简介
在真核细胞中，蛋白质和脂质通过泡状或管状的中间产物在分泌途径的不同细胞器之间运输。一个关键问题是了解膜运输中的靶向特异性，使供体囊泡隔室与适当的受体膜融合。Rab超家族的～60个成员，分布于特定的膜域(Zerial和McBride，2001年)，通过组装促进可溶性组织的特异性栓系复合体，在决定供体和受体膜相互作用中发挥重要作用N个-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白附着蛋白受体（SNARE）蛋白复合物(Zerial和McBride，2001年;Ungar和Hughson，2003年). 供体和受体膜室相互作用的第二层特异性在于选择性形成催化融合的SNARE复合物(McNew公司等。, 2000). 膜隔室具有合成蛋白、囊泡相关膜蛋白（VAMP）和25 kDa（SNAP25）家族突触体相关蛋白的～35 SNARE蛋白的特定亚群(索尔纳等。, 1993;博克等。2001年). 每个双层中的SNARE蛋白组装成四螺旋束，连接两个膜以调节双层混合(韦伯等。, 1998;Chen和Scheller，2001年;扬等。, 2003). 可溶性SNARE基序形成的螺旋束选择性很低，而膜锚定SNARE在介导膜融合中表现出高度的配对特异性(McNew公司等。, 2000;规模等。, 2000).
一个重要的问题涉及SNARE蛋白质自身传递到特定膜室的靶向机制。SNARE的syntaxin和VAMP家族的大多数成员是尾部锚定的II型膜蛋白，其C末端片段将其锚定在膜中。这些SNARE翻译后插入内质网（ER）的双层(库泰等。, 1995)并输送到不同的膜室。而在某些情况下，跨膜结构域足以用于膜靶向(Burri和Lithgow，2004年)在其他情况下，需要细胞质信号将SNARE分类到适当的膜室(马丁内斯·阿尔卡等。, 2003). 与具有特定膜室特征的磷脂酰肌醇脂类结合也在将某些SNARE蛋白靶向膜方面发挥作用(奇弗等。2001年).
SNAP25是钙所需的质膜t-SNARE2+-神经元和内分泌细胞中的触发性小泡胞吐(班纳吉等。, 1996;扬等。, 2003). 与尾锚定SNARE相反，SNAP25在连接两个螺旋SNARE基序的连接结构域中的四个半胱氨酸残基上被棕榈酰化(奥勒等。, 1989;Lane和Liu，1997年;Gonzalo和Linder，1998年;贡萨洛等。, 1999). SNAP25的棕榈酰化赋予其最初的膜结合(赫斯等。, 1992;Gonzalo和Linder，1998年)，但如果与另一种质膜t-SNARE联合体1A配对，则缺乏半胱氨酸簇的突变体保留膜结合(沃格尔等。, 2000;Washbourne公司等。2001年). 然而，非棕榈糖基化SNAP25不能正确靶向质膜(Loranger和Linder，2002年). 靶向质膜需要棕榈酰化以及SNAP25连接域中的QPARV残基(贡萨洛等。, 1999;Loranger和Linder，2002年). 尽管推测的SNAP25棕榈酰转移酶HIP14位于高尔基体和细胞质小泡中，但SNAP25的棕榈酰化的细胞位置尚不清楚(黄等。, 2004). 基于SNAP25棕榈酰化对布雷费尔丁A（BFA）处理的敏感性，有人认为向质膜的转运是通过高尔基体进行的(Gonzalo和Linder，1998年).
神经和神经内分泌细胞中SNAP25的细胞内池被不同程度地归因于高尔基体、内体或分泌囊泡(Duc和Catsicas，1995年;马尔克森等。, 1999;Morgans和Brandstatter，2000年)，但尚不清楚该池是否代表新生物合成的SNAP25正在转运至质膜。在未成熟神经元中，将SNAP25从假定的高尔基池传递到质膜的转运小泡由致密核突触前体小泡组成(翟等。2001年)或成熟神经元中经历快速轴突运输的小管鞘运输囊泡(锂等。, 1996;中田等。, 1998;艾哈迈里等。, 2000).
在当前的研究中，我们确定了SNAP25在PC12神经内分泌细胞中的动态循环途径，SNAP25通过该途径在质膜和内体-TGN室之间循环。SNAP25内化是通过一种构成性的、ADP-核糖基化因子（ARF）6调节的、不依赖动力学的、需要F-actin的内吞途径发生的。SNAP25内体排除了SNAP25的质膜SNARE伴侣syntaxin 1A，与那些来自于氯氰菊酯依赖性内吞作用的内体融合，因此SNAP25与一个新的SNARE伙伴endosomal syntaxion 13结合。这些结果表征了ARF6调节的再循环途径，该途径维持SNAP25的细胞内池，与SNAP25可能的细胞内作用兼容。
材料和方法
细胞培养、转染和DNA构建
如前所述，通过电穿孔培养和转染PC12细胞(Aikawa和Martin，2003年). 如有指示，用含有10μg/ml环己酰亚胺（CHX）（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）、1μM latrunculin A（加利福尼亚州圣地亚哥Calbiochem）或5μg/ml BFA（威斯康星州麦迪逊Epicenter Technologies）的培养基预处理细胞，处理时间为指定时间。通过对SNAP25B开放阅读框进行PCR扩增并克隆到pEGFP-C1（Clontech，Mountain View，CA）中，制备了一个编码与小鼠SNAP25B融合的N末端增强绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒。通过测序检查结构。动态蛋白1-血凝素（HA）（野生型和K44A）结构体由S.L.Schmid（加利福尼亚州拉荷亚斯克里普斯研究所）慷慨提供，Rab5-绿色荧光蛋白（GFP）（野生类型，Q79L，S34N）结构体则由S.Ferguson（加拿大安大略省伦敦罗伯茨研究所）提供，myc-syntaxin 13结构体由H。Hirling（瑞士洛桑神经生物实验室）和PLCδ1PH-GFP由T.Balla（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）建造。ARF6-GFP（野生型，Q67L，T27N）结构如前所述(Aikawa和Martin，2003年).
免疫荧光、Western印迹和免疫沉淀
如前所述进行免疫细胞化学(Aikawa和Martin，2003年). 转染后48小时，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，在4%甲醛中固定30分钟，并用0.3%Triton X-100在PBS中渗透。在含有10%胎牛血清的PBS中稀释初级抗体。使用以下主要抗体：单克隆抗HA（BAbCO，里士满，CA），1:1000；多克隆抗HA（BAbCO），1:1000；单克隆抗SNAP25（Sternberger Monoclonals，Lutherville，MD），1:1000；单克隆抗突触蛋白1A（Sigma-Aldrich），1:1000；单克隆抗TGN-38（K.Howell，科罗拉多大学，丹佛，CO），1:10000；单克隆抗磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸（PIP）2)（K.Fukami，东京大学，日本东京）；多克隆抗甘露糖苷酶II（K.Moremen，乔治亚大学，雅典，佐治亚州），1:100；多克隆抗组织蛋白酶D（Wako Pure Chemicals，日本大阪）；和单克隆抗Rab11抗体（佐米德实验室，加利福尼亚州南旧金山），1:500。
为了监测突触素内吞再循环，PC12细胞在37°C下与5μg/ml N末端抗突触素1抗体（Sigma-Aldrich）和无钙Locke溶液（基础释放）孵育，或用升高的K刺激+溶液（洛克含有59 mM KCl和85 mM NaCl）。清洗后，用4%甲醛固定细胞，用Triton X-100渗透，并与二级抗体反应。为了进行F-actin标记，将固定的Triton X-100渗透细胞与Alexa 568-鬼臼苷孵育。Alexa 568-转铁蛋白（Tf）和德克萨斯红10kDa右旋糖酐的摄取如前所述(Aikawa和Martin，2003年). 为了摄取Alexa 647-霍乱毒素B亚单位（CTxB），将细胞在冰上培养30分钟以结合CTxB，然后用无钙Locke溶液进行广泛清洗，然后在37°C下培养指定时间。德克萨斯红结合葡聚糖和Alexa结合探针从Invitrogen（Carlsbad，CA）获得，如前所述进行免疫沉淀和Western印迹(Aikawa和Martin，2003年). 通过在球形均质器中均质细胞悬浮液，随后在288000×克持续2小时。
共焦显微镜和活细胞成像
使用Bio-Read MRC-600或尼康C1激光扫描共聚焦显微镜和63或100倍油浸物镜对细胞进行检查。使用MetaMorph软件（加利福尼亚州桑尼维尔市分子设备公司）对来自至少三个独立实验的100多个细胞的图像进行荧光定量。显著性评估依据t吨检验（星号，p＜0.001）。在Bio-Read MRC-1024激光扫描共聚焦显微镜上，使用488-nm激光线，以最低功率，在37°C下对活细胞进行选择性光漂白10–15 s。为了分析光漂白后的荧光恢复（FRAP）数据，建立了SNAP25贩运的多室模型(). SNAP25的质膜和高尔基体/内体池被视为两个隔间，通过一级动力学与k个1对应于SNAP25从高尔基体/内体室转运到质膜的速率常数，以及k个2对应于SNAP25从质膜内化的速率常数。的初始值k个2设置为0，对应于无SNAP25回收，并以0.5%分钟的增量逐步增加-1。对于每个值，使用Microsoft Excel为模型生成理论曲线。分别计算实验数据和理论曲线之间的SDk个2价值和比较。的最终值k个1和k个2生成具有最小SD的理论曲线。
光漂白后的恢复定义了SNAP25内化和再循环的动力学。（A） 表达GFP-SNAP25（顶部）或ARF6-GFP（底部）的PC12细胞用10μg ml-1CHX 120分钟，分别进行TGN-38（红色）或SNAP25（红色）免疫染色。（B） 10μg ml处理后内源性SNAP25细胞内室相对荧光强度的定量-1CHX用于指定的时间。每个时间点对50个随机选择的细胞进行量化。（C） 细胞内GFP-SNAP25的光漂白。表达GFP-SNAP25的细胞与CHX孵育30分钟，细胞内隔间（红盒）被488-nm激光漂白。在接下来的60分钟内，每5分钟采集一次Z截面图像。（D）光漂白后细胞内GFP-SNAP25恢复的时间过程。图中显示了典型实验中靠近细胞中部的三个共焦切片上核周区域（•）的平均相对荧光强度。使用以下指示值从模型中绘制实线k个1和k个2（E）表达ARF6的CHX处理细胞中GFP-SNAP25（红盒）细胞内池的光漂白Q67L型（F）ARF6光漂白后细胞内GFP-SNAP25恢复的时间过程Q67L型-典型实验中，在靠近细胞中部的三个共焦切片上，表达细胞的平均相对荧光强度（•）增加。使用以下指示值从模型中绘制实线k个1和k个2（G）SNAP25贩运的两室模型。
结果
ARF6调节质膜SNAP25的内化
SNAP25主要定位于神经和神经内分泌细胞的质膜，在调节的小泡胞吐中充当t-SNARE(班纳吉等。, 1996;扬等。, 2003). 然而，PC12细胞中SNAP25的很大一部分也分布在以前没有描述过的核周隔室中(). 我们发现组成活性GTP-结合ARF6的表达Q67L型PC12细胞中的突变体促进SNAP25在细胞内的广泛积累(Aikawa和Martin，2003年)因此，我们进一步调查了ARF6在SNAP25贩运中的作用。ARF6调节细胞质膜内体运输(D'Souza-Schorey公司等。, 1995;彼得斯等。, 1995)，和ARF6的表达Q67L型突变体将质膜成分重新分配到内胚空泡室(棕色等。2001年;Aikawa和Martin，2003年;纳斯拉夫斯基等。, 2003). 发现野生型ARF6在质膜的管状内陷中与SNAP25共定位(，X/Z方向的箭头）。在GFP-SNAP25的延时成像中，发现含有SNAP25蛋白的小管上皮细胞膜在90秒内从小管内陷处收缩并离开质膜(，圈）。这些结果表明，质膜SNAP25经历了结构性内吞作用。
SNAP25组成性地从质膜内化到ARF6阳性的管状小泡中。（A） 表达ARF6的PC12细胞重量-固定GFP（绿色），用SNAP25单克隆抗体（红色）进行免疫染色。显示的共焦图像是单元底部、中间和顶部（中间）的投影部分（顶行）或光学部分的合并。显示了来自单独字段的垂直（X/Z）部分（底部）。箭头表示内源性SNAP25和ARF6的共定位重量-GFP。（B） 每30秒记录一次表达GFP-SNAP25的PC12细胞（CHX-处理）实时序列中获得的图像。放大方框区域，显示含有SNAP25小泡的小泡被掐断（圆圈）。棒材，5μm。表达正常（C）或高（D）ARF6水平的细胞Q67L型-GFP或表达ARF6T27N型-用单克隆SNAP25抗体（红色）对GFP（E）进行免疫染色。共聚焦显微镜的投影图像和垂直截面（X/Z）如图所示。箭头表示ARF6的内陷Q67L型SNAP25共定位明显。E（X/Z）中的星号表示没有ARF6T27N型以及SNAP25在管状内陷中的共定位。棒材，10μm。（F） 随机选择表达ARF6及其突变体的细胞内SNAP25的定量分析。细胞内SNAP25免疫荧光与总SNAP25的比值×100%绘制为平均值（使用SEM；星号表示p<0.001）。
GTP结合的ARF6的表达Q67L型突变体增加了含有SNAP25的肾小管内陷的数量(，X/Z中的箭头）并增加SNAP25的核周分布(). 在表达高水平ARF6的细胞亚群（～25%）中Q67L型，SNAP25在细胞内ARF6上的广泛积累Q67L型-观察到阳性液泡，相应的SNAP25从质膜上消失(). 相反，GDP-结合ARF6的表达T27N型突变体导致含有SNAP25的小管内陷数量减少，SNAP25在核周的分布减少(). 图像定量证实，在表达ARF6的细胞中，SNAP25的细胞内池显著增加Q67L型并在表达ARF6的细胞中减少T27N型(). 结果表明，ARF6 GTPase调节SNAP25从质膜内化到细胞内隔间，GTP-结合的ARF6发挥促进SNAP25内化的作用。
SNAP25细胞内吞与动力蛋白无关，但与PIP无关2和肌动蛋白依赖
细胞通过包括网格蛋白依赖性和非依赖性内吞在内的多种途径内化质膜成分(Nichols和Lippincott-Schwartz，2001年;康纳和施密德2003). 通过氯氰菊酯包被的小孔的内吞作用依赖于GTPase dynamin，并被显性阴性K44A dynamin突变体的表达所抑制(达姆克等。, 1994). 为了研究SNAP25内化是否依赖于动态蛋白，我们表达了HA-tagged动态蛋白-1并检测SNAP25的亚细胞分布。dynamin K44A突变体的表达而非野生型强烈抑制Tf摄取(). 相反，细胞内SNAP25的相对荧光强度(（右）占总蛋白的约18%（野生型；17.8%；n=150），未因野生型或K44A动态蛋白（K44A；18.3%；n=50）的表达而改变，这表明SNAP25内化是由动态蛋白非依赖性途径介导的。
SNAP25内化是动力学非依赖性和F肌动蛋白依赖性的。（A） 表达GFP-SNAP25（顶行）或GFP-SNAPP25和ARF6的PC12细胞第67季度（最下面一行）与Texas-Red 10 kDa右旋糖酐孵育5分钟。箭头表示GFP-SNAP25（绿色）与右旋糖苷（红色）在外周内胚体（顶部）中的共定位，或右旋糖蛋白在ARF6诱导的含有SNAP25的液泡中积累Q67L型表达式（底部）。（B） 表达dynamin野生型（顶行）或dynamin K44A突变体（底行）和GFP-SNAP25（绿色）的PC12细胞与Alexa 568-共轭Tf（红色）孵育30分钟。在50个随机选择的细胞的图像中量化Tf摄取和核周SNAP25。dynamin K44A的表达在不影响核周SNAP25的情况下抑制了Tf的摄取。（C） 表达GFP-SNAP25（绿色）的PC12细胞与CTxB-Alexa 648（红色）孵育5或15分钟。在5分钟孵育中，CTxB与SNAP25在外周内胚体中几乎没有共定位（顶行），而CTxB在15分钟孵育中与GFP-SNAPP25在核周区广泛共定位（底行，箭头）。（D） 表达GFP-SNAP25（绿色）和ARF6的PC12细胞Q67L型固定后用Alexa 568-指骨苷（红色）染色。投影图像表明，含有SNAP25的液泡被F-actin（箭头）覆盖。（E） 上排，表达ARF6的PC12细胞重量-GFP（绿色）用1μM latrunculin A处理30分钟，固定，并用单克隆SNAP25抗体（红色）染色。SNAP25从质膜（箭头）聚集在ARF6阳性的小管内陷上。最下面一行，表达GFP-SNAP25（绿色）的PC12细胞用latrunculin A处理10分钟，并用Alexa 568-共轭Tf孵育30分钟（红色）。Latrunculin A不影响Tf摄取，但阻止SNAP25的内化。（F） 用1μM latrunculin A处理指定时间后，在50个随机选择的细胞中对细胞内SNAP25进行定量。细胞内免疫荧光与总免疫荧光之比×100%绘制为平均值（•）。实线，对应于基于SNAP25再循环回质膜的速率常数的理论曲线(k个1=2.86%（最小值）-1; 看见)以及SNAP25内部化受阻的假设(k个2=0），很好地拟合实验数据点（r=0.975）。
在PC12细胞中发现表达的GFP-SNAP25与内源性免疫反应性SNAP25共定位（我们的未发表数据）。为了进一步表征SNAP25内吞途径，表达GFP-SNAP25的细胞与Alexa 648-共轭CTxB孵育，后者是含有神经节苷脂GM1的脂筏的标记物，通过一种不依赖于网格蛋白的机制从质膜运输到高尔基复合体(尼科尔斯等。2001年). 摄入CTxB 5分钟后，CTxB和GFP-SNAP25之间几乎没有重叠(但在摄取15分钟时，CTxB与GFP-SNAP25在核周隔室中广泛共定位，可能部分对应于TGN(，底行，箭头）。因此，CTxB和SNAP25的初始内化途径似乎不同，但这些途径随后会趋同。德克萨斯州Red-dextran（液相摄取的标志物）也进行了类似的研究。在这种情况下，含有GFP-SNAP25的外周内体在孵育5分钟内很容易用右旋糖酐标记(，顶行，箭头），这表明SNAP25内体是由胞饮作用引起的。与此一致，组成活性ARF6的表达Q67L型突变体促进与SNAP25共定位的葡聚糖的液相摄取(，底行，箭头）。这些数据表明，SNAP25的内化是由一个受ARF6调节的微胞饮动力学非依赖性途径介导的，这与之前观察到的缺乏传统内吞信号的膜蛋白的膜蛋白对氯氰菊酯依赖性内吞类似(Radhakrishna和Donaldson，1997年).
在其他细胞类型中，ARF6的表达Q67L型据报道可促进富含F-actin的质膜突起(D’Souza-舞蹈等。, 1997;拉达克里什纳等。, 1999). 为了评估SNAP25的内化是否涉及F-actin，我们使用荧光指骨肽测定了F-actin在表达ARF6的细胞中的分布。野生型和ARF6的表达T27N型没有改变正常观察到的F-actin的分布（我们未发表的数据）。相反，ARF6的表达第67季度导致SNAP25聚集的周围空泡室周围的F-actin密度增加(). 为了确定SNAP25内化是否需要F-actin组装，我们使用肌动蛋白聚合抑制剂latrunculin A。在与latrunculin A短暂孵育后，我们在含有SNAP25的质膜处观察到ARF6阳性的小管内陷扩大(，顶行，箭头）。与latrunculin A长时间孵育逐渐减少SNAP25的细胞内池(). 我们可以通过假设latrunculin A仅抑制质膜SNAP25的内化来完全解释细胞内SNAP25丢失的速率（参见和图例）。结果表明，肌动蛋白聚合是SNAP25内化所必需的。相反，latrunculin A治疗未能影响PC12细胞对Tf的依赖性摄取(，底行）。这些研究表明，F-肌动蛋白在从小管内陷生成小管壁转运中间产物中起着重要作用，这些中间产物介导SNAP25从质膜内化。
我们以前的研究表明，ARF6调节磷脂酰肌醇（4）磷酸5-激酶I型[PI（4）P5-激酶]和质膜PIP2PC12细胞合成(Aikawa和Martin，2003年). 确定PIP是否2我们对这种磷脂进行了定位研究。使用PIP进行本地化研究2-渗透性PC12细胞中的特异性单克隆抗体（mAb）显示PIP高度共定位2在质膜上有SNAP25(，箭头），每个都以点状分布。膜穿孔含有ARF6和PIP2(，顶行，箭头）。此外，ARF6的表达Q67L型激活PI（4）P5激酶(本田等。, 1999;棕色等。2001年;Aikawa和Martin，2003年;克劳斯等。, 2003)，促进了广泛的膜PIP2和SNAP25内部化(，底行，箭头）与其他单元格类型的报告相同(棕色等。2001年;德莱尼等。, 2002). 总的来说，这些结果表明SNAP25存在于含有ARF6的膜结构域中，ARF6可能是PIP的活性位点2合成。
质膜SNAP25与PIP共定位2和ARF6。（A） SNAP25（红色）和PIP2（绿色）在渗透性PC12细胞中共定位。将渗透细胞与Mg-ATP和大鼠脑细胞溶胶孵育30分钟，固定并用单克隆PIP染色2抗体（绿色）和多克隆SNAP25抗体（红色）。显示了细胞的中间和底部共焦截面。箭头表示SNAP25和PIP的示例2点状共定位。（B） 免疫反应性PIP2在表达ARF6的可渗透PC12细胞中检测到重量-GFP（顶行）或ARF6Q67L型-GFP（最下面一行）。箭头表示免疫反应性SNAP25（红色）、PIP的共定位2（蓝色）和ARF6-GFP蛋白（绿色）。（C） 表达PLCδ的细胞1-PH-GFP融合蛋白（绿色）用1μM latrunculin A处理30分钟，固定，并用单克隆SNAP25抗体（红色）染色。箭头表示SNAP25和PLCδ的共同定位1-PH-域GFP蛋白。所有钢筋，10μm。
管道2已知可调节许多肌动蛋白调节蛋白的活性，以促进参与膜运动的F-肌动蛋白的形成(Yin和Janmey，2003年). 管道2含有SNAP25的膜域的合成可能通过成核F-actin促进膜内化，与吞噬作用类似(波特略等。, 2000). 与这种可能性相一致，我们发现用latrunculin A处理细胞会导致含有SNAP25的管状内陷物在质膜上积聚，这些内陷物富含PIP2但没有内化(，箭头）。总的来说，这些数据表明ARF6调节PIP2在含有SNAP25的结构域中，质膜上的合成促进了局部F-actin的形成，以促进膜内化。
内化SNAP25与早期内切体融合并转化为再循环内切体
尽管SNAP25通过ARF6依赖性、动力学非依赖性的内吞途径内化，但据报道，SNAP25存在于早期内吞自体抗原1阳性的早期内吞小室中(太阳等。, 2003). 为了确定SNAP25内体是否与源自网格蛋白介导途径的内体融合，我们监测了Alexa 568-Tf的摄取。在简短的（5分钟）培养过程中，内化Tf与SNAP25外体几乎没有共定位()，但在较长时间（15分钟和30分钟）的孵育中，有相当大的重叠(，箭头）。这些数据表明，源于ARF6依赖性、动力学非依赖性途径的SNAP25内体在一定程度上与源于网格蛋白依赖性通路的内体融合。以前曾报道过HeLa细胞中ARF6依赖的内体与来自网格蛋白依赖途径的内体的相似收敛(纳斯拉夫斯基等。, 2003).
含有SNAP25的内体与Tf-阳性的内体室合并。（A） 表达GFP-SNAP25（绿色）和人Tf受体的PC12细胞与Alexa 568-共轭Tf（红色）孵育指定时间。箭头表示GFP-SNAP25和Tf.Bar的共定位，10μm。（B） 表达Rab5的PC12细胞Q79升-固定GFP（绿色）并对内源性SNAP25（红色）进行免疫染色。箭头表示Rab5上内源性SNAP25的积累Q79升-阳性内体。表达myc-syntaxin 13（红色）和ARF6的PC12细胞Q67L型（C–E）或ARF6T27N型（F） 固定并染色内源性SNAP25（绿色）。（C） SNAP25和syntaxin 13在核周区有明显的共定位。（D） 在靠近细胞腹表面的地方，一些SNAP25内体含有联合蛋白13（箭头），而其他SNAP25外体不含有联合酶13（圆圈）。（E） 在表达较高水平ARF6的细胞中Q67L型SNAP25被捕获在一个内胚体液泡中，在那里它与syntaxin-13阳性的内胚体分离。（F） ARF6号机组T27N型表达干扰了SNAP25的内化，在核周区几乎没有发现突触蛋白13与SNAP25共定位。（G） ARF6的表达Q67L型和ARF6T27N型突变体改变了突触蛋白13与SNAP25的联合免疫沉淀。SNAP25抗体免疫沉淀物是从表达myc-syntaxin 13和ARF6的细胞的洗涤剂裂解物中制备的重量，ARF6Q67L型，或ARF6T27N型免疫沉淀物用c-myc抗体进行Western blotting分析，以定量myc-syntaxin 13。显示了三个实验的SEM平均值。共免疫沉淀myc-syntaxin 13在ARF6中显著降低（p<0.05）Q67L型-和ARF6T27N型-表达细胞。
含有SNAP25的内体亚群对Rab5呈阳性反应（我们未发表的数据），Rab5是一种调节内吞小泡与早期内体融合的蛋白质(Zerial和McBride，2001年). 为了进一步描述含有SNAP25的早期内胚体隔室，我们检测了表达Rab5的影响Q79升刺激同种型早期内体融合(斯滕马克等。, 1994). 组成活性Rab5的表达Q79升促进含有SNAP25的大内胚体空泡的形成(，箭头）。这一结果与HeLa细胞中ARF6依赖性MHC I内含内体的报道结果相似(纳斯拉夫斯基等。, 2003)并表明来自ARF6调节途径的SNAP25内体与Rab5阳性早期内体在外周内体分选室中融合。
Syntaxin 13是一种存在于早期和再循环内体上的SNARE蛋白，与内吞Tf共定位(普雷克里斯等。, 1998). 为了表征SNAP25转运到的内胚体腔室，我们确定了SNAP25和syntaxin 13在PC12细胞中的定位。Syntaxin 13存在于外周内体和代表再循环内体的核周隔室上(). SNAP25与突触蛋白13在核周再循环内体室共定位(). 此外，许多外周含SNAP25的内体对syntaxin 13呈阳性反应(，箭头），而其他则为负数(，圈）。这些结果表明，SNAP25内体可能在将SNAP25输送到再循环内体室之前的某个时间点与含有合成蛋白13的内体融合。
广泛过度表达ARF6的细胞Q67L型SNAP25在一个空泡室中积聚，该空泡室比含有核周突触蛋白13的再循环室更局限于外周(). 这可能表明ARF6Q67L型突变体推动了SNAP25的初始内化，但阻止了其被贩运到回收室。相反，ARF6的表达T27N型有效抑制SNAP25内化，SNAP25与syntaxin 13几乎没有共定位(). 作为SNAP25转运到含突触蛋白13的隔间的独立测量，我们进行了联合免疫沉淀研究，以确定这些SNARE蛋白的细胞关联。从野生型ARF6表达细胞的SNAP25免疫沉淀物中很容易分离出Syntaxin 13()如前所述(普雷克里斯等。, 1998). 相反，在过度表达ARF6的细胞中，SNAP25/syntaxin 13复合物显著减少Q67L型突变体，与SNAP25缺乏传递到含有突触蛋白13的再循环内体室一致(). ARF6的表达t27年抑制SNAP25内化的突变体也减少了SNAP25与突触蛋白13的共免疫沉淀(). 结果与SNAP25内体与含突触蛋白13的内体融合并进入再循环内体室的概念一致。
Brefeldin A抑制SNAP25再循环回质膜
我们通过比较细胞内SNAP25的分布与高尔基体、内胚体和溶酶体室特征良好的标记物的分布，进一步确定内化SNAP25转运到的细胞内室的特征。SNAP25的分布与顺式-高尔基标记甘露糖苷酶II(). BFA处理将高尔基蛋白重新分配回内质网(Robinson和Kreis，1992年)将TGN和内体折叠到微管组织中心(利平科特·施瓦茨等。, 1991)并诱导内体再循环室的小管化(van Dam和Stoorvogel，2002年). 虽然BFA处理完全分散了甘露糖苷酶II，但它促进了SNAP25在核周的重新分布，使其分布更加分散，但仍然是核周分布(). SNAP25与TGN标记TGN-38广泛重叠()BFA治疗对这种共定位没有显著影响。诺康唑治疗后，一些细胞内SNAP25与TGN-38的共沸作用持续存在(). SNAP25与再循环内体标记Rab 11也有大量共定位，但与溶酶体蛋白组织蛋白酶D没有共定位(). 总的来说，这些结果表明细胞内SNAP25定位于核周再循环的内体和TGN室。
BFA抑制SNAP25再循环至质膜。用5μg ml-1BFA 30分钟或3μg ml-1诺卡唑（NOC）60分钟（如有指示）。进行免疫细胞化学定位SNAP25（A–D）、高尔基甘露糖苷酶II（A）、TGN-38（B）、Rab11（C，顶行）或组织蛋白酶D（C，底行）。与TGN-38和Rab11共定位但不与甘露糖苷酶II或组织蛋白酶D共定位的核周SNAP25。（D）BFA处理60分钟促进免疫细胞化学检测到的核周SNAP25的积累。（E） 在添加BFA后的指定时间点，在50个随机选择的细胞中对核周SNAP25的积累进行定量。细胞内与总SNAP25免疫荧光比值×100%绘制为平均值（•）。基于SNAP25内部化速率常数的理论曲线（实线）(k个2=最小0.44%-1)源自FRAP分析（参见)SNAP25再循环回质膜的假设被阻止(k个1=0）很好地拟合了实验数据点（r=0.953）。（F） BFA处理将一些膜相关SNAP25转化为细胞溶质SNAP25。用5μg ml-1BFA 60分钟（如指示）。通过Western blotting和密度测定法分析膜（10μg蛋白质，占总蛋白的0.3%）和细胞液（5μg蛋白质占总蛋白0.65%）组分的SNAP25。校正总回收的膜和胞质溶胶蛋白，我们计算出，在未处理的细胞中，总SNAP25的97%与膜相关，而在BFA处理的细胞中，只有50%与膜相关。（G） BFA治疗60分钟后，免疫反应性SNAP25（绿色）与表达的ARF6-HA（红色）在扩大的再循环内体室中共定位（箭头）。
BFA处理促进了SNAP25在再循环内体-TGN室中的逐步积累(). BFA诱导的这种积累是以牺牲质膜SNAP25池为代价的，在环己酰亚胺存在下也观察到这种积累可以抑制从头合成SNAP25(Gonzalo和Linder，1998年). BFA累积的SNAP25细胞内池为ARF6阳性()这表明它代表了一个扩大的再循环内体室。BFA处理诱导再循环内体室的微管化，并延缓蛋白质再循环回质膜(van Dam和Stoorvogel，2002年). 与此相一致，我们可以通过假设BFA仅抑制再循环回质膜（参见和图例）。结果表明，内化的SNAP25通过BFA敏感途径进入再循环的内体-TGN室，从中再循环回质膜。
SNAP25在稳定状态下主要（>97%）与膜相关(). 然而，BFA治疗一小时后，发现SNAP25的相当一部分（～50%）转化为细胞溶质形式(). 据报道，BFA治疗可抑制SNAP25的棕榈糖基化(Gonzalo和Linder，1998年). 我们的结果表明，BFA处理都抑制了SNAP25从再循环内体-TGN室向质膜的转运()以及促进蛋白质的溶解(). 总之，这些结果表明SNAP25的棕榈糖基化可能与其再循环回质膜有关。
ARF6号机组Q67L型刺激SNAP25的内吞作用并阻止再循环
与TGN-38共定位的核周SNAP25部分()可能代表生物合成SNAP25，据报道它通过高尔基传递(Duc和Catsicas，1995年;Gonzalo和Linder，1998年;陶成等。, 2000;Morgans和Brandstatter，2000年)，或可能代表从再循环内体到TGN的逆行运输(里维斯等。, 1993;高希等。, 1998). 将PC12细胞在环己酰亚胺中孵育，在孵育的最初90分钟内，完全阻断蛋白质合成的浓度对核周SNAP25几乎没有影响(). 这些结果表明，在核周隔室中检测到的大多数SNAP25并不代表从头合成的蛋白质。在抑制蛋白质合成的条件下，SNAP25定位于ARF6阳性的内体和TGN-38阳性的TGN元件(). 这些数据与SNAP25从质膜向再循环内体室和TGN的内体转运相一致。
为了直接监测质膜和回收内体TGN目的地之间的转运速率，我们在表达GFP-SNAP25的细胞中使用FRAP。在环己酰亚胺处理的细胞中，对GFP-SNAP25的细胞内池进行选择性光漂白，随后细胞内GFP-SNAPP25荧光恢复，而质膜GFP-SNAP 25则被破坏(). GFP-SNAP25细胞内池的75%在50分钟的培养中恢复()证实细胞内SNAP25与质膜进行动态交换。基于二室模型中交换一阶过程的恢复时间过程动力学建模()提供的速率常数估计值为2.86%min-1用于将SNAP25从再循环内体-TGN室运输到质膜(k个1)最小0.44%-1用于质膜内化到细胞内隔间(k个2) (). 在表达ARF6的细胞中进行了类似的研究Q67L型(). SNAP25内部化的速率常数(k个2)增加三到四倍至1.5%（最小值）-1而再循环回质膜的速率常数(k个1)最低下降两倍至1.38%-1在表达ARF6的细胞中Q67L型(). 数据表明，本构活性ARF6Q67L型突变体加快了SNAP25的内吞作用，减缓了其向质膜的再循环。
ARF6对SNAP25的内在化具有结构性调节作用，但对Syntaxin 1A没有调节作用
SNAP25与突触蛋白1A形成异二聚体复合物(扬等。, 2003)，有人建议这些蛋白质一起运输(沃格尔等。, 2000;沃什本等。2001年). 在免疫荧光研究中，syntaxin 1A仅在质膜上发现，而在细胞膜上未检测到(). 本构活性ARF6的表达第67季度，显性阴性ARF6T27N型，或构成活性Rab5Q79升显著改变SNAP25的分布，但不影响syntaxin 1A的特异性质膜分布(). 这些结果表明，质膜SNAP25通过ARF6调节的内吞途径选择性地再循环，并与合成蛋白1A分离。
SNAP25在胞吐作用后既不与突触合蛋白1A共亲和，也不与囊泡成分共亲和。（A） 表达ARF6的PC12细胞重量-，ARF6Q67L型-，或Rab5Q79升-GFP（绿色）对syntaxin-1A（红色）进行免疫染色。星号表示不含联会蛋白1A的内胚体空泡增大。（B） 表达野生型dynamin-HA或K44A dynamin-HA的PC12细胞与突触结合蛋白I抗体在59 mM K中孵育+缓冲液放置20分钟，并用HA抗体（绿色）和抗兔IgG（红色）进行免疫染色。表达K44A动态蛋白的细胞表现出突触结合蛋白I抗体摄取减少（箭头）。（C） 表达HA-ARF6的细胞重量（蓝色）和GFP-SNAP25（绿色）在59 mM K中孵育指定时间+带有突触凝集素I抗体的缓冲液（红色）。箭头表示囊泡融合的位点，该位点将GFP-SNAP25和突触结合蛋白I抗体共同定位在质膜上。箭头表示内部化突触凝集素I抗体与ARF6共定位重量.
质膜SNAP25对钙至关重要2+-PC12细胞中致密核小泡的依赖性胞吐(班纳吉等。, 1996;扬等。, 2003)在此期间，需要与VAMP 2和syntaxin 1A形成SNARE复合物。SNAP25还与突触蛋白相互作用，突触蛋白在Ca2+-SNARE复合物形成和囊泡胞吐的触发机制(张等。, 2002). 胞吐后，致密核囊泡成分发生代偿性内吞恢复(Patzak和Winkler，1986年;汉高（Henkel）等。2001年)，但SNARE复合物成分分解和回收的精确点尚未确定。为了确定这一点，我们监测了SNAP25和突触结合蛋白I在Ca2+-触发的胞吐。高K去极化+刺激Ca的缓冲液2+内流和小泡胞吐促进了N末端突触结合蛋白I抗体的进行性内化(（左）表示胞吐后的代偿性内吞。与SNAP25内部化不同（参见)突触素K44A突变体的表达强烈抑制了刺激依赖性突触素I抗体的摄取(，箭头），表明它是由动力依赖性内吞作用介导的。内部化突触凝集素I抗体确实与ARF6阳性内体的一个子集共定位(，箭头），这与ARF6也可能调节突触处氯氰菊酯依赖性内吞作用的报告一致(克劳斯等。, 2003).
确定SNAP25是否在Ca后与synaptotagmin I共内化2+我们监测了SNAP25在内化突触球蛋白I抗体的细胞中的分布。突触结合蛋白I抗体对细胞表面进行染色，最初与SNAP25斑块共定位，代表胞吐位点(，5分钟，箭头）。突触结合蛋白I抗体在后期内化(然而，20分钟）与内化SNAP25明显分离。这些结果表明，SNAP25在胞吐过程中存在于SNARE复合体中，随后在代偿性内吞前从质膜平面的突触蛋白I等囊泡成分中分离出来。依赖ARF6的SNAP25内化途径似乎是组成性的，与融合后获取致密核囊泡成分的动力依赖性代偿性内吞途径明显不同。
讨论
SNAP25而非Syntaxin-1A的特异性内化
内化质膜SNAP25的依赖ARF6的内吞途径排除了突触蛋白1A。尽管有人建议SNAP25靶向质膜需要与其质膜SNARE伴侣syntaxin 1A结合(沃格尔等。, 2000;Washbourne公司等。2001年)，SNAP25的正确质膜靶向可以在完全不存在syntaxin 1A的情况下实现(罗伊等。, 1999)或与不与syntaxin 1A相互作用的SNAP25结构(贡萨洛等。, 1999;Loranger和Linder，2002年). 在PC12细胞质膜的稳态状态下，SNAP25和syntaxin 1A没有广泛相关，但定位于不同的膜域(沃格尔等。, 2000; 冗长的等。,2001,2002;肖等。, 2004).
SNAP25在特定质膜域的定位可能是其与突触蛋白1A分离以及通过依赖ARF6的内吞途径选择性内吞再循环的基础。双棕榈酰化膜蛋白分为不同的鞘磷脂/富含胆固醇的膜结构域(阿尼等。, 1998;扎卡里亚斯等。, 2002)，SNAP25也可以这样做(冗长的等。2001年;萨隆等。, 2005). 据报道，胆固醇缺乏会破坏SNAP25的质膜簇(冗长的等。2001年). 研究发现，一种结合胆固醇的多烯大环内酯filipin抑制了HeLa细胞中ARF6依赖的内化途径，而不影响氯氰菊酯依赖的途径，这表明ARF6对特异性富含胆固醇的膜结构域具有选择性(纳斯拉夫斯基等。, 2004). 如果SNAP25位于富含胆固醇的膜结构域中，则这些结构域的细胞质小叶可能会富集PIP2我们的同位化研究表明。这种富集可能是通过肉豆蔻酰化ARF6的膜锚定及其PI（4）P5激酶的补充实现的(本田等。, 1999)以及一种II型PI 4激酶，通过棕榈酰化与raft结构域相关(沃等。, 1998;巴里尔科等。2001年).
SNAP25回收途径的动力学
FRAP研究确定SNAP25内化的速率常数为0.44%min-1增加到1.5%分钟-1在表达组成活性ARF6的细胞中Q67L型突变体。这些数值与最近报道的通过ARF6调节途径摄取HeLa细胞表面蛋白的数值相似(纳斯拉夫斯基等。, 2004). SNAP25再循环动力学的FRAP分析为ARF6调节途径的内化和再循环机制提供了见解。latrunculin A对SNAP25内化的抑制作用()完全被考虑在内（R2=0.975），这支持了SNAP25内化途径完全依赖于质膜上的F-actin组装的结论，这可能代表了ARF6调节的动力非依赖性内吞途径的一般特征。相反，BFA诱导细胞内SNAP25池的扩张()完全被考虑在内（R2=0.953）内化速率常数。虽然BFA不抑制ARF6的激活，但它确实抑制ARF1的激活和外壳蛋白的募集(Randazzo公司等。, 2000). BFA对SNAP25的抑制表明，SNAP25再循环回细胞表面是通过一个管状内胚体再循环室介导的，该内胚体循环室使用涂有甲氰菊酯的芽(van Dam和Stoorvogel，2002年).
动态蛋白非依赖性SNAP25内化的基础速率慢于网格蛋白依赖性内吞途径的基础速率（速率常数0.44和2-10%min-1分别为；穆克吉等。, 1997)，但组成活性ARF6的表达Q67L型突变体使SNAP25的内化速度加快了约四倍。ARF6调节途径可通过多种特征ARF6 GEF蛋白（如mSec7）在调节质膜SNAP25水平中发挥作用(阿瑟里等。, 1999). 质膜SNAP25的内吞作用，特别是在神经元突触或树突等极化区域，可能会使SNARE蛋白的速率受到限制，从而改变囊泡胞吐的概率。
SNAP25回收的潜在作用
我们的结果记录了SNAP25的组成性活性回收途径，这引发了回收可能发挥什么作用的问题。SNAP25蛋白在PC12细胞中的半衰期为～10小时(莱恩和刘，1997年)这表明SNAP25分子在其生命周期内将通过大约三次再循环途径。因为在SNAP25上测得的棕榈酸酯半衰期为～3小时(莱恩和刘，1997年)SNAP25的内吞再循环可能与去棕榈酰化和再棕榈酰化的循环相耦合。假定的SNAP25棕榈酰转移酶HIP14显示高尔基体和细胞质小泡定位(黄等。, 2004)这表明SNAP25的重膜化可能发生在其再循环回质膜的过程中，正如神经元突触后PSD-95和突触前GAD65所描述的那样(Smotrys和Linder，2004年). 这将为发现SNAP25棕榈酰化被BFA阻断提供一个有吸引力的解释(Gonzalo和Linder，1998年). 我们的结果表明，BFA阻止SNAP25再循环回质膜()并促进SNAP25从膜相关形式转化为细胞溶质形式(). 转化为细胞溶质形式可能导致SNAP25的累积去棕榈酰化。总的来说，结果与SNAP25内吞作用与其去膜化耦合，再循环回质膜再膜化耦合的可能循环一致。
SNAP25内化的第二个可能作用可能是将蛋白质靶向内胚体膜，在内胚体融合中它可能作为SNARE蛋白质发挥作用。肉毒杆菌神经毒素E是一种蛋白酶，可裂解SNAP25和SNAP23的某些亚型，据报道，它在体外抑制早期内体融合(太阳等。, 2003). 我们最近的研究表明，肉毒杆菌神经毒素E轻链在PC12细胞中的表达阻止了SNAP25以及其他内吞物质向核周再循环内体室的转运（Aikawa、Lynch、Boswell和Martin，未发表的数据）。SNAP25在内体融合中的作用将为当前工作中描述的内化途径提供功能上的理论基础。
