导致不同基因表达模式的发育决定需要在多轮细胞分裂中保持。Polycomb组（PcG）和trithorax组（trxG）锁的蛋白质通过产生稳定且可遗传的高阶染色质结构来确定基因表达状态。PcG蛋白家族成员形成沉默复合物并保持被抑制状态，而相反作用的trxG蛋白促进转录并保持活性和开放染色质模式（有关最新综述，请参阅参考文献13).
众所周知，这种调控的靶点称为细胞记忆，是同源基因簇，其产物决定了多细胞生物的轴向细胞特性。在黑腹果蝇，烟熏复合物（BX-C）包含三个同源异型基因Ultrabithorax公司(超双胸),腹部-A(阿卜杜勒-A)、和腹部-B(阿卜杜勒-B). 胸腹部部分的Parasegment-specific细胞鉴定是通过沿着发育中苍蝇的前后轴对每个同源异型基因进行差异和严格控制的表达来实现的(21,35).
比特拉克斯综合设施分为九个大的顺式监管单位(大约/大约,bxd/pbx、和iab-2型到iab-8型)，负责三个同源异型基因的正确副片段特异性表达模式。胚胎作用的母体基因和分段基因设置了同源异型基因的副片段特异性表达模式。在顺式调控序列、染色体元件，如类沥青(bxd公司),错位色素沉着(Mcp公司)、和前腹-7(制造7)被确定为Polycomb群反应元件（PRE）。随后，它们是在适当的片段域中维持相应同源异型基因的早期抑制表达状态所必需的(5,11,15,18,28). 然而，在这些染色体位点上，PcG和trxG蛋白同时存在共定位(30,33,36). 因此，染色体记忆元件似乎包含多囊群（PRE）和三胸群（TRE）蛋白质的靶点，表明这些元件负责支持转录沉默和激活状态。
通过使用转基因检测，我们之前已经证明DNA包含工厂7PRE发挥了这一作用。为了模拟由分割基因瞬时激活的同源异型基因的内源性情况，使用了GAL4诱导系统(4,41). 这个工厂7PRE与UAS关联-lacZ公司基因和迷你-白色作为转换标记。如果没有GAL4工厂7元素起到消音器的作用，抑制两种报告基因。然而，当GAL4在胚胎发生过程中激活时，UAS-lacZ公司记者变得同质化了。虽然GAL4脉冲仅在胚胎发生期间发出，但mini-白色在成年苍蝇中仍能观察到眼睛中的基因。自从mini的表达-白色该基因仅在蛹晚期需要，这一结果表明GAL4激活工厂7保持开放的染色质构象，即使在去除GAL4反式激活子后也显示相邻报告基因的表达(8,9). 因此，工厂7可以在整个发育过程中促进染色质的沉默或激活状态。PRE和trithorax群反应元件的组合功能称为细胞记忆模块（CMM）(7).
目前，对CMM功能的分子机制知之甚少。沉默似乎是该元素的默认状态，因为PcG蛋白通常以副片段位置无关的方式被招募到PRE。含有PRE的转基因通常会沉默附近的报告基因以及转化标记，如白色基因。然而，实现序列特异性的机制仍不清楚。如果沉默是一种默认状态，那么一个重要的问题是CMM如何失去其抑制功能，并以特定于细分市场的方式被遗传激活。越来越多的证据表明，靶基因的转录状态触发了CMM的活动模式：通过GAL4或LexA DNA结合域对PcG蛋白的系留表明，Polycomb沉默取决于抑制融合蛋白表达的时间窗(27,31).
因此，了解坐标测量机在多大程度上可以感应到它们应该控制的基因的活动就变得很重要了。在碧托拉克斯复合体中制造7CMM位于阿卜杜勒-B发起人。其他明显的存储器元件，如Mcp公司甚至离目标转录单位更远。事实上，为什么烟蚜复合体调控元件分散在如此广泛的染色体区域，以及为什么存在如此大的基因间控制区，一直是一个主要的谜团。另一个令人惊讶的结果是，这些基因间调控区域似乎在特定发育时期转录。
在这些区域发现非编码RNA已经有十多年了。这些转录物首先出现在细胞胚层阶段。Lipshitz等人(22)据报道，在bxd公司单位。此外阿卜杜勒-A和阿卜杜勒-B基因以副片段特异的方式表达非编码RNA(1,12,34). 虽然这些推测为非翻译RNA的功能目前尚不清楚，但有人认为它们可能参与同源基因表达的调节(12,17).
在这项工作中，我们展示了CMM功能，最初为工厂7元素，也适用于其他含有特征性烟酸复合体PRE的染色体元素，例如Mcp公司和bxd公司在我们的转基因检测中，我们观察到CMM的激活伴随着通过元件的转录。事实上，删除包含转录启动子的序列会阻止CMM的激活。因此，通过CMM的转录似乎是重塑染色质以产生稳定和可遗传的活动记忆状态所必需的。我们认为这是基因间转录物的功能作用，因为它们以适当的空间和时间方式表达，以副片段特异的方式转换相应的CMM。
结果
烟熏复合物中的CMM。
工厂7，最初在双腔复合体中被鉴定为PRE，能够募集PcG的成员以建立基因沉默复合体。然而，工厂7也有必要保持阿卜杜勒-B这意味着它能够通过几轮细胞分裂传递开放或闭合的染色质构象(8). 对我们来说，一个有趣的问题是，这是否是含有PRE的染色体元件的一般功能。为此，我们测试了另外两种众所周知的烟熏复合物元件，bxd公司和Mcp公司，因为它们具有赋予细胞记忆的能力。
这个bxd公司元件位于超双胸基因，以及bxd公司突变改变了副节段5和6中UBX蛋白的表达水平，在随后的更后面的副节段中影响较小(17). 这个Mcp公司元素位于iab4号机组和iab5号机组. TheMcp公司1删除(19)外显表达阿卜杜勒-B第9段(10)，导致获得功能表型，这意味着腹部节段A4转化为A5。两者都有bxd公司和Mcp公司被基因鉴定为PRE(5,6,18,28,29)染色质免疫沉淀分析也显示Polycomb蛋白结合力强(36)在两个顺式-动作序列。
确定是否bxd公司和Mcp公司这些元素能够促进细胞记忆，如图所示，建立了携带构建物的转基因飞行线路。七种独立的转基因bxd公司将PRE插入近轴方向的分离株以不同的方式表达了记者的观点。11个中有6个bxd公司PRE方向相反的线表现出配对敏感沉默。如果是Mcp公司对于两个方向的转基因，分析了五个独立的株系，对于每个方向，两个株系表现出配对敏感沉默。当PcG突变体与这些品系杂交时（数据未显示），两个报告者均获得了同源去表达，验证了测试元素的PcG依赖性。
为了解决以下问题：bxd公司和Mcp公司具有CMM功能，GAL4被表达为激活lacZ公司通过诱导增强子UAS(4). 在胚胎发生过程中GAL4诱导后，lacZ公司在所有bxd公司和Mcp公司受试品系在抑制条件下表现出配对敏感沉默。热冲击时bxd公司将胚胎移植回18°C并允许其发育至成年，90%以上的后代表现出部分或同质的迷你型-白色眼睛中的减压（图。和B）。其他的bxd公司检测的线显示mini的激活类似或较弱-白色基因。此外，CMM转换为激活模式与PRE对增强子的定向无关。
类似地Mcp公司被测品系也能通过有丝分裂遗传活性表观染色质状态。在胚胎发生过程中GAL4诱导后，在几个不同的品系中，mini-白色在眼睛中观察到该基因（图。和D）开发完成后。值得注意的是Mcp公司CMM从沉默到活化的染色质状态导致了杂色而非同质的模式；33%的GAL4脉冲Mcp公司-4.1线在眼睛中显示出明显的去压迫，其余显示出mini的部分表达-白色基因。超过60%的未经治疗的对照兄弟姐妹只出现小斑块。其余40%的人表达略有增加。
沉默能力Mcp公司具有强烈的温度依赖性。正如其他依赖PcG的表型所观察到的那样，沉默在较低温度下减少，并且可以通过在28°C下繁殖一代来恢复。总之，这些结果表明，PRE由TRE侧翼，通常作为CMM发挥作用，从而充当可切换的染色体元件，“冻结”表观遗传诱导的转录状态，并在有丝分裂期间继承沉默或激活模式。
的近端部分工厂7对活化和表观遗传维护很重要。
这个制造7元素被证明负责阿卜杜勒-B副片段11和12中的基因(14). 遗传和转基因分析表明工厂7表达两个可分为两个区域的主要功能：一个足以阻断副片段特异性增强子的最小片段，称为工厂7边界和相邻的PcG相关消声器iab7号机组预处理(15,26). 尽管对工厂7元素，它的状态如何控制活性染色质，而活性染色质可以通过有丝分裂以副片段特异的方式遗传。为了更好地理解CMM的功能，我们使用我们的转基因检测系统分别分析边界和PRE序列或仅分析PRE序列（图。).
许多纯合子系是从具有原始基因的缩短版本的结构中获得的工厂7碎片显示出杂色的眼睛颜色，这是配对敏感的沉默。测试这些是否修剪工厂7元素也可以转换为可遗传的开放染色质状态，hsp70-GAL4驱动因子稳定地杂交到染色体中。对胚胎进行热休克和分析lacZ公司表达，并对成年人进行mini分析-白色表达式。回忆起眼睛里的强烈压抑lacZ公司GAL4激活的胚胎中的模式是杂色的，并且频率低于携带全长的品系工厂7在一些品系中，大多数表现为杂色染色，而不是均匀染色。也，lacZ公司非热休克胚胎中的表达几乎完全被抑制，表明与全长结构的品系相比，沉默更强，在全长结构中观察到了斑片状表达的背景。
当我们分析来自热休克胚胎的成年人时工厂7亚片段，我们发现由于mini，没有一个品系表现出红眼表型-白色表达（测试每个结构的两到四行）。GAL4脉冲苍蝇与持续保持在18°C的对照苍蝇无法区分。因此，无论是PRE本身还是与PRE结合的边界都不足以传递活动CMM状态的表观遗传。所有这些转基因苍蝇的共同特征是缺少全长的近端部分工厂7因此，CMM活动生成激活的CMM状态似乎需要此特定序列。
转录激活的CMM。
我们测试的所有CMM均位于烟蚜复合体的基因间区域。非编码转录本被映射到其中一些区域。当母体和分段基因启动同源基因表达与PcG/trxG控制的维持阶段之间发生转换时，这些基因表达。我们想知道CMM转换为活动与转录本的出现之间是否存在相关性。首先，我们测试了转基因CMM系的染色体元件转录bxd公司,Mcp公司、和工厂7如果这些含CMM的序列确实在GAL4激活时转录，我们将能够将这些RNA与新的生物功能联系起来。
为了验证这个假设，我们对携带工厂7,MCP公司，或BXD公司转基因。对胚胎进行热休克以诱导GAL4脉冲，并按上述方法处理。每个转基因记忆元件都用与相应全长CMM相对应的链特异性地高辛标记RNA进行探测。事实上，与未激活的对照胚胎相比，GAL4脉冲激活胚胎通过CMM显示转录。图显示了能够转换CMM状态的转基因系中的诱导转录物。这些RNA的转录从片状到同质表达模式不同。每个测试品系的记忆元件在其近端-远端方向上转录，与转基因上的CMM插入无关。非热休克对照兄弟姐妹偶尔以较弱的方式显示这些转录本，类似于lacZ公司背景表达。因此，有一个新的转录物依赖于给予这些胚胎的GAL4脉冲。
CMM是在胚胎发生过程中普遍存在的GAL4表达的基础上转录的：携带bxd公司,Mcp公司，或工厂7构造。股特异性探针检测到与烟蒂复合体相关的近端（d，远端；p，近端）方向的转录物。转录本大多以同质方式表达。在一些行中，沉默并没有完全消除，并且观察到了杂色的表达模式（参见Mcp公司线路）。在没有GAL4的情况下，可以观察到最小的背景表达。单链RNA。
这个工厂7通过缝隙印迹分析，转录物也显示依赖于初始GAL4脉冲。的表达式工厂7增加了2到3倍（图。). 一个相当令人惊讶的观察结果是工厂7CMM RNA仅在缝隙印迹中的聚腺苷酸分子富集后检测到，而在总RNA提取物中未检测到。通过Northern blot和引物延伸分析对这些RNA进行更详细的广泛分析，并没有得出关于启动子位置的令人信服的结果。自从我们检测到工厂7通过原位杂交或狭缝印迹分析仅在富含多聚腺苷酸的RNA样本中进行RNA，我们推断这些转录物一定非常罕见。
热休克（hs）诱导FLW-1的CMM/工厂71与非热休克对照组相比，其转录量增加了两到三倍。地高辛标记的3.6-kb工厂7将RNA探针（远端-近端[d-p]定向）与不同品系的5μg聚腺苷化RNA的狭缝印迹杂交。内源性工厂7该位点在野生型（wt）中转录较弱。其他控制包括10 ng的体外转录工厂7RNA。
如图所示，仅携带边界/PRE或PRE亚片段的转基因系不能传递表观遗传开放染色质状态。如果通过这些序列的转录对于激活CMM至关重要，那么GAL4脉冲不应导致截短的转基因株系中此类RNA的表达。事实上，在GAL4表达后，我们无法通过原位杂交检测来自转基因CMM的RNA（数据未显示）。这再次证明了制造7激活CMM。更重要的是，它还支持转录参与将沉默CMM转换为激活状态的想法。
原位杂交数据和slot-blot分析显示，GAL4脉冲后，我们的转基因检测系统中CMM依赖的转录物增加。GAL4必须激活一个隐蔽的启动子，从而通过CMM合成转录物。由于这些转录本出现在CMM被切换的同一时间点，因此在缺少近端部分的飞行线路中无法检测到工厂-7我们推断，转换CMM可能需要这种转录。
CMM是以部分特定的方式转录的。
如果这些非编码RNA在调控副片段基因表达中发挥作用，人们会期望它们以相应的时间和空间模式转录。为了研究这些表达模式，我们用链特异性RNA探针进行了原位杂交实验，该探针用于检测含有bxd公司,Mcp公司，或工厂7区域（图。).
的转录模式顺式烟叶复合体中的调控基因间序列。用1到12小时的胚胎进行RNA原位杂交。顺式调控序列用红色条标记。根据最常见剪接形式的同源基因用黑色表示，原位杂交探针用蓝色表示。上面的画面显示的是囊胚阶段的胚胎，而下面的画面则描绘的是围绕生殖带延伸的胚胎。所示的所有转录物都是由染色体特异性探针检测到的近端到远端方向。如探针D1E1所示，转录物在胚胎发生过程中保持不变或出现在后期。CMMs的前表达域与基因间顺式调控序列沿烟蒂复合体的近远轴以线性模式转录。探针D1E1检测最后面的副段14中的转录物，尽管只有在生殖带收缩后。工厂7与第12～14段转录物杂交；Mcp公司第10至14段；iab4号机组第8至14段；和bxd公司PRE至第6至12段。
将野生型胚胎与bxd公司探针显示，在囊胚早期，卵子长度的50%到25%之间有一个表达模式。随着不断的发展，这个单一的条纹被细分为七个不同的条纹，这些条纹可以与副段6至12相连（图。). 这也反映了超双胸由bxd公司单位。
使用Mcp公司RNA探针用于杂交，在囊胚期观察到三条明显的条纹（图。). 在第10至14子段的胚胎发育过程中，这些基因一直保持不变。因为第9段通过异位转化为第10段阿卜杜勒-B中的表达式Mcp公司缺失，用Mcp公司探针与阿卜杜勒-B抄本。这里，最前面标记的副节段染色是预期促进的阿卜杜勒-B副片段10中的转录。
在工厂7原位杂交实验中，在囊胚后端的一条单一条纹中检测到RNA，随后发现它在副节段12~14中细分（图。). 类似bxd公司和Mcp公司,工厂7也转录于预期开放染色质形成的区域，以促进阿卜杜勒-B表达式。使用探针检测iab4号机组区域，我们获得了与Cumberledge等人相同的结果(12)他还发现了副片段8至14的转录（图。). 此外，他们还鉴定了两个非编码的多聚腺苷化RNA，它们来源于iab4号机组监管区域。最后，一个设计在阿卜杜勒-B5′末端检测到的转录在最后面的副节段（图。).
因此，这些调控因子在烟熏复合物簇中的共线排列也反映在非编码RNA的副片段特异性表达模式中，这些非编码RNA转录方向与同源异型基因相同。有趣的是，在所有涉及的染色体区域中，在实际由CMM控制的副片段中检测到最低的转录水平。接下来，更多的后副节段，RNA的数量增加。
接下来，我们想知道删除CMM时是否也存在非编码RNA。这个工厂71删除(14)删除包含工厂7边界和PRE。这导致成年苍蝇的腹部节段6（A6）转化为A7的拷贝。原位杂交探针检测缺失近端或远端的RNA，发现转录物与野生型相似（图。)，这表明生成该转录本的启动子位于更远的地方(39). 这个实验还表明工厂7不包含顺式-激活基因间转录所必需的作用元件。删除顺式-在工厂71然而，突变体消除了PcG沉默，从而避免了通过基因间转录物重塑沉默的染色质的需要。总之，这些结果通过调控染色体元件及其相应的副片段将这些非编码RNA的时间和空间表达联系起来。
上游和下游区域工厂71删除被转录。工厂71将胚胎与侧翼的1-kb探针原位杂交工厂71删除。远端（d）和近端（p）探针产生了与3.6-kb探针相同的染色模式工厂7元素。探针在第12段至第14段中杂交。
讨论
通过这项工作，我们表明除了工厂7元素、两个其他含PRE的双胸苷复合物元素，bxd公司和Mcp公司，描述CMM功能。因此，这些元件不仅是通过其结合的PcG沉默蛋白维持同源异型基因的抑制状态所必需的，而且也是维持活性表达状态所必需的。事实上，CMM的概念似乎普遍用于表达状态需要遗传保持的其他发育调节因子。CMM也在刺猬用于图像盘图案化的基因(第24页). CMM感知模式化系统做出的决定，并“冻结”目标基因的沉默或激活表达状态。在这里，我们表明通过CMM的转录与CMM的有丝分裂遗传激活模式有关。
我们发现，幼虫GAL4脉冲与胚胎脉冲不同，不能切换工厂7CMM达到有丝分裂遗传状态(7). 而幼虫GAL4脉冲确实可以缓解沉默并激活报告者lacZ公司在去除GAL4后lacZ公司将恢复到基本水平。这表明，在胚胎发生过程中，会发生特定的事件，导致有丝分裂稳定的CMM激活状态。在修剪原始3.6-kb的过程中工厂7对于我们认为由边界和PRE组成的核心元素CMM，我们意识到缩短的结构缺乏CMM功能，同时保留了沉默功能（图。). 令人惊讶的是，我们发现全尺寸工厂7片段在GAL4激活时产生转录物，而较短的非激活片段缺少该转录物。
我们建议工厂7元件包含一个位于CMM近端的隐秘启动子。这也得到了携带工厂7碎片方向相反。这些具有可激活的CMM功能，并从片段的近端部分产生转录物。因此，GAL4激活的隐秘启动子在我们的转基因中的偶然结合导致我们通过CMM发现了一个转录物，该转录物能够产生有丝分裂稳定的激活CMM状态。
我们转基因构建物上CMM编码的胚胎转录物的鉴定表明，可能的机制是激活烟壶复合体中的记忆元件。在这一点上，有趣的是观察到，在烟酸复合体中，许多基因间转录物通过已知的CMM。事实上，我们发现这些转录物恰好在相应的CMM需要被副片段特异性激活时表达。观察到的特定空间分布进一步支持了这些RNA的非随机功能作用的观点。
非编码的基因间转录本已经在bithorax复合体中被鉴定(17,22,34). 然而，它们的功能作用仍不清楚。在那些有cDNA可用的情况下，没有观察到明显的编码能力，这表明其作用不同于信使核糖核酸(12,20). 有趣的是，即使假定的CMM位于转录单元（大约/大约中的元素超双胸转录单位），发现了一种早期的、短暂的转录物(16). 因此，产生基因间烟蚜复合物RNA的转录过程具有作为CMM转换机制所必需的所有特征。
可以说，这些早期基因间转录物的出现是相对开放的胚胎染色质状态允许虚假转录的副产品。然而，位于烟嘴复合体内或附近的其他基因在发育的这个时候并没有被激活(24)他反对通过“松散的”染色质结构来解除全球管制。此外，基因间转录物与编码RNA转录物的同源蛋白质受到同样严格的时间和空间调控。有趣的是，在霍加和卡奇以及本德和菲茨杰拉德的平行工作中(3,16)发现内源性烟熏复合物中的异位转录干扰PcG沉默的建立。他们的工作确定了在烟熏复合物中插入P元素或转基因产生长转录物的特定突变苍蝇系。他们证明异位转录通过iab顺式双腔复合体的调节元件导致同源异型表型，这让人想起空间失调的CMM功能。
胚胎CMM转换的相关分子机制是什么？我们认为，生成成绩单的机器对转换至关重要。可以设想，RNA聚合酶II复合物通过默认沉默的CMM时，会置换相应的抑制性PcG蛋白，从而干扰CMM处PcG沉默复合物的建立或主动移除默认设置的沉默复合物（图。). 由于激活的CMM是有丝分裂遗传的，因此在转录过程中可能会放置额外的表观遗传标记。因此，RNA聚合酶II复合物可能“背负”酶重塑复合物，后者通过组蛋白修饰设置表观遗传标记(38). 事实上，H4的超乙酰化在工厂7坐标测量机(8).
CMM的转录重塑。最初，间隙和分割基因建立了同源基因的表达模式。随后，CMM需要通过区分转录活性染色质和沉默染色质，在整个发育过程中保持预设的同源基因表达模式。通过CMM的转录将元素从静默状态切换到激活状态。我们可以设想两种可能的功能，而不是相互排斥的，来实现这个可遗传的开关。在模型A中，RNA聚合酶（Pol）II复合物通过基因间区域的CMM，取代抑制复合物。因此，染色质可用于进一步的表观遗传修饰。在模型B中，RNA聚合酶II“背驮”重塑复合体，其表观遗传学标记组蛋白。这些修饰在整个发育过程中持续稳定，并继承开放的染色质构象（卵圆形、核小体、半圆、沉默复合物、Mod、组蛋白的表观遗传修饰，如组蛋白乙酰转移酶[HAT]、组蛋白去乙酰化酶[HDAC]或甲基转移酶[MT]）。
基因簇的转录调控受染色质状态控制的另一个系统是β-珠蛋白基因座。它的染色质结构和遗传排列与烟熏复合物相当。β-珠蛋白基因座包含五个线性排列的基因。然而，在发育的每个时间点，只有一个基因被转录。有趣的是，携带转基因人类β-珠蛋白基因座的小鼠显示出与β-珠蛋白基因转录方向相同的基因间转录物。它们位于活性基因附近，长度可达30kb，与染色质重塑和活性结构域的维持有关(2,32). 在转基因中，发现β-珠蛋白基因座控制区的增强子和5′超敏位点HS2被转录。转录本起源于增强子内部，并继续延伸至连接的基因，而与增强子的位置和方向无关(20). 由于非信使核糖核酸转录始于转基因，这表明基因间转录是活性基因座的一个普遍特征。
在烟熏复合物中发现功能性基因间转录物可能会对另一个与同源盒基因（HOX）簇有关的难题，即共线性现象，提供新的见解(21,25). HOX簇中基因在5′-3′方向的排列反映了它们在发育中生物体的前后轴上的顺序表达模式。这种共线性在进化过程中保持不变，表明存在潜在的功能相关性。调控模块通过转录物相互连接的发现将证明需要沿着染色体维持序列顺序。转录过程的极性会以有序和连续的方式切换CMM。这可能是维持调控元件及其靶基因有序排列的潜在力量。在中时黑腹果蝇在其他HOX复合物中，以5′-3′方向表达的长程转录物可能在一个过程中完成这种顺序开放。因此，观察其他生物体的HOX簇中是否存在具有相关CMM开关功能的基因间转录物将是一件有趣的事情。
