生物技术。作者手稿；PMC 2006年2月3日提供。
以最终编辑形式发布为：
生物技术。1989年10月；7(9): 980–990.
预防性维修识别码：PMC1360503项目
NIHMSID公司：NIHMS6048标准
用于基因转移和表达的改良逆转录病毒载体
弗雷德·哈钦森癌症研究中心
通信地址：A.Dusty Miller，华盛顿州西雅图哥伦比亚街1124号弗雷德·哈钦森癌症研究中心，邮编98104
摘要
我们描述了一组基于鼠逆转录病毒的载体，其中包括用于插入cDNA的独特克隆位点，使得cDNA可以由逆转录病毒长末端重复序列、人巨细胞病毒的直接早期启动子或猿病毒40早期启动子驱动。载体携带从替代启动子表达的新霉素磷酸转移酶基因作为可选标记。构建这些载体的目的是阻止剩余病毒序列合成病毒蛋白，在引入逆转录病毒包装细胞后产生高滴度病毒库，并消除与逆转录病毒封装细胞中存在的病毒DNA的同源重叠，以防止辅助病毒的产生。描述了产生高滴度病毒的方法。
简介
逆转录病毒载体为真核细胞的基因转移提供了一种高效的方法(12). 这个矢量系统可以分为两部分；逆转录病毒载体本身（通常不编码病毒蛋白）和逆转录病毒包装细胞系（提供载体转移所需的病毒蛋白）。这两种成分的设计改进导致了令人印象深刻的基因转移效率，甚至在原代细胞中也接近100%(17).
逆转录病毒包装细胞的改进集中在降低这些细胞系产生具有复制能力的辅助病毒的潜力，同时仍然允许生产高滴度的逆转录病毒载体(7,11,13). 这些目标是通过对用于制造包装细胞的具有复制能力的逆转录病毒进行多次改变来实现的，这样病毒蛋白仍然可以制造，但病毒RNA不能被包装成病毒粒子、逆转录或整合。
基于鼠病毒的逆转录病毒载体设计的一个关键改进是发现将病毒RNA包装成病毒的信号延伸到堵住病毒区域(1,2,4). 与早期载体相比，将该区域包含在载体中可使载体滴度增加约10倍，基因转移效率也相应提高。然而，同源重叠堵住逆转录病毒载体中的序列和包装细胞中的序列导致早期包装细胞中辅助病毒的频繁产生(15)，并且仍然可以在改进的包装细胞系中导致罕见的辅助病毒产生(7，并参见结果）。此外，这些新载体包含病毒编码区的一部分，这些编码区可能导致产生抗原或其他不需要的特性的蛋白质。
为了解决这些问题，我们设计了一组逆转录病毒载体，该载体不能通过与包装细胞中逆转录病毒基因组的同源重组产生辅助病毒，并且包含阻止病毒蛋白合成的突变。这些改变仍然允许产生超过10种的高滴度病毒7cfu/ml。包括独特的克隆位点和强大的病毒启动子，以促进插入cDNA的表达。
材料和方法
细胞和培养条件
细胞在添加有10%胎牛血清的高糖（4.5 g/l）的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。在一些实验中，通过在胎儿和小牛血清50:50的混合物中以中等密度培养细胞两天，然后在小牛血清中培养细胞约一周，使细胞适应于在铁补充的小牛血清（Hyclone，Logan，UT）中生长。上述细胞系包括NIH 3T3 TK−(13)和PA317双嗜性逆转录病毒包装细胞(13; 美国类型培养物收集号CRL 9078）。这里使用的生态型逆转录病毒包装细胞系PE501包含一个缺陷的辅助病毒基因组，该基因组与用于制造PA317细胞的基因组相同，只是该病毒的两向性区域被来自Moloney小鼠白血病病毒（MoMLV）的生态性区域所取代。PA317和PE501细胞均来自NIH 3T3 TK−将缺陷病毒DNA和TK基因作为可选择标记物共同转染细胞。细胞在含10%CO的加湿培养箱中于37°C下生长2.
逆转录病毒载体
逆转录病毒载体N2的构建(2)和LNL6(4)已描述。这些载体的剪接供体或缺失衍生物是通过改变共有剪接供者信号而得到的()从AGGT到AGGC。无矢量环境价值序列是通过使用仅包含逆转录病毒序列的合成DNA片段在环境价值阻止密码子到达Nhe公司逆转录病毒载体质粒的完整序列信息已提交给GenBank/EMBL数据库。
逆转录病毒载体N2和LNL6缩写为：LTR，逆转录病毒长末端重复；SD，剪接供体；SA，剪接受体；ψ+，扩展包装信号；pA，聚腺苷化位点。箭头指示转录起始位点和转录方向。
瞬时转染法生产病毒
通过包装细胞的瞬时转染，从逆转录病毒载体的质粒形式产生病毒。质粒DNA在使用前在含有溴化乙锭的氯化铯梯度中离心纯化。将PA317或PE501逆转录病毒包装细胞以5×5第1天，每个60-mm培养皿中的细胞数。第2天，用4ml新鲜培养基替换培养基，并使用磷酸钙沉淀程序将病毒质粒DNA转染到细胞上(6,15). 对于每个质粒样本，DNA-CaCl2通过混合25μl 2.0 M CaCl制备溶液2，10μg质粒DNA（在10 mM Tris-Cl中，pH值7.5）和水，总计200μl。通过混合100μl 500 mM HEPES-NaOH（pH 7.1）、125μl 2.0 M NaCl、10μl 150 mM Na，新鲜制备沉淀缓冲液2高性能操作4-NaH（氢化钠）2人事军官4，（pH值7.0）和水，总计1 ml。DNA-氯化钙2将溶液（200μl）滴加至200μl沉淀缓冲液中，并持续搅拌。在室温下30分钟后，将生成的细沉淀物添加到培养皿中。细胞暴露于DNA沉淀物中，直到第3天抽吸培养基并添加新鲜培养基。第4天，取出含病毒培养基，在3000×克5分钟，清除细胞和碎片，用于感染细胞。病毒收获后，将转染的细胞进行胰蛋白酶处理，并以1:20的比例拆分为含有1.5 mg/ml G418（约50%为活性）的培养基，以确定转染效率。
稳定载体产生细胞系的建立
如前所述，基本上生成了稳定的病毒产生细胞系(15). PE501生态型包装电池以5×10电镀5第一天，每6厘米的盘子。第2天，按照上述方法转染细胞。第3天，用新鲜培养基替换培养基，并在105每个6厘米的盘子。第4天，将含有4μg/ml Polybrene的4 ml新鲜培养基喂给PA317细胞（以促进病毒感染）。从PE501细胞中提取病毒，并使用1μl至1 ml含病毒培养基样本感染PA317细胞。第5天，对PA317细胞进行胰蛋白酶化，并将其置于含有1.5 mg/ml G418（约50%活性）的培养基中的10-cm培养皿中。使用具有少量菌落的培养皿通过使用克隆环来分离克隆。然后通过Southern分析对这些克隆系进行载体滴度、可能的辅助病毒污染和整合病毒的结构分析，并使用合适的克隆系进行进一步研究。将新鲜培养基加入细胞汇合培养皿中16 h，去除培养基，然后在3000℃下离心，从病毒产生细胞中提取病毒克5分钟，清除细胞和碎屑。
病毒检测
用于携带病毒的检测新可选标记，收件人NIH 3T3 TK−细胞接种于5×105第一天每60毫米的盘子。第2天，将培养基更换为含有4μg/ml聚溴乙烯的培养基，并添加不同数量的测试病毒。第3天，将细胞以1:20的比例分裂成含有1.5 mg/ml G418（约50%活性）的培养基。在第8天对菌落进行染色和计数。通过将菌落数除以用于感染的病毒体积（以毫升为单位）并乘以20来校正1:20的细胞稀释度，计算以每毫升菌落形成单位（cfu/ml）为单位的病毒滴度。使用S检测Helper病毒+L（左）−如前所述的化验(14).
标记物拯救试验
NIH 3T3 TK公司−细胞被无帮助N2病毒感染(13)，在G418中选择，并将耐药菌落合并成3T3/N2细胞。这些细胞窝藏但不产生N2病毒。在标记物拯救试验中，将3T3/N2细胞感染试验病毒，传代两周以允许可能的辅助病毒在培养物中传播，并检测释放的病毒是否具有G418耐药性。作为阳性对照，3T3/N2细胞同时感染少量辅助病毒，这通常导致产生>106细胞传代2周后，G418-耐药cfu/ml。
结果
载体修饰防止病毒蛋白合成
这里描述的矢量的基础是N2矢量()已成功用于感染多种不同类型的细胞(2). N2矢量包含扩展包装信号，表示为ψ+，从而能够以高滴度生产载体。然而，ψ+区域还包含堵住亲代辅助病毒（MoMLV）的蛋白，Pr65堵住和一个更大的糖基化蛋白gPr85堵住，起始于Pr65的ATG密码子上游的一个不寻常的CTG密码子(). 因此，我们修改了N2矢量，使LNL6()通过插入一个终止密码子来代替Pr65堵住启动密码子，阻止Pr65的合成堵住，并将载体的上游区域替换为来自Moloney小鼠肉瘤病毒（MoMSV）的同源区域，该同源区域与MoMLV非常相似，但不使糖基化堵住蛋白质。这些改变应该阻止从LNL6载体合成病毒蛋白。
这个新基因位于框架下游和框架外堵住N2矢量中的序列。正常MoMLV剪接供体和剪接受体之间的RNA剪接新()需要生成一个mRNA，该mRNA可以被翻译成新多肽(2). 感染N2的细胞的Northern分析通常显示两条强度相似的带；一种是全长病毒mRNA，另一种是剪接mRNA。然而，在感染LNL6的细胞中，全长mRNA是迄今为止最丰富的物种（未显示）。因此，我们检查了新通过两个载体中剪接供体的突变失活，将这两个载体的表达作为剪接的功能。剪接供体在N2中失活导致载体转染效率降低30倍，病毒产量降低2500倍，在包装细胞瞬时转染后产生G418耐药性(). 此外，剪接供体或活化N2载体转染或感染后形成的菌落小于，再次表明新表达次优。相反，LNL6中剪接供体的失活并没有改变载体的转染效率、包装细胞转染后产生G418耐药性的病毒产量，也没有改变耐药菌落的大小。因此，尽管剪接对于N2载体的高效新蛋白表达是必需的，但对于LNL6的表达则不需要剪接。这可能为细胞中的LNL6载体提供了一个优势，因为由于某些原因，该载体不能有效剪接全长病毒mRNA。
表1
| 矢量 | 转染效率（菌落/μg DNA/106单元格） | 矢量滴定（cfu/ml） |
|---|
| 氮气（SD+） | 3 × 10三 | 5 × 105 |
| 氮气（SD−） | 1 × 102* | 2 × 102* |
| LNL6（SD+） | 3 × 10三 | 6 × 105 |
| LNL6（SD−） | 3 × 10三 | 6 × 105 |
删除环境价值序列
在逆转录病毒载体的许多应用中，在没有污染可复制逆转录病毒或辅助病毒的情况下生成病毒以防止病毒在感染载体的细胞中传播至关重要。逆转录病毒包装细胞系的发展在很大程度上解决了这个问题；然而，辅助病毒的产生仍然很少被观察到。包装细胞和载体中病毒序列之间的同源重叠有助于辅助病毒的产生(15). 不幸的是，目前可用的高滴度载体和包装线都含有这种重叠，因此辅助病毒可能通过同源重组产生(12). 为了解决这个问题，所有人环境价值序列已从下面描述的向量中删除。用于制造PA317细胞的缺陷辅助病毒在环境价值; 因此，不可能通过载体和用于制造PA317包装细胞的缺陷辅助病毒之间的同源重组来生成辅助病毒().
PA317细胞和逆转录病毒载体中病毒序列的比较顶部是复制能力强的鼠病毒AM-MLV的图表，该病毒由MoMLV通过替换环境价值和部分波尔MoMLV与两栖病毒4070A的区域(14). PA317细胞和载体中的序列与辅助病毒对齐，以显示其起源。垂直交叉阴影框显示了PA317细胞中病毒DNA与逆转录病毒载体之间的59-bp同源区域，其中同源重组事件可以将功能性5′逆转录病毒序列添加到PA317中缺陷的辅助病毒DNA中。当ψ+的3′端存在额外的同源性时，该区域的重组将添加带有终止密码子的5′病毒序列，其中堵住起始密码子应该是，因此是非功能性的。3′端不存在同源重叠。缩写分别为PBS−和PBS+，负链和正链引物结合位点；pA，多聚腺苷化信号；SV40，来自SV40的晚期多聚腺苷化信号；LTR，逆转录病毒长末端重复序列；ΔLTR，LTR，5′端缺失；ψ+，逆转录病毒包装信号。箭头指示转录起始位点和转录方向。
描述了包含上述改进并包含用于cDNA插入的独特克隆位点的逆转录病毒载体。矢量LN仅包含新基因，与LNL6相同，只是环境价值和一些非编码区域新已删除。在另一个载体中表达两个基因的策略是从逆转录病毒LTR表达一个基因，从内部启动子表达另一个基因——人巨细胞病毒（CMV）直接早期启动子或猴病毒40（SV40）早期启动子。
改良逆转录病毒载体箭头表示转录起始位点和转录方向，pA表示多聚腺苷酸化信号。显示了cDNA插入的独特克隆位点。所有载体中的序列由5′LTR和来自MoMSV的通过541碱基的序列、来自MoMLV的566-1038碱基的序列、非逆转录病毒序列和来自MoMLV的通过3′LTR的7774碱基的序列组成。逆转录病毒序列号如所述(21). 这个新序列来自转座子Tn5(三)蛋白质编码区被交叉影线化。插入前去除细菌启动子。SV表示Pvu公司II至后面的SV40中包含早期启动子的III片段(8,20). CMV表示余额我要圣诞节来自人巨细胞病毒的III片段，其包含即时早期启动子(5). 独特巴姆HI站点将SV40和CMV启动子与新LNSX和LNCX中的基因序列，允许用其他序列简单替换这些启动子。
高滴度病毒生产
为了测试载体产生高滴度病毒的能力，我们测量了将载体瞬时转染到PA317细胞后的病毒生成。载体滴度范围为105至8×105()因此与N2或LNL6矢量一样高(). 我们还生成了含有LN载体的稳定的产生载体的细胞系。随机选择的G418抗性克隆产生的LN载体高达4×107cfu/ml（立方英尺/毫升）()通过DNA印迹分析，包含未排列的载体序列（未显示）。涉及高滴度载体N2或LNL6的类似实验产生高达2×10的滴度7cfu/ml（立方英尺/毫升）(4,13); 因此，LN载体的滴度与早期的高滴度载体相当。这些结果表明，在构建LN载体过程中对病毒序列进行的修改和删除不会对病毒滴度产生不利影响。特别是，删除整个环境价值该区域不影响位于3′LTR附近的plus-strand引物结合位点。
表2
PA317逆转录病毒包装细胞瞬时转染后产生的逆转录病毒载体滴度
| 矢量 | 转染效率（菌落/μg DNA/106单元格） | 矢量滴定（cfu/ml） |
|---|
| 液态氮 | 4 × 10三 | 8 × 105 |
| LNSX公司 | 4×10三 | 8 × 105 |
| LNCX公司 | 2 × 10三 | 2 × 105 |
| LXSN公司 | 6 × 102 | 1 × 105 |
表3
感染LN载体的克隆性PA317细胞株产生的LN载体滴度
| 克隆 | 滴定度（cfu/ml） | 克隆 | 滴度（cfu/ml） |
|---|
| 1 | 3 × 106 | 7 | 3 × 107 |
| 2 | <2 × 105 | 8 | <2 × 105 |
| 三 | 6 × 106 | 9 | 9 × 106 |
| 4 | 4 × 105 | 10 | 8 × 106 |
| 5 | 3 × 107 | 11 | 4 × 107 |
| 6 | 1 × 107 | 12 | 2 × 107 |
潜在辅助病毒产生的检测
使用S+L（左）−化验，化验(14)未发现辅助病毒（<1ffu/ml培养基暴露于细胞16h）。同时检测两栖性辅助病毒（AM-MLV，)指示辅助病毒浓度>106/ml，表明该方法能够检测辅助病毒。我们传代了PA317细胞，这些细胞产生含有腺苷脱氨酶cDNA插入物的LNSX病毒衍生物（LNSA，参考文献9)7个月以上未产生辅助病毒。该细胞系的两个样品每3-5天进行一次独立传代，并在几个时间点通过S+L（左）−分析和标记物拯救分析。这两种敏感检测均未检测到Helper病毒。
另一种评估从含有逆转录病毒载体的包装细胞中产生辅助病毒的可能性的方法是在病毒在包装细胞之间的连续传代过程中筛选辅助病毒(7). 这一过程为此类事件的重组和放大提供了许多机会。用相同包装细胞产生的病毒重新感染包装细胞是无效的，因为病毒环境价值包装细胞合成的蛋白质干扰携带相同病毒的病毒进入环境价值蛋白质。然而，病毒可以在嗜生态和嗜两性包装细胞之间传代，因为这些细胞产生的病毒粒子使用不同的受体进入细胞。
我们用这种方法测试了含有LN载体的三个不同的PA317细胞克隆和含有N2载体的一个PA317克隆(). 实验开始时，所有细胞系的辅助病毒均为阴性；然而，在N2病毒传代2代后，检测到辅助病毒。相反，LN病毒在8个连续传代过程中对辅助病毒保持阴性，这两个传代都是S+L（左）−和标记物拯救分析。在实验的几个步骤中，通过在有无G418的情况下以低密度电镀受感染的包装细胞来测定新病毒的转移效率。在每个步骤中，超过30%的细胞转化为G418抗性，表明载体在连续传代过程中没有丢失。从PA317细胞连续传代8代后获得的病毒含有高滴度的新病毒，这再次表明新病毒正在顺序转移，并且由于某种原因没有丢失。因此，虽然我们无法证明含有此处所述载体的PA317细胞在所有条件下都是无辅助物的，但这些结果以及载体和PA317包装细胞中病毒DNA之间缺乏同源重叠表明不会产生辅助病毒。
表4
| 助手病毒（ffu/ml）
| |
|---|
| PA317克隆 | PA317型→ | PE501标准→ | PA317型→ | PE501标准→ | PA317型→ | PE501标准→ | PA317型→ | PE501标准→ | PA317型→ | 辅助病毒标记物拯救试验 |
|---|
| 液化天然气c5 | 0 | 第 | 第 | 第 | 0 | 第 | 第 | 第 | 0 | − |
| 液氮c7 | 0 | 第 | 第 | 第 | 0 | 第 | 第 | 第 | 0 | − |
| 液化天然气cl1 | 0 | 第 | 第 | 第 | 0 | 第 | 第 | 第 | 0 | − |
| 氮气c11 | 0 | 第 | 200 | 第 | 第 | 第 | >10三 | | | ++++ |
讨论
我们设计了一套逆转录病毒载体，可以促进cDNA的转移和表达。我们在每个载体中插入了几个cDNA，包括编码嘌呤核苷磷酸化酶的cDNA(16)，系数IX(18)和腺苷脱氨酶(9). 从产生cDNA载体的PA317细胞中获得的病毒滴度为8×105至2×107总的来说，SV40启动子是cDNA表达最弱的启动子，LTR是最好的，CMV启动子是中间启动子。我们发现这些启动子的相对活性取决于感染细胞的类型和插入载体的特定cDNA(9,16,18).
值得注意的是，虽然载体LNCX和LNSX中SV40或CMV转录起始位点和cDNA克隆位点之间没有翻译起始密码子，但LXSN中LTR转录起始位点与克隆位点之间有10个AUG密码子。这些额外的AUG对下游插入的cDNA的翻译几乎没有影响，因为cDNA移动到LTR转录起始位点和第一个AUG之间的位置不会显著增加cDNA编码的蛋白质的产量（W.R.a.Osborne和a.D.M.，未发表的结果）。相反，正常人的存在堵住该区域的起始密码子对新在具有失活剪接供体的N2载体中的表达(). 该结果与翻译的扫描模型基本一致(10)这表明40S核糖体亚单位在mRNA的5′端结合，向下游迁移，并在有利的环境下于第一个8月开始翻译。这个堵住AUG处于有利环境中堵住翻译会抑制新翻译。拆卸后堵住AUG密码子，剩余的AUG中有9个处于较差的上下文中，一个处于有利上下文中的AUG后面紧跟着只有4个下游密码子的终止密码子，这将允许下游翻译的重新启动新启动密码子。
瞬时转染后获得的病毒滴度很高，高达8×105每毫升(和). 使用铯梯度纯化DNA似乎对获得高病毒滴度很重要。我们用于转染的方案是一种较旧的方案，我们还没有评估过据报道可提供更高转染效率的较新方案。无论如何，瞬时转染后的这种高病毒滴度提供了一种从质粒构建中快速生产病毒的方法，并应促进逆转录病毒载体中cDNA克隆的方法。
我们已经能够产生稳定的PA317细胞系，产生超过10个LN载体7cfu/ml。产生如此高滴度的几个因素很重要。首先，逆转录病毒包装细胞系的长时间传代可能导致包装功能不良，可能是因为用于制造这些细胞系的转染逆转录病毒DNA的丢失或失活。在用于将病毒DNA转染到细胞中的选择性试剂中重新选择细胞有助于恢复包装功能。对于PA317细胞，选择HAT培养基将恢复包装功能(4). 其次，重要的是感染而不是转染包装细胞，以形成稳定的细胞系。第三，培养细胞的培养基很重要。大多数批次的胎牛血清效果良好，但我们发现一些可以降低病毒滴度。我们已经能够使克隆细胞系适应小牛血清中的生长，同时保持高滴度病毒的产生，但并非所有血清批次都有效。
虽然辅助病毒不能通过此处描述的改进载体和用于制造PA317或PE501细胞的缺陷辅助病毒之间的同源重组产生，但其他最近描述的包装细胞系并非如此(7,11). 不幸的是，用于制造这些细胞系的病毒DNA在3′LTR中被截断；因此，此处描述的载体的3′端和包装DNA之间不可避免地存在重叠。然而，在这些情况下，产生辅助病毒需要三个同源重组事件，这表明辅助病毒的产生是罕见的。
含有LNL6载体的PA317细胞产生的病毒最近被用于标记肿瘤浸润淋巴细胞，以便在这些细胞重新引入癌症患者体内后追踪这些细胞。在批准用于人体之前需要进行的测试包括辅助病毒和其他可能的病毒污染物的广泛测试，所有这些都是阴性的。在没有检测到辅助病毒的情况下，已经产生了许多升的含病毒培养基，这表明出于实际目的，辅助病毒的产生问题已经得到解决，并且这里描述的载体将有助于人类疾病的治疗。
致谢
我们感谢Jay Morgenstern和Hartmut Land提供环境价值−与化学合成的这些载体的3′LTR相邻的序列。这项工作得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所公共卫生服务拨款的支持。
工具书类
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