人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白在病毒表面的寡聚结构

摘要

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的包膜蛋白（Env）介导对病毒生命周期至关重要的功能，包括病毒与靶细胞的粘附以及病毒与细胞膜的融合。Env前体gp160通过共翻译易位进入管腔内质网，在此发生必要的成熟步骤，如N-连接糖基化、二硫键形成和寡聚化(11). 细胞蛋白酶在高尔基复合体中的裂解在进入细胞表面之前也是病毒感染的必要条件(23). 切割的产物，表面亚基gp120和跨膜（TM）亚基gp41，通过非共价相互作用保持结合。gp41内的TM域将gp41和gp120的寡聚物复合物锚定在感染细胞的表面，并在出芽后锚定在病毒粒子的表面。因此，Env的功能形式是低聚物。此外，寡聚体结构影响Env的抗原性，Env是宿主中和体液免疫反应的主要靶点。来自感染者的单克隆抗体（MAb）的病毒中和能力是通过与细胞相关的低聚物Env结合而不是通过与单体Env结合来预测的(15,25).

Env显示出相当大的构象灵活性。gp120和细胞表面受体CD4以及趋化因子受体家族成员之一之间的顺序相互作用触发gp120和gp41的构象变化。这些变化被认为导致gp41 N末端融合肽插入靶细胞膜，并最终导致感染细胞或病毒与靶细胞之间的膜融合（参考文献综述12和35). 结晶分析表明，当与预测的gp41 N端和C端α螺旋区相对应的肽混合后，N端肽与三个C端肽以反平行方向填充在卷曲线圈外表面凹槽中形成了一个三标记的卷曲线圈核心(7,32). 反平行排列将N端螺旋的N端和C端螺旋的C端放置在棒状结构的同一端。这种排列意味着N末端定位的融合肽和C末端定位的TM结构域（结晶片段中没有这两个结构域）非常接近。这种结构被认为是gp41在融合过程（融合后构象）后的构象，融合肽和TM结构域位于同一膜上。

融合激活前HIV-1 Env天然构象寡聚结构的性质尚不确定。采用化学交联和蔗糖梯度沉淀的生化方法表明，重组gp160可形成二聚体和高阶低聚物(8,10). 也有人建议，缺少TM结构域和细胞质尾部（gp140）的可溶性未分离重组Env可以形成二聚体和四聚体(9)或二聚体和三聚体(13,27). 相反，据报道，缺乏复杂碳水化合物基团的gp140形成了相对均匀的三聚体群体(37). 先前已经描述过重组gp120二聚体(5)而从重组gp160衍生的gp120在某些条件下显示为二聚体(24)但在其他条件下为单体(10,29). 病毒衍生的gp120三聚体也有报道(30). 所报道的寡聚态的差异可能是由于难以通过电泳解析大的交联糖蛋白，或者在重组蛋白的情况下，可能反映了由于截短或突变物种的分析和不同表达系统的使用而导致的寡聚态的实际差异。我们最近发现另一种灵长类免疫缺陷病毒猴免疫缺陷病毒（SIV）的病毒相关环境是三聚体(6). 在本研究中，我们使用平行的生化和生物物理策略来确定HIV-1病毒表面Env的寡聚状态。

病毒相关HIV-1环境作为一种主要的低聚物物种进行净化。

艾滋病病毒1型_{明尼苏达州}用蔗糖密度梯度沉淀法纯化病毒，并用2，2′-二硫代二吡啶处理，这种方法可以阻断病毒的感染性，但不会损害Env的结构或功能完整性(26). 为了评估病毒粒子表面gp120/gp41复合物的四元结构，在病毒粒子裂解之前进行化学交联，以保持寡聚物接触，否则容易被洗涤剂破坏(10). 病毒（33.3 mg总病毒蛋白存于46 ml体积的磷酸盐缓冲盐水[PBS]中）与最终浓度为1 mM 3,3′-二硫代双（磺基琥珀酰亚胺丙酸盐）（DTSSP；Pierce）的交联剂交联，如前所述，该交联剂是一种硫醇可裂解的胺反应交联剂(6). 然后通过添加最终浓度为1%的氢化Triton X-100（TX-100h）（Calbiochem）来裂解病毒。通过抗gp41胞质结构域MAb C8免疫亲和层析从裂解液中纯化Env(1)根据制造商的建议，已与CNBr活化的Sepharose（Amersham Pharmacia Biotech AB）偶联。将裂解产物和Sepharose-coupled C8在4°C下混合过夜，在室温下混合2 h，然后用PBS-0.1%TX-100h广泛洗涤，用100 mM甘氨酸-0.1%TX-100h-0.02%叠氮化钠（pH 2.8）洗脱结合蛋白，然后立即中和。浓缩洗脱液使用Superdex 200柱（Amersham Pharmacia Biotech AB）进行凝胶过滤色谱，PBS-0.1%TX-100h-0.02%叠氮化钠作为缓冲液(6).

在存在还原剂（DTSSP交联断裂）的情况下，对等分的单个凝胶过滤部分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并用gp120特异性MAb D19进行免疫印迹(9)，并将每个分数的结果表示为总环境特异性信号的百分比。Env解析为对称峰，大多数蛋白质在48至51 ml洗脱（图。​（图1A）。1安培). 在还原条件下对48至51组分池进行SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色，结果显示存在对应于gp120和gp41的条带（图。​（图1A，1安培，插图）。还检测到一条微弱的污染蛋白质带（在gp120和gp41带之间），该带占总蛋白质的不到5%。未还原的DTSSP交联蛋白的免疫印迹（图。​（图1B）1B年)结果表明，Env的电泳迁移率低于250-kDa质量标准，而单体gp120的电泳迁移速度高于250-kDa质量标准（基于还原Env的SDS-PAGE分析）（图。​（图1A，1安培，插图），表明Env是寡聚物。此外，所有交联的Env都迁移到相同的位置，这表明Env是一种主要的寡聚物。浓缩凝胶过滤部分的分析（数据未显示）表明，部分60-62中存在少量Env，这与一些低聚物的离解或部分离解一致。

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图1。

病毒衍生HIV-1环境的凝胶过滤分析。（A） 将凝胶过滤部分的等分样品在还原剂存在下进行SDS-8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（交联断裂），并用HIV-1 gp120特异性单克隆抗体、小鼠免疫球蛋白G特异性兔多克隆血清和碘化蛋白A进行顺序免疫印迹。gp120通过荧光屏放射自显影术定量。Blue Dextran 2000（给出空隙体积）在分数43中有一个洗脱峰。（插图）在存在还原剂和考马斯蓝染色的情况下，通过SDS-4至20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析48至51组分池。（B） 在无还原剂（保持交联）的情况下，通过SDS-5%PAGE分析凝胶过滤部分的等分样品，并如上所述进行免疫印迹。面板A（插图）和B中的条表示250-kDa标记蛋白的电泳迁移率。

预融合激活构象中的HIV-1 Env是三聚体。

凝胶过滤分析已用于通过与校准标准的比较来估计球形蛋白质的质量；然而，我们以前对HIV-1 gp120和SIV-Env的研究表明，Env是非小叶的，因此无法通过这种方法进行质量测定(5,6). 扫描透射电子显微镜（STEM）(19)沉积平衡分析是一种生物物理方法，可用于确定形状相关的质量。将Env和烟草花叶病毒依次吸附在铜-甲基支撑的碳网格上，在5μl等分样品中，浓度分别约为0.02至0.05和0.4 mg/ml，并按照前面所述进行环境质量的STEM测定(6). 使用与Env分子位于同一区域的烟草花叶病毒颗粒校准质量值。对分数48和49组成的池中795 Env分子测量质量的直方图进行检查，发现峰值呈高斯分布（图。​（图2A）。2安培). 该分布的平均值为457 kDa，标准偏差为86 kDa（表​（表1）。1). 类似地，组分50和51池中753个Env分子的测量质量的直方图显示了平均值为448kDa和标准偏差为92kDa的高斯分布（图。​（图2B；2B型; 表​表1）。1). 这些数据与Env三聚体的预期质量（441.9 kDa）高度一致。由于用于生成STEM图像的低剂量，糖基化的异质性和随机实验误差可能是导致标准偏差的原因。结合交联剂DTSSP（分子量608.51）预计不会大大增加获得的总质量值。对第二种独立纯化的病毒相关HIV-1 Env制剂进行的STEM分析显示，48至50组分的质量值为469 kDa（数据未显示）。在大约20%到30%的单个Env分子的STEM图像中，观察到明显的三角形形态（图。​（图3）。三). 这种形态与之前观察到的完整病毒、纯化病毒衍生的SIV Env三聚体和SIV gp140三聚体的SIV环境类似(6,16).

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图2。

通过STEM图像定量分析确定病毒衍生HIV-1环境的质量分布。所示为凝胶过滤组分48和49（a）池中795个分子和组分50和51（B）池中753个分子的分析结果。

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图3。

病毒衍生HIV-1环境分子STEM图像的蒙太奇，呈现三角形形态。图示为混合凝胶过滤组分48和49的图像。平滑用于减少像素化。条形=50 nm。

使用Optima XL-A/I分析超离心机（Beckman）通过沉降平衡测定单个凝胶过滤部分中Env的重量平均分子量。将最终浓度为0.1至0.5 mg/ml的120至135μl样品体积加载到细胞中。在转子温度为10°C时，在四种不同的转子速度（7000、8500、10000和12000 rpm）下测量沉积平衡吸光度数据集（波长280 nm）。如前所述，通过使用8.43%（wt/vol）蔗糖的最终浓度使溶剂密度与TX-100h的密度相匹配，消除了环境相关TX-100h对环境质量的潜在贡献(6). HIV-1的质谱分析_JRFL公司gp120（从重组gp140中分离；D.Sheeley和R.Center，未发表的数据）可用于测定每个潜在N-连接糖基化位点（1.739 kDa）的平均碳水化合物摩尔质量贡献。该值与每个潜在位点的平均碳水化合物摩尔质量值非常一致，这些值是使用重组衍生的哺乳动物细胞表达的BH8的gp120的质谱分析计算的（P.Earl和K.Parker，未发表的数据），SF2(三)、和GB8(17)菌株（范围为每个站点1.68至1.78 kDa）。1.739-kDa值用于估算病毒衍生HIV-1 Env的碳水化合物摩尔质量，从而估算蛋白质（0.634）和碳水化合物（0.366）的重量分数。部分特定体积(v（v）_酒吧)碳水化合物重量分数的值为0.622 ml/g(20)和蛋白质v（v）_酒吧根据氨基酸序列计算得出为0.732 ml/gv（v）_酒吧根据公式0.634（0.732 ml/g）+0.366（0.622 ml/g。​（图4）4)使用Beckman-Coulter Instruments（4.0版和Microcal 4.1版）提供的数据分析软件包进行全局非线性回归分析，得出表中所示的质量值和计算的亚基数量​表1。1沉降平衡分析得出的四个组分的平均亚基数为3.30，略高于STEM得出的相同组分的亚基平均数（3.07）和三聚体的预期值。这一结果可以用含有三个以上亚基的低聚物的微量存在来解释，因为这些分子对沉降平衡时测得的重量平均摩尔质量的贡献比STEM获得的数量平均质量值的贡献更大。事实上，对每个组分的沉积速度边界的沉积系数分布分析显示，大约9S处有一个主要峰值，14S区域有一个小峰值（小于总峰值的10%）（未显示数据）。后一个次要成分与低水平的基质间交联相一致。对第二种独立纯化的病毒相关HIV-1 Env制剂进行沉降平衡分析，得出441.1 kDa（2.99个亚基[数据未显示]）的48至50组分的质量值。

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图4。

病毒源性HIV-1环境单个凝胶过滤组分的沉降平衡浓度分布。实线显示了对四种不同转子速度下获得的数据进行全局建模后的最佳拟合分布。为了清楚起见，只显示了在7000转/分时获得的数据。下面板显示了拟合线与实验数据的残差。

总之，来自两种独立生物物理技术的数据清楚地表明，病毒粒子表面的HIV-1 gp120/gp41复合物以三聚体的形式存在。在融合激活前，SIV病毒相关Env也观察到三体结构(6)以及HIV-1 gp41和SIV-TM亚单位的N端和C端螺旋结构域的晶体衍生结构，它们被认为代表融合后构象(7,21,32,36). 事实上，三聚体结构是病毒包膜蛋白生物学中反复出现的主题。人类T细胞白血病病毒1型Env TM亚单位的晶体衍生结构(18)，Moloney小鼠白血病病毒(14)，visna病毒(22)、埃博拉病毒(31)，猴副流感病毒5(2)，人呼吸道合胞病毒(38)和流感病毒(4)它们非常相似，都有一个三角形的线圈芯。在流感病毒血凝素的情况下，预融合激活构象的晶体衍生结构也显示出三聚体结构(34). 环境介导的膜融合的功能保守方面似乎是共同三聚体结构计划的基础。然而，在融合过程中保持单一Env寡聚物价态在包膜病毒中并不普遍。例如，蜱传脑炎病毒Env是融合前构象中的同二聚体，并在融合激活过程中转变为同三聚体(28).

我们观察到的与病毒相关的HIV-1 Env的四级状态的均一性与报道的重组、未分离形式Env的低聚物异质性形成对比，如膜锚定的gp160(8,10)或可溶性分泌型gp140(9,13,27). 在gp140的情况下，与重组系统相关的高表达水平和缺乏膜锚定可能诱导在自然感染中未发现的异常四元形式。或者，异质四元结构可能是Env表达的正常结果，而通常阻止非二元形式输出到细胞表面的细胞机制在重组表达中失败。与这一建议一致，据报道，在感染细胞中表达的大多数gp160是通过溶酶体而不是细胞表面表达的(33). 无论是在内质网的初始寡聚化水平上还是在随后的细胞质量控制机制上控制病毒相关包膜四级结构的均匀性，三聚体化似乎对Env功能至关重要。

致谢

参考文献