临床投资杂志。2006年2月1日；116(2): 506–511.
线粒体醛脱氢酶-2（ALDH2）Glu504Lys多态性导致疗效的变化舌下含硝化甘油
,1,2 ,1 ,2,三 ,4 ,1 ,5 ,2 ,2,三 ,三 ,1 ,1 ,1 ,6 ,6 ,2,三和1,6
李一峰
1中华人民共和国上海复旦大学生命科学学院基因工程国家重点实验室和Morgan Tan国际生命科学中心。2位于中华人民共和国上海市的中国国家人类基因组中心。三中华人民共和国上海市第二医科大学瑞金医院。4华山医院，复旦大学医学中心，中国上海。5中国上海复旦大学医学中心妇产科医院。6辛辛那提大学医学院，美国俄亥俄州辛辛那蒂。
张琰琰
1中国上海复旦大学生命科学学院和摩根坦国际生命科学中心基因工程国家重点实验室。2位于中华人民共和国上海市的中国国家人类基因组中心。三中华人民共和国上海市第二医科大学瑞金医院。4华山医院，复旦大学医学中心，中国上海。5中华人民共和国上海市复旦大学医学中心妇产科医院。6辛辛那提大学医学院，美国俄亥俄州辛辛那蒂。
魏晋
1中国上海复旦大学生命科学学院和摩根坦国际生命科学中心基因工程国家重点实验室。2位于中华人民共和国上海市的中国国家人类基因组中心。三中华人民共和国上海市第二医科大学瑞金医院。4华山医院，复旦大学医学中心，中国上海。5中国上海复旦大学医学中心妇产科医院。6辛辛那提大学医学院，美国俄亥俄州辛辛那蒂。
邵春红
1中国上海复旦大学生命科学学院和摩根坦国际生命科学中心基因工程国家重点实验室。2位于中华人民共和国上海市的中国国家人类基因组中心。三中华人民共和国上海市第二医科大学瑞金医院。4华山医院，复旦大学医学中心，中国上海。5中国上海复旦大学医学中心妇产科医院。6辛辛那提大学医学院，美国俄亥俄州辛辛那蒂。
彭荣燕
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徐从建
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盛海辉
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刘燕（Yan Liu）
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余金德
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谢玉英
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赵英南（音）
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达鲁·鲁
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丹尼尔·内伯特
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唐纳德·哈里森
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魏黄
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李进
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通信地址：李进，复旦大学生命科学学院和摩根坦国际生命科学中心基因工程国家重点实验室，上海200433，中华人民共和国。电话：86-21-65642800；传真：86-21-55664388；电子邮件：在700nijl条件下的最大流量或：辛辛那提大学医学院环境卫生系基因组信息中心，地址：3223 Eden Avenue，PO Box 670056，Cincinnati，Ohio 45267-0056，USA电话：（513）558-2106；传真：（513）558-0071。收件人：黄伟，中华人民共和国上海市碧波路250号中国国家人类基因组中心，邮编：201203。电话：86-21-50801795；传真：86-21-50801795；电子邮件：nc.hs.cghc@iewgnauh. 2005年8月11日收到；2005年11月15日接受。
摘要
三硝酸甘油（GTN），也称为硝酸甘油，用于治疗心绞痛和心力衰竭已有130多年的历史。最近，研究表明线粒体醛脱氢酶-2（ALDH2）负责生成NO，NO是GTN功效所需的代谢物。在目前的研究中，我们发现在第12外显子中常见的G-to-A多态性ALDH2型-导致Glu504Lys替代物几乎消除了杂合子和纯合子中的ALDH2活性，这与中国受试者舌下GTN缺乏疗效有关。我们还表明，催化效率（V最大值/K（K）米)Glu504蛋白的GTN代谢比Lys504酶高约10倍。我们的结论是，Lys504等位基因的存在在很大程度上导致了对硝酸甘油缺乏有效的临床反应；我们建议在给患者服用硝化甘油时考虑到这一遗传因素，尤其是亚洲人，他们中有30-50%的人具有非活性ALDH2*2型突变等位基因。
介绍
自1876年首次临床应用以来，三硝酸甘油（GTN），也称为硝酸甘油，已广泛用于冠心病的治疗。舌下注射GTN是急性心绞痛的标准治疗方法，这种症状通常在5到10分钟内缓解(1). GTN治疗作用的生理机制直到最近才得到解释(2)；代谢后，GTN释放具有药理活性的NO或NO同系物S公司-硝基硫醇，可以激活环鸟苷酸（cGMP），从而放松血管平滑肌(1–三). 其生物转化的确切机制仍有争议(4,5)直到Stamler和同事(2)表明线粒体醛脱氢酶-2（ALDH2）是主要负责GTN生物活性的酶，导致NO的释放。这一事实现已得到证实，抑制ALDH2有助于GTN耐受(6). 此外，研究Aldh2铝–/–老鼠(7)最近的研究表明，线粒体ALDH2对于GTN治疗水平产生的血管活性是必要的和充分的。
ALDH2型是人类19个成员之一ALDH公司NAD（P）基因家族+-依赖性酶(8). ALDH2是参与乙醛氧化的主要酶，其生理浓度通常在人饮酒时发现。除了上述脱氢酶活性外，ALDH2还具有酯酶活性(9)催化硝酸甘油水解生成1,2-硝酸甘油（1,2-GDN）和亚硝酸盐（NO2–) (2). 已知第12外显子中一个常见的多态性，即谷氨酸在504位被赖氨酸取代（Glu504Lys），基本上消除了其脱氢酶活性，因此其清除纯合子中乙醛的能力，并使杂合子中的酶活性降低约94%(10–12). 在全球范围内，Lys504等位基因在包括中国人在内的亚洲人群中的患病率最高（30-50%）(13). ALDH2是一种四聚体，1个缺陷亚基足以使整个酶失活；因此，Glu504纯合子(ALDH2*1/1)表现出正常的酶活性，Glu504/Lys504杂合子(ALDH2*1/2)显示约6%的正常活性，Lys504纯合子(ALDH2*2/2)对乙醛的活性可忽略不计(12). 这个ALDH2*2型因此，等位基因作为常染色体显性性状遗传(11,12,14). 这种突变被认为是防止酗酒发展的一个保护因素，并可能解释不同种族人群的不同饮酒习惯(13).
定点突变研究表明，ALDH2 Cys319是脱氢酶和酯酶活性必需的亲核碱(15). 用赖氨酸504代替Glu504，赖氨酸的正电荷不仅削弱了NAD之间的相互作用+和酶，但将Cys319的亲核性降低10-20倍(16). 自NAD以来+和第页-醋酸硝基酚（测定ALDH2酯酶活性的常用底物）具有相同的结合位点(17)由于乙醛是ALDH2对GTN周转的竞争性抑制剂(2)，似乎这种多态性不仅影响脱氢酶活性，而且也会影响酯酶活性(18). 这促使我们研究Glu504Lys突变在体外GTN代谢激活中的作用以及临床人群中的GTN疗效。
结果
临床研究。
舌下GTN疗效的个体差异与此之间的关系ALDH2型对中国人群的多态性进行了调查。如方法所述，从568名冠心病患者中，我们确定了80名舌下GTN患者，他们有资格进行进一步分析。然后我们将这些患者分为两组：GTN有效的患者和GTN无效的患者（表). 我们发现两组之间没有显著差异（表)关于性别、年龄或疾病的严重程度。在80名患者中，59名（74%）受试者对药物有反应。其中ALDH2*1/1纯合子的有效率（47个中有40个，或85.1%）高于携带至少一个ALDH2*2型等位基因（33个中有19个，占57.6%），优势比为4.21（95%置信区间，1.51-11.7）。通过χ2分析表明，舌下GTN的疗效与ALDH2*1/1纯合子，带有P（P）=0.006（双尾皮尔逊χ_检验）和P（P）=0.009（双尾Fisher精确检验），使用SPSS 11.0版。在对性别、年龄和疾病严重程度进行调整后，也仍然存在显著的相关性。此外，我们对ALDH2型30名无关健康中国人的基因（未显示），除Glu504Lys外，编码区（包括线粒体先导肽）或剪接/连接突变未发现非同义突变。这些数据表明ALDH2型可能导致舌下GTN疗效变化的变异不太可能发生。
GTN无反应组包括21名患者（26%）；这种舌下GTN无应答者的发病率高于美国人群中12%的无应答者(19). 然而，考虑到种族可能存在的差异以及用于确定这两个人群的舌下神经营养不良疗效的标准，我们认为26%与12%的差异不太可能显著。
酶动力学。
接下来，我们研究了Glu504Lys突变对ALDH2酶体外动力学特性的影响。从发生GTN生物转化的血管中获取足够数量的酶几乎是不可能的；另一方面，肝脏是ALDH2的合理来源，因为血管中的ALDH2和肝脏在GTN生物转化中表现出相似的催化特性(2). 因此，我们收集了自然流产胎儿的肝脏，并获得了ALDH2*1/1和ALDH2*1/2肝脏（图A） 因为已知胎儿的肝脏ALDH2在不同基因型的催化特性方面与成人相似(20). 这个ALDH2型纯化ALDH2蛋白之前，确定每个胎儿的基因型。由于没有获得Lys/Lys504纯合胎儿，我们使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达Lys504突变体和Glu504天然酶（图B） ●●●●。
纯化的ALDH2蛋白（考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶）。(A类)从人胎肝中纯化的ALDH2蛋白。泳道1，来自ALDH2*1/1基因型；通道2，蛋白质来自ALDH2*1/2基因型；车道3，分子量梯。(B类)通过亲和层析纯化的重组ALDH2蛋白。车道1，分子量梯；通道2，蛋白质来自ALDH2*1/1基因型；泳道3：来自ALDH2*2/2基因型。
表显示了ALDH2脱氢酶和酯酶活性（GTN转化）。图描述了用于K的Lineweaver-Burk图米和V最大值所有4种ALDH2酶的估计。ALDH2*1/1（Glu/Glu504）胎酶的参数与重组ALDH2x1/1酶的参数相似。来自胎肝或重组形式的ALDH2*1/1酶显示出明显较低的K米和更高V最大值ALDH2*1/2（Glu/Lys504）胎酶或ALDH2*2/2（Lys/Lys504）重组酶。对于ALDH2脱氢酶活性，ALDH2*2/2约为2%，而ALDH2*1/2约为ALDH2x1/1活性的13-14%。对于GTN催化效率（V最大值/K（K）米)ALDH2*2/2的活性为6-7%，ALDH2*1/2的活性为8-15%。在所检测的所有形式的酶中，1,2-GDN/1,3-GDN的比率恒定在8:1。此外，ALDH2*1/2杂合子中GTN生物转化的减少在ALDH2x1/1受试者中占主导地位，这一发现与ALDH2脱氢酶活性相似(12,14). 尽管杂合突变体和纯合突变体的GTN生物转化催化活性降低，但与各自的脱氢酶活性相比，其活性仍相对较高。表还表明杂合子中的Lys504酶导致GTN催化效率降低约10倍。
GTN作为胎儿ALDH2*1/1可变底物的代表性Lineweaver-Burk图(A类)和ALDH2*1/2(B类)和重组ALDH2*1/1(C类)和ALDH2*2/2(D类)酶。
讨论
本研究的主要发现首次证明了ALDH2第12外显子常见的G-to-A多态性（导致Glu504Lys替代）与中国受试者舌下GTN缺乏疗效有关。我们发现催化效率（V最大值/K（K）米)Glu504蛋白的GTN代谢比Lys504酶高10倍。因此，我们得出结论，Lys504等位基因的存在在一定程度上导致了对硝酸甘油有效反应的失败。
硝酸甘油仍然是治疗冠心病最常用的有机硝酸盐之一。虽然慢性GTN治疗会导致内皮功能障碍(21,22)GTN并没有提供生存益处，掌握了GTN正确使用方法的患者将其视为“神奇药物”(23). 最近Stamler及其同事表明，ALDH2主要负责释放NO之前GTN的生物活性(2,7). 他们表明，依赖于cGMP的GTN的血管舒张可以在体内和体外被ALDH2抑制剂阻断，而不依赖于cGMP的舒张没有受到影响(2). Kollau等人的研究证实了这些结果(24)和Zhang等人(25)表明ALDH2确实有助于（尽管不是唯一介导）观察到的线粒体中GTN的生物活性。此外，ALDH2在生物转化中的中心作用已被抑制ALDH2有助于GTN耐受的事实证实(6).
我们没有找到47个ALDH2*1/1显示GTN疗效的纯合子，33名受试者中有33名至少携带一个ALDH2*2型无GTN功效的等位基因表明，其他修饰基因和/或环境因素也必须反映在该性状中(26). 这些数据也与之前的报告一致，即其他途径似乎参与了GTN的代谢，如谷胱甘肽S公司-转移酶(4)和1个或多个细胞色素P450(5). 这可能有助于解释GTN对某些患者的疗效，尽管他们的ALDH2基因缺陷。根据功能研究结果和以前的报告，ALDH2的催化效率远高于其他酶，这些酶在GTN生物转化过程中表现出相同的功能(27). 从NO生物学的角度来看，线粒体GTN还原酶活性显著高于线粒体NO合成酶活性(28,29).
硝酸甘油生物转化能力下降涉及到以下几个因素：ALDH2*2型杂合子。主要是K米值增加，V最大值与天然酶相比，杂合子和纯合子突变体ALDH2的值急剧下降。催化效率（V最大值/K（K）米)Glu504蛋白的GTN代谢比Lys504酶高约10倍。我们认为动力学性质的变化是GTN生物转化减少的主要原因。其次，肖等人报告说ALDH2*2型等位基因不仅通过降低催化活性发挥其主导作用，还通过增加其周转率发挥其主导效应，半衰期降低到天然酶的近一半（22小时对14小时），天然酶和突变酶之间的半衰期差异可导致ALDH2总蛋白减少34%(30).
功能性ALDH2酶需要四聚体激活(10)；如果4个亚基中的任何一个是有缺陷的Lys504同型，则整个四聚体的活性将严重受损(12,31).
酯酶和脱氢酶活性具有相同的机制，只是氢化物转移步骤不参与酯酶反应。定点突变研究表明，Cys319是脱氢酶和酯酶活性必需的亲核碱，Glu285是激活Cys318所需的特异性碱(15,32). 天然酶和突变酶对醛的动力学性质差异的分子机制已经得到了深入研究。Lys504酶活性的急剧下降反映出NAD之间的相互作用减弱+和酶（NAD的Lys504酶的解离常数+是天然Glu504形式的50倍）；当人重组酶中的Glu504被Gln残基取代时，发现其动力学特性与天然形式的动力学特性相似(16). 另一方面，受Lys504正电荷干扰，Cys319亲核性降低（减少约10-20倍）可能是酶活性降低的另一个因素(16). Cys319亲核性降低似乎是V降低的原因最大值Lys504酶对GTN生物转化的价值。此外，据报道，Glu504和Arg492之间的盐键对于维持酶的活性结构是必要的(33,34)Lys504酶中这种盐键的丢失是导致突变酶半衰期缩短的另一个因素。
ALDH2先前的氨基酸命名法已更新。ALDH2蛋白中众所周知的Glu487Lys突变实际上是Glu504Lys，这是由于一个由17个氨基酸组成的N末端线粒体先导肽(http://www.ensembl.org/index.html; http://snpper.chip.org/)之前在酶残基的编号中没有考虑到。因此，该酶的所有氨基酸都需要通过添加17个残基进行校正。这就是我们在本出版物中所做的工作。
考虑到GTN在冠心病治疗中的广泛应用，我们建议在给患者服用硝酸甘油时考虑到这一遗传因素，尤其是对亚洲人，他们中有30-50%的人具有非活性ALDH2*2型等位基因。除了DNA测试外，众所周知，对酒精的“冲洗反应”是ALDH2*2型等位基因(35). 因此，如果DNA测试不易获得，这种测试可能是执业医生预测舌下GTN疗效的一种方便和保守的替代方法。
方法
学科。
所有受试者均为汉族。本研究的方案得到了上海中国国家人类基因组中心伦理委员会的批准（内部审查委员会第0012号），并获得了每个受试者的知情同意。共有568名患者经冠状动脉造影确诊患有冠心病。然后采用以下纳入标准：（a）稳定型心绞痛（根据WHO诊断标准）；（b） 没有其他可能表现出类似冠心病表现的确诊疾病；（c） 急性心绞痛发作时自用舌下GTN；和（d）没有其他抗心绞痛药物与GTN一起服用。应用这些纳入标准，选择111名受试者进行进一步分析。根据之前的一份报告，这些受试者被分为两组，一组是GTN有效组，另一组是无效组(19)，稍作修改。使用11级疼痛判断量表确定对舌下GTN的反应，0级表示无疼痛，10级表示最大疼痛（刺激性测试不太主观，但由于缺乏安全性，招募的受试者不接受）。GTN有效组符合以下标准：（a）疼痛程度至少降低2级；（b） 服用GTN后10分钟内疼痛缓解；心绞痛时间缩短。GTN无效组符合以下标准：（a）舌下注射GTN后，疼痛没有缓解或仅减轻1级，（b）心绞痛持续时间没有改变(19). 舌下GTN给药后10分钟以上疼痛明显减轻的患者被排除在外，因为该药物具有众所周知的快速临床效果(36). 这种排除进一步将我们的样本量减少到80名受试者。
基因分型。
从白细胞中提取基因组DNA，DNA序列跨越ALDH2型PCR扩增多态性。使用ABI 3100测序器（应用生物系统）通过直接测序进行基因分型。
ALDH2纯化。
总共收集了20个自然流产的胎儿。这个ALDH2型酶纯化前测定每个样品的基因型。净化程序按照之前报告的方法进行(17,37)，稍作修改。每个基因型的胎肝（50 g）在0.9%氯化钠冷溶液中清洗。在提取缓冲液A（30mM磷酸钾、1mM EDTA、1mM二硫苏糖醇、2mM苯甲脒和70mM 2-吗啉乙烷磺酸；pH 6.0）中均化后，按照线粒体分离试剂盒（Sigma-Aldrich）中的说明，从匀浆中分离线粒体级分。最终纯化的线粒体颗粒被再次悬浮并通过超声波破碎。将线粒体总蛋白加载到DEAE-Sepharose 4B柱上，以去除污染蛋白。将具有ALDH2酶活性的流通馏分混合，并加载到α-羟基氰化酶-Sepharose 6B色谱柱上，该色谱柱已与缓冲液A平衡。清洗色谱柱，直到流出物在280 nm处没有吸收物质。然后，通过在培养箱缓冲液a和缓冲液B（0.42 M磷酸钾、1 mM EDTA、1 mM DTT、2 mM苯甲脒和70 mM MES；pH 7.6）中混合，以线性pH梯度（pH 6.0至pH 7.6。用缓冲液A重新平衡色谱柱。在缓冲液A中用2 mMα-羟基氰氰酸特异性洗脱ALDH2酶活性。通过超滤将含有ALDH2活性的部分浓缩至最终体积5.0 ml，然后在4°C下与缓冲液A透析过夜。蛋白质纯度用SDS-PAGE测定，蛋白质用考马斯蓝染色；纯化后的酶经蛋白测序证实。所有步骤均在4°C下进行。该酶在-70°C的温度下储存在20%（v/v）甘油中。
ALDH2表达。
从λgt11（Clontech）构建的人类肝脏cDNA文库中，使用2组引物，通过2步巢式PCR扩增分离出全长ALDH2 cDNA。对于长PCR引物，正义引物为5′-AGCTGCGCCCATCCCGAGGAAT-3′，反义引物为5'-TCGGAGTTAGAGCGTTTCAGAG-3′。对于嵌套PCR引物，感测引物为5′-CACTCGAGGCGCGCTGTGC-3′，其中包括Xho公司I限制性位点，反义引物为5′-TCAAGCTTTATGAGTTCTTCTGAGGCACTTTGAC-3′，其中包括后面的III限制场所。巢式PCR产物用Xho公司我和后面的III并插入Xho公司我/Hind公司pFastbac1质粒形成pFastba1的III位点-ALDH2*1型（图). 重组质粒经限制性内切酶消化和测序鉴定。按照制造商的说明，通过定点突变（Mutagene Kit；Takara Bio Inc.）将突变引入重组质粒，并通过DNA测序验证突变。根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen Corp.）手册中的说明进行重组病毒向sf9细胞的转座和转染。免疫印迹法证实重组ALDH2蛋白表达成功。对于重组蛋白，我们遵循上述人类胎儿肝脏ALDH2的纯化和储存方法，但没有分离线粒体。最终酶制剂在考马斯蓝a染色的12%聚丙烯酰胺凝胶上显示出约54 kDa的单一蛋白带。酶在–70ºC和20%（v/v）甘油存在下保存。
通过细菌PCR和通用引物筛选含有插入的ALDH2 cDNA片段的质粒。通道1、2和4，从含有重组质粒的菌落中扩增出的PCR产物；泳道3，阴性对照；车道5，标记。
酶活性测定。
如前所述，在25°C的Unikon 941双光束分光光度计中，通过在340 nm的荧光分光光度法监测NAD生成NADH来测定ALDH2脱氢酶的活性(38). 分析混合物包含100 mM三羟甲基氯化钠（pH 8.5）、1 mM NAD和1 mM 4-甲基吡唑，通过添加1 mM丙醛开始反应。ALDH2活性的一个单位被定义为产生1μmol NADH/分钟。由[2形成1,2-GDN和1,3-GDN-14C] 如前所述，GTN（GTN转化测定）通过薄层色谱法和液相色谱法测定(2,39). 蛋白质浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白为标准。
酶动力学。
K（K）米使用Lineweaver-Burk图分析（图)由初始速度的测定得出。每个分析点至少进行三次并取平均值。标准偏差小于平均值的15%。
统计。
关联分析（双尾学生t吨检验和χ2测试）使用SPSS 11.0版（SPSS Inc.）进行。连续变量表示为平均值±SD，并与Student的独立变量进行比较t吨测试。分类变量用百分比表示，χ2测试用于确定关联的显著性。通过多元logistic回归检验协方差的影响。动力学参数，如K米和V最大值催化效率表示为V最大值/K（K）米比率。
致谢
我们感谢所有人类受试者使这项工作成为可能。这项工作得到了中国高技术计划（863）（2002BA711A10）、上海市科学技术委员会（03DJ14008、04DZ14003）、中国基础研究计划（973）（2004CB518605）、中国教育部（2003）和国家卫生研究院（P30 ES06096至D.W.Nebert和L.Jin）的资助。
脚注
李一峰、张丹丹和魏晋为这项工作做出了同等贡献。
使用的非标准缩写：醛脱氢酶-2；cGMP，循环GMP；1,2-GDN，1,2-甘油硝酸酯；GTN，三硝酸甘油。
利益冲突：提交人声明不存在利益冲突。
工具书类
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