表达沉默或减少的有效手段。

本文报道的研究结果对NNS病毒作为载体和疫苗的使用具有重要意义。从积极的一面来看，他们表明异源基因的表达水平可以通过基因相对于3′启动子的位置来控制。然而，他们也警告说，并非基因组上的所有位置都会产生外源基因的稳定表达。

最后，尽管在P-M、M-G和G-L连接处具有插入物的病毒以及在单步生长曲线中没有插入物的野生型病毒被复制，但与野生型病毒相比，确定这些病毒的适合性将是令人感兴趣的。确定插入转录单位的大小以及添加另一个基因连接及其伴随的衰减步骤是否对病毒构成选择性劣势也很重要。

致谢

参考文献