生物化学杂志。2006年2月1日；393（第3部分）：749–755。
15d-PGJ结合动力学的光谱分析2通过多波长全局拟合到PPARγ配体结合域
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Takuma Shiraki先生
*生物分子工程研究所（BERI）分子生物学系，日本大阪市住田府路6-2-3号，邮编：565-0874
Takashi S.公司。Kodama公司
†生物分子工程研究所（BERI）结构生物学系，日本大阪市宿田6-2-3 Furuedai，565-0874
早坂志贵
*生物分子工程研究所（BERI）分子生物学系，日本大阪市住田府路6-2-3号，邮编：565-0874
中川达雄
日本大阪市平川县卡苏加诺2-4-3 UNISOKU有限公司，邮编：573-0131
久保真美
*生物分子工程研究所（BERI）分子生物学系，日本大阪市住田府路6-2-3号，邮编：565-0874
*生物分子工程研究所（BERI）分子生物学系，日本大阪市住田府路6-2-3号，邮编：565-0874
†生物分子工程研究所（BERI）结构生物学系，日本大阪市宿田6-2-3 Furuedai，565-0874
日本大阪市平川县卡苏加诺2-4-3 UNISOKU有限公司，邮编：573-0131
1现住址：大阪大学医学院医学遗传学系分子遗传学实验室，日本大阪市住田山道冈2-2号，邮编：565-0871。
2005年6月10日收到；2005年10月10日修订；2005年10月19日接受。
摘要
PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）是一种被天然脂质代谢产物激活的核受体，包括15d PGJ2（15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2). 我们之前报道过几种氧化脂质代谢物通过Michael加成共价结合PPARγ来激活转录。为了分离PPARγ激活中的配体进入（对接）和共价结合（锁定）步骤，我们研究了15d PGJ的结合动力学2通过停流光谱测定PPARγLBD（配体结合域）。我们分析了15d PGJ的光谱变化2通过基于两步化学反应模型的多波长全局拟合，其中中间状态代表15d-PGJ2–PPARγ复合物，无共价结合。野生型PPARγ中间态的提取光谱与15d-PGJ的观察光谱非常相似2在C285S突变体中，15d-PGJ不能激活该突变体2表明该复合物在突变体中仍处于非活性中间状态。因此，“锁定”而不是“停靠”是15d-PGJ激活PPARγ的关键步骤之一2.
关键词：共价结合，15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2（15天PGJ2)、迈克尔加、多波长全局拟合分析、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、停流光谱
缩写：DBD，DNA-结合域；15d-前列腺素J2，15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2; LBD，配体结合域；PPARγ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ；WT，野生型
简介
PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）是一种核受体，在脂质平衡、糖代谢和巨噬细胞功能中发挥重要作用[1–三]. PPARγ被几种脂质代谢产物及其氧化产物激活[4–8]. 其中，15d-PGJ2（15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2)是第一个激活PPARγ的内源性分子[4,5].
一般认为，核受体在配体结合时会在LBD（配体结合域）中发生大的构象重排，从而导致共激活物的招募来调节转录[9,10]. 核受体LBD晶体结构的测定支持了这一观点，揭示了晶体中不同的构象。例如，当PPARα与拮抗剂结合时，它的螺旋12转变为一种抑制形式，允许与辅加压肽结合[11]. 相比之下，PPARα与激动剂结合时表现出活性形式，允许与共激活肽结合[12]. 与PPARγ晶体结构一样，载脂蛋白和激动剂结合形式已经解决，但拮抗剂结合形式尚不可用。在脱辅基形式中，PPARγ形成一个同二聚体，单个原聚体采用两种不同的构象：在一个原聚体中，螺旋12处于活性位置，而在另一个原聚体中，螺线12略有移动[13]. PPARγapo形式中的活性原聚体与与合成配体BRL49653结合的活性形式几乎没有差异[13–15]. 此外，PPARγ与部分激动剂GW0072和AZ242络合，显示出与上述载脂蛋白类似的结构[16,17]. 由于PPARγ显然不会发生如晶体结构所示的剧烈构象变化，因此从核磁共振波谱和荧光各向异性的研究中提供了PPARγ活化的另一种观点[18,19]. 在该模型中，PPARγLBD表现出其动态性质，配体结合使受体稳定在一定构象中。这些结构研究基本上比较了受体在稳态时的两种状态。然而，配体结合和受体激活过程中发生的精确动态事件尚不清楚。
我们之前报道过几种氧化脂肪酸，通常以α，β-不饱和酮为核心结构部分，与PPARγLBD中的半胱氨酸残基共价结合，并且这种共价结合是这些配体激活PPARγ所必需的[20]. 配体的不可逆结合可能有助于低亲和力配体通过累积效应发挥其活性，即使配体浓度不高。另一方面，与共价结合相关的配体的化学反应和/或结构变化可能在PPARγ激活过程中发挥被动作用。在本研究中，我们深入研究了配体共价结合的功能意义。为了捕捉配体结合过程中发生的事件，我们构建了一种新型的停流吸收分光光度系统，并对其进行了改进，以减少配体的光浸出。使用这个系统，我们观察到一个采用配体结合的“对接和锁定”机制的两步反应，其中15d-PGJ2首先进入配体结合囊（dock），然后配体的共价结合以相对较低的速率发生（lock）。突变分析表明，第一步（对接），从自由态到非共价结合态，不足以激活PPARγ，但第二步（锁定），从非共价态到共价结合形态，是激活的关键步骤。
实验
化学制品
15d-前列腺素J2来自开曼化学公司。所有其他化学品均来自Sigma–Aldrich Japan或Wako Pure Chemical Industries，Ltd。
蛋白质制备
His-tagged PPARγLBD（aa 195–477）表达并纯化自大肠杆菌如前所述[20]. 我们省略了所有缓冲液中的还原剂。如前所述，将C285S突变引入pET28-PPARγ[20].
稳态光谱测量
15d-前列腺素J2与PPARγLBD混合20分钟，用DU640分光光度计（贝克曼）测量紫外光谱。
光谱记录用停流系统
为了保护配体不受光浸出的影响，我们开发了一种用停流装置进行光谱记录的系统(A） ●●●●。该系统由一个停流装置和一个光谱仪RSP-1000（UNISOKU，Co.Ltd.）、一个脉冲发生器DG535（美国加利福尼亚州斯坦福研究系统公司）、一台高速快门LS6T2及其控制器VMM-D3（美国纽约州文森特协会）组成。
本研究所用实验装置示意图(A类)主控制器生成一个启动触发器，通过该触发器，两个样本立即混合。主控制器还生成用于从光电二极管阵列采样信号的脉冲。相同的脉冲被传输到控制快门的脉冲发生器。脉冲发生器由每个脉冲的开始触发，并产生具有特定延迟和开启时间的脉冲。快门在每个脉冲开启期间打开。通过该系统，样品的光暴露最小化，并且可以防止样品的光浸出。(B类)使用（+快门）或不使用（-快门）快门记录314 nm处的单色迹线。15d-前列腺素J2（10μM）和59μM PPARγLBD蛋白以1:1的比例混合，然后记录光谱。为了简化痕量，15d-PGJ的吸光度2仅示出了在314nm处。
光谱动力学的多波长全局拟合
一步反应模型（A+B→D）定义如下：，
其中NR和NR：配体分别指核受体和配体结合核受体。NR和配体的初始浓度定义为[NR]=A类0，[配体]=B类0。NR、配体和NR:配体在某个时间点的浓度定义为[NR]=A类(t吨)，[配体]=B类(t吨)和[NR：配体]=D类(t吨)分别是。反应速度由以下等式描述：
A类(t吨)和B类(t吨)计算为A类0−D类(t吨)和B类0−D类(t吨)分别是。然后方程式（1）可以转换为：
如果A类0等于B类0，则（2）可以根据D类(t吨):
如果A类0不等于B类0，则（2）可以根据D类(t吨):
此外，在特定时间点，在特定波长（λ）下观察到的吸光度（Obs）(t吨)可以通过以下方式定义：
其中ϵA类(λ), ϵB类（λ） 、和ϵD类（λ） 表示每个分子的摩尔吸收系数。我们获得了k个值，ϵA类(λ), ϵB类（λ） 、和ϵD类（λ） 经过非线性最小二乘拟合后的数据使用方程式（3）,(4)和(5)通过准纽顿方法。两步反应模型（A+B↔C→D）定义如下：
其中NR/配体是指核受体和配体之间的非共价络合物。NR和配体的初始浓度定义为[NR]=A类0，[配体]=B类0NR、配体、NR/配体和NR:配体在某个时间点的浓度定义为[NR]=A类(t吨)，[配体]=B类(t吨)，[NR/配体]=C类(t吨)，和[NR：配体]=D类(t吨)分别是。假设快速平衡，反应速度由以下方程描述：
在这里，A类(t吨)和B类(t吨)通过以下方式获得A类0−C类(t吨)−D类(t吨)和B类0−C类(t吨)−D类(t吨)分别是。然后，方程式（6）可以更改为：
方程式（7）可以更改为：
方程式（8）可以从以下方面解决C类(t吨):
[NR:配体]的生成速率可以用以下等式表示：
根据生产速率的微分方程D类(t吨)可以从以下位置获得方程式（9）和(10).给，D类(0)=0. 然后，用龙格-库塔法求解微分方程。C类(t吨)是从以下位置获得的方程式（9），使用获得的D类(t吨).A类(t吨)和B类(t吨)计算公式为A类0−C类(t吨)−D类(t吨)和B类0−C类(t吨)−D类(t吨)分别是。此外，在某个时间点，在某个波长（λ）下观察到的吸光度(t吨)可通过以下方程式定义：
然后，我们得到K（K）一,k个, ϵA类(λ), ϵB类(λ), ϵC类（λ） 、和ϵD类（λ） 用拟牛顿法对数据进行非线性最小二乘拟合后的值。
胰蛋白酶敏感性测定
纯化的PPARγ蛋白（通常为0.1μg/10μl反应体积）在室温下与10μM配体孵育20分钟。然后向反应中添加30 ng胰蛋白酶。每隔10分钟，取下一等分反应混合物，并通过添加SDS/PAGE样品缓冲液和煮沸停止反应。样品通过SDS/PAGE分离，并通过银染色进行可视化。使用NIH（美国国立卫生研究院）图像软件版本1.63对残留PPARγ蛋白进行定量。
细胞培养和荧光素酶测定
细胞培养、瞬时转染和荧光素酶检测已在前面介绍过[20]. 值得注意的是，我们使用GAL4 DNA结合域（DBD）融合的PPARγLBD作为配体结合激活PPARγ的模型系统。
结果
光谱记录系统概述
当我们记录15d-PGJ的光谱时2使用传统的停流系统，我们遇到了15d-PGJ的问题2在录制过程中进行了照片漂白(B） ●●●●。发生这种情况的原因是，即使没有记录光谱，样品也会持续暴露在光线下。因此，我们开发了一种改进的系统，在该系统中，只有在记录光谱时才将光暴露在样品中(A） ●●●●。主控制器产生启动触发和采样脉冲，因此系统与传统的停流装置基本相同。主要区别在于对曝光时间和采样时间的控制。使用脉冲发生器，打开光源和样品试管之间的高速快门，相对于每个采样脉冲的开始具有特定的延迟。该系统中的采样时间由快门的打开时间决定，因此总曝光量大大减少。使用该系统，我们成功地防止了样品的光浸出(B） ●●●●。
结合动力学的单色分析
我们使用从光谱中提取的单色痕迹分析了结合动力学。通过混合15d-PGJ2（最终浓度5μM）和PPARγLBD（最终浓度29.5μM(A、 上面板，黑线）。不含15d-PGJ的PPARγ谱2也在单个时间点录制(A、 上面板，粗灰色线条）。从所有光谱中减去PPARγ光谱(A、 下部面板）。15d-PGJ的峰值吸光度2从320 nm移动到300 nm。在329 nm和292 nm处观察到光谱的最大上下移动(A、 箭头）。329和292nm处的随时间变化由单指数方程拟合，表示为如果(t吨)=A类0+A类1电子−t/τ，其中如果是吸光度，A类0是的值t吨=0,A类1是变化的大小，τ是变化的松弛时间。我们计算了四种不同浓度PPARγ的弛豫时间(C） 显示了各波长的浓度依赖性。然而，在292 nm处获得的弛豫时间明显大于在329 nm处的，表明该反应不是简单的两态转变。使用2.9μM PPARγ，信号变化最小，信噪比降低。因此，我们只观察到329nm峰的减少，而没有观察到292nm峰的出现。因此，我们认为这种配体结合反应是由中间态介导的。
光谱的时间依赖性变化和结合动力学的单色分析(A类)15d-PGJ的光谱变化2与PPARγLBD混合后。箭头表示混合物的光谱变化（上面板）。显示了每2.4秒的轨迹。PPARγ的光谱也叠加在记录道上（上面板，厚灰色线）。15d-PGJ的净光谱变化2通过从混合物的所有光谱中减去PPARγLBD的光谱得到（下面板）。15d-PGJ的峰值吸光度2从320纳米移动到300纳米。在292和329 nm处观察到最大变化。(B类)292 nm和329 nm处的吸光度随时间变化，变化最大。(C类)292和329 nm处弛豫时间的浓度依赖性。292 nm和329 nm处的迹线拟合成一个单指数方程f(t吨)=A类0+A类1电子−t/τ（插图）。A类0是的值t吨=0,A类1表示变化的大小，τ是变化的松弛时间。绘制了用四种不同浓度的PPARγLBD获得的τ值。15d-PGJ浓度2固定在5μM。
停流光谱数据的多波长全局拟合分析
由于我们缺乏关于中间形式光谱的任何信息，我们开发了一种分析工具（名为SPECTRAC，规范tral ex（tral防爆）trac公司tor），通过分析多波长动力学获得光谱和结合常数(). 一旦确定了化学反应和初始样品浓度，SPECTRAC将通过求解基于化学反应的微分方程来模拟预期的浓度变化。在该分析中，15d-PGJ的反应结合常数和光谱2PPARγ和产物在开始时是任意的。使用计算的浓度和分子光谱，SPECTRAC生成光谱变化。然后是反应的结合常数和15d-PGJ的光谱2通过实际数据与计算数据的非线性最小二乘拟合，改进了PPARγ和配合物。当我们定义一步反应模型时，其中15d-PGJ2进入PPARγ配体结合囊，同时与PPARγLBD的半胱氨酸残基反应，我们获得了PPARγ，15d-PGJ的光谱2，和共价结合的15d PGJ2–PPARγ复合物与稳态实验中观察到的类似（未显示结果）。速率常数（1.6×10三秒−1·M（M）−1)SPECTRAC计算的反应速率与封闭速率（7.9×102秒−1·M（M）−1)PPARγLBD中的游离半胱氨酸残基，使用相同的反应模型通过罗丹明-甲酰胺反应性检测[20]. 这两种分析评估了配体或受体的修饰，得出了类似的反应速率常数，表明了该分析的准确性。
动力学和SPECTRAC方法示意图停流数据由动力学和光谱信息组成，两者都由SPECTRAC同时分析。在开始分析之前，必须定义化学反应（左下方），其中初始结合常数和每个光谱可以是任意的（左下方和右下方的图）。必须确定样品的初始浓度（[A]和[B]）。首先，用Lunge–Kutta方法求解基于反应动力学的微分方程，该方法给出了特定时间内每个分子的浓度（左三图中的[a]、[B]、[C]和[D]）。使用获得的每个分子的浓度和光谱，可以计算特定时间的预期光谱（右三图）。同时，可以计算出预期的动力学曲线（左二图中的灰色线）。用上述程序获得的光谱对数据进行非线性最小二乘拟合，可以改善离解和速率常数(K（K）d日和k个)以及每个光谱。最后，可以获得动力学参数和提取光谱。误差表示为整个光谱的均方根偏差（R.M.S.D.）。
配体结合动力学细节
我们定义了一个两步反应模型，其中15d-PGJ2首先与PPARγ非共价结合，然后Michael加成生成最终的络合物(，上面板）。使用SPECTRAC从60 s持续时间数据分析中提取光谱和每个分子的浓度变化(). 我们使用摩尔吸收系数来表示每个分子的光谱，因为以吸光度表示的光谱随时间而变化。提取的光谱表明，15d-PGJ的峰值吸光度2320 nm处(; 左下面板，线B）首先缩小，并在315nm处略微移动到较短波长(; 左下面板，线C），然后它移动到300nm处的最终峰值(; 左下面板，线路D）。每个分子的浓度代表第一步的快速过渡，然后是缓慢的共价键结合步骤(，右下面板）。使用来自四个不同PPARγ浓度的独立实验的数据，我们计算了K（K）d日和k个值为0.245±0.041 nM和（7.22±1.00）×102秒−1（平均值±标准误差n个=5）。尽管我们假设第一步会迅速达到平衡，但在非常早期的解离速率往往被低估，因为在没有位移的情况下，配体结合可以得到巨大的空口袋。因此，表观离解常数可能很低。
基于两步模型的多波长全局拟合结合动力学光谱分析15d-PGJ光谱分析结果示例2PPARγLBD结合动力学。化学反应表示为A+B↔C→D，其中第一步的离解常数为K（K）d日，第二步的速率常数为k个在本图中，PGJ2表示15d-PGJ2PPARγ/PGJ2指由15d-PGJ非共价结合的PPARγLBD2。我们使用摩尔吸收系数表示每个分子的光谱，因为光谱显示为吸光度随时间而变化。15d-PGJ的光谱2，PPARγ/PGJ2和PPARγ：PGJ2分别用虚线（B线，320 nm处的峰值吸光度）、粗线（C线，315 nm处的峰吸光度）和虚线（D线，300 nm处的最大吸光度）表示。离解常数(K（K）d日)第一步，0.245±0.041 nM，以及速率常数(k个)第二步的7.22×102秒−1，由五个独立实验计算得出。在本例中，整个光谱的均方根偏差（R.M.S.D.）为0.001377。
中间状态在C285S PPARγ突变体中停滞
为了确认中间状态实际上来自非共价结合的PPARγ-15d-PGJ2我们使用的C285S PPARγ突变体未被15d-PGJ激活2在单元格中[20]. 15d-PGJ的稳态吸收光谱2在混合后30分钟内，在没有或存在WT（野生型）或C285S蛋白的情况下记录。15天PGJ2仅在320 nm处出现峰值吸光度(A、 细虚线）。通过将其与WT PPARγ混合，15d-PGJ的光谱2在稳态反应中，在300nm处显示出蓝移峰吸光度(A、 虚线）。相比之下，15d-PGJ2与重组C285S PPARγ蛋白混合后，在315nm处的吸收峰出现较小的蓝移(A、 粗线条）。15d PGJ的移峰吸光度2C285S突变体的添加与WT停流实验中观察到的中间状态类似(，C行）。确认15d-PGJ2我们接下来测量了15d-PGJ的离解常数2在稳定状态下与C285S突变体结合。分离束缚和自由15d-PGJ的光谱2，我们使用SPECTRAC，没有进行动力学分析，其中的离解常数(K（K）d日)PPARγ和结合与游离15d-PGJ的光谱2通过非线性最小二乘拟合数据计算(，右侧面板）。增加蛋白质含量可产生更多15d-PGJ2–PPARγ复合物以浓度依赖的方式(B） ●●●●。这个K（K）d日使用C285S突变体进行稳态实验得到的值为3.05±0.21μM(n个=5).
捕获C285S PPARγ突变体的中间状态(A类)15d-PGJ的光谱变化2存在WT或C285S突变PPARγLBD。光谱代表20μM C285S蛋白（细线），10μM 15d-PGJ2（细虚线），10μM 15d-PGJ的混合物2和25μM WT蛋白（虚线），以及10μM 15d-PGJ的混合物2和20μM C285S蛋白（粗线）。箭头表示15d PGJ的峰值吸光度2单独（320 nm），15d-PGJ2与C285S蛋白（315nm）和15d-PGJ混合后2与WT蛋白混合（300 nm）。(B类)15d-PGJ的剂量依赖性形成2–C285S复合体。将不同量的C285S蛋白与15μM 15d PGJ一起孵育2，并通过SPECTRAC计算络合物的浓度K（K）d日获得3.05±0.21μM的值(n个=5). (C类)配体诱导WT和C285S蛋白质对胰蛋白酶消化的部分抵抗（左面板和右面板分别）。将WT和C285S蛋白与指定配体（10μM）孵育，然后用胰蛋白酶消化。在指定的时间点，终止反应，并通过银染色观察残余蛋白质。残余蛋白质的密度被量化并绘制为未消化蛋白质的百分比。(D类)培养细胞中WT和C285S突变体的活性。用报告载体（pUAS）瞬时转染COS-7细胞G公司-luc）、内部对照载体（pEYFP-N1）和GAL4-DBD融合的PPARγ。转染后，用指定的配体（10μM）处理细胞，24小时后测定荧光素酶活性。以黄色荧光蛋白作为内部对照，计算转染效率。(E类)结合动力学和活性之间关系的总结。15d-前列腺素J2首先与PPARγ非共价结合，然后它们之间的Michael加成导致PPARγ活化。相比之下，15d-PGJ2与C285S突变体非共价结合，但复合物仍处于非活性中间状态。因此，这种共价结合是15d-PGJ激活PPARγ的关键步骤2.
此外，为了证实15d-PGJ的光谱变化2上述观察结果并非由C285S突变体的非特异性效应引起，我们分析了在15d-PGJ存在下受体发生的变化2众所周知，核受体的LBD经历构象和/或动态变化，导致对胰蛋白酶消化的部分抵抗[21]. 与15d-PGJ孵育时2或BRL49653，WT PPARγ蛋白确实对胰蛋白酶消化表现出部分抗性(C、 左侧面板）。在C285S突变体中，配体添加对胰蛋白酶消化的抗性更明显(C、 右侧面板）。在WT和C285S突变体中，15d-PGJ2在胰蛋白酶敏感性方面诱导了对受体蛋白的类似作用。该结果表明15d-PGJ2与C285S突变体结合。另一方面，我们发现C285S突变完全消除了15d-PGJ对GAL4 DBD-融合PPARγLBD的激活2由培养细胞系统决定(D） ●●●●。然后我们得出结论，C285S突变体和15d PGJ之间的复合物2对应于WT复合体中观察到的中间状态(E） ●●●●。
讨论
了解共价结合在15d-PGJ中的作用2-通过诱导PPARγ活化，我们分析了结合动力学与活性之间的关系。在以前的报告中，PPARγ拮抗剂GW9662和T0070907以及PPARγ激动剂L-764406被证明与PPARγLBD的半胱氨酸残基共价结合[22–24]. 半胱氨酸残基是这些化合物与受体结合所必需的[23,24]，表明共价键的形成有助于这些合成配体与受体结合。以类似的方式，也可以想象15d-PGJ的共价结合2可能通过不可逆激活产生累积效应。另一方面，我们观察到15d-PGJ2可以与C285S PPARγ突变体非共价结合而无需受体激活()，表明PPARγ活化需要共价结合，而不是协助配体结合。我们注意到K（K）d日15d-PGJ值2与C285S突变体结合(B） 与EC类似50第15天PGJ2使用培养细胞进行PPARγ介导的转录检测中的（2μM）[4,5]. WT-PPARγ中的第二个共价键结合步骤本身是一个浓度依赖反应；因此EC50可能反映了K（K）d日停靠步骤的值。为什么合成配体需要半胱氨酸残基来结合配体，而15d-PGJ2需要它来激活受体而不是结合配体，目前尚不清楚；然而，这可能是由于它们的化学反应不同（氯的亲核芳香取代与α，β-不饱和酮的Michael加成反应）或它们的合成结构不同。
共价键结合步骤发生了什么？除了来自晶体的静态结构信息外，配体与PPARγLBD结合的动力学也已通过核磁共振测定[18]以及使用荧光标记PPARγ的荧光各向异性[19]. 这些研究基本上测量了由于配体处于稳定状态而在受体上发生的事件，并代表了对受体激活机制的另一种观点，在这种机制中，构象的动态组合随着配体结合而发生变化。另一方面，我们测量了配体与受体结合后发生的光谱变化，并揭示了中间状态，其中15d-PGJ2与受体结合但不与受体共价结合，是不活跃的。据我们所知，这是第一次在核受体-配体相互作用中出现中间态。我们的配体动力学数据补充了之前关于受体结构和动力学的结果。也就是说，未结合受体的动态运动可能会使配体迁移到深配体结合囊中。当配体适应配体结合囊中的特定构象时，可能会发生Michael加成。然后共价结合导致受体激活。未来，确定共价结合是导致受体改变构象还是固定其动态运动将是一件有趣的事情。
很容易推测共价结合的功能作用是降低受体激活的信噪比。也就是说，PPARγ的配体结合囊足够大，可以容纳各种低特异性和亲和力的脂质代谢产物[25–27]，因此，PPARγ有很多机会遇到伪配体。为了区分真配体和假配体，PPARγ需要识别它们之间的差异。一般认为，配体受体特异性是通过“钥匙和钥匙孔”机制实现的，涉及到它们之间的一些静电接触和疏水相互作用。事实上，合成的PPARγ激动剂似乎是刚性的，并且通过与受体的特异接触来获得其选择性[12]. 相反，脂质代谢物非常灵活，它们在大配体结合囊中的位置无法固定，如与二十碳五烯酸结合的PPARδLBD的晶体结构所示[25]. 这里提出的“对接和锁定”机制可以解释PPARγ如何应对这种柔性配体的低选择性和亲和力。
致谢
我们感谢森川浩介博士和杉木琢磨先生的有益评论和讨论。这项工作得到了新能源和工业技术发展组织（NEDO）批准的研究拨款的支持。作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。
工具书类
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