重组新城疫病毒载体对呼吸道合胞病毒的保护作用

RSV滴度。

在攻击后5天和8天实施安乐死的小鼠的肺部被快速冷冻并储存在−80°C下，直到检测病毒滴度。在用1 ml磷酸盐缓冲盐水均质后，将样品用于小鼠STAT1的斑块分析^−/−成纤维细胞单层(15). 标题表示为日志₁₀每克肺组织的PFU。

产生抗RSV的单克隆抗体。

RSV A2株在HEp-2细胞中生长，并按照前面所述进行纯化(52). 每只小鼠用50微克纯化RSV腹腔接种BALB/c小鼠。融合前三天，向小鼠静脉注射25μg纯化RSV。第一次接种后三周，对一只小鼠实施安乐死，并使用脾细胞进行融合以产生单克隆抗体。杂交瘤的首次筛选是通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行的，使用未感染或感染RSV的HEp-2细胞的裂解物。随后通过模拟和RSV感染细胞的免疫染色筛选杂交瘤克隆。获得了8株RSV F蛋白特异性单克隆抗体（9B1、9E4、18B6、18D5、22A4、22G6、34H5和75D1），并通过免疫染色和免疫荧光进行了表征（数据未显示）。使用F特异性单克隆抗体47F、22A4和22G6来表征表达RSV F糖蛋白的NDV病毒。

表达RSV F糖蛋白的重组NDV的构建、拯救和生长。

通过PCR从LF1质粒中扩增RSV长株F糖蛋白的开放阅读框（ORF），并在NDV Hitchner B1 cDNA的P和M基因之间进行克隆（图。​（图1A）1安培) (44). 引物NDV-RSVF 5′/XbaI（5′-CGCGTCTAGA公司塔加AAAAAT型ACGGGTAGAA公司CCGCCACCATGGAGTGCCAATCCTAGCAAAAAT-3′），包含XbaI位点（下划线）、NDV基因停止（粗体）、基因间区域、转录起始（斜体）和Kozak序列（CCGCCACC），以及引物NDV-RSVF 3′/NheI（5′-CGCGGCTAGC公司GTTA公司TTAGTTACTAAAATGCAATATTTAT-3′）包含一个NheI限制位点（下划线）和四个额外的核苷酸（加粗），以符合六规则，用于PCR扩增LF1质粒的F ORF。如别处所述，病毒是从cDNA中拯救出来的(44)，并且通过逆转录PCR（RT-PCR）和免疫荧光证实插入的ORF存在于病毒基因组中。NDV-F病毒在10天龄的鸡胚中生长。使用NDV多克隆抗体通过免疫荧光测定病毒滴度。

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图1。

在NDV cDNA的P和M基因之间克隆编码RSV F蛋白的ORF，以创建NDV F疫苗构建物（A）。从cDNA中拯救出重组病毒后，通过RT-PCR（B和C）确认ORF的正确插入。

免疫荧光分析。

将融合的Vero细胞单层感染WT-NDV和NDV-F。吸附1h后，去除病毒并将细胞培养在10%DMEM中。感染RSV A2的Vero细胞作为阳性对照。感染后48小时，细胞固定在2.5%多聚甲醛中，用0.1%Triton X-100渗透，并用单克隆抗体22A4和22G6（RSV-F特异性）孵育。用兔抗NDV多克隆抗体（1:100）作为NDV感染的对照。然后将受感染的细胞与第二抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）偶联抗体（1:100）或抗兔FITC抗体（1:100）孵育，并在20倍放大的荧光显微镜下观察。使用J.a.Melero赠送的RSV-F特异性单克隆抗体47F作为免疫荧光阳性对照。抗NDV-HN糖蛋白（7B1）的单克隆抗体由西奈山医学院杂交瘤设施产生。

免疫和挑战。

从哈兰（印第安纳波利斯）购买3至4周龄的WT BALB/c小鼠。国际食品与天然气协会^−/−老鼠(43)在哥伦布儿童研究所（Columbus Children’s Research Institute）的特定无障碍设施中，进行了九代BALB/c背景的回交。小鼠经鼻（i.n.）接种5×10⁵在光麻醉（Avertin；Sigma-Aldrich）下，在50μl NDV-WT、NDV-F或RSV中加入PFU。模拟免疫组注射尿囊液。免疫四周后，用10⁷50μl的PFU RSV。在激发后5天和8天处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（BAL）、肺组织和脾细胞。所有涉及小鼠的程序均按照联邦和机构指南进行。

肺组织病理学。

采集用于显微镜检查的肺部在收获时用10%福尔马林充气，固定在福尔马林中，然后进行石蜡包埋处理。用苏木精和伊红染色或去石蜡切片进行免疫组织化学染色。载玻片用3%过氧化氢处理15分钟，并在室温下用Superblock（ScyTek）封闭5分钟。使用山羊抗RSV血清（1:500稀释）进行免疫组化，然后使用生物素化抗山羊免疫球蛋白G（ScyTek）。在Optimax洗涤缓冲液（BioGenex）中浸泡10分钟后，在室温下用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（ScyTek）处理20分钟。氨基乙基咔唑（ScyTek）底物添加后观察到红色反应，苏木精用作副染色。使用蔡司AxioCam HRc和AxioVision软件拍摄图像。

巴尔。

一氧化碳对小鼠实施安乐死₂吸入。气管插管，肺部用1毫升磷酸盐缓冲盐水清洗。将单个动物的洗液离心，上清液储存在−80°C。重新悬浮BAL颗粒，并根据台盼蓝排除法记录细胞总数。BAL细胞的胞浆用Wright Giemsa染色，并用于测定不同的细胞计数。

干扰素-α/β生物测定。

将每只小鼠的一个肺匀浆于1 ml无血清DMEM中，并通过离心进行澄清。将肺部样本酸化至pH值2，以灭活任何输入病毒以及其他细胞因子。然后用碳酸氢钠中和样品，并将每种样品的两倍稀释液添加到96 well板中的小鼠成纤维细胞单层中。37°C，1.25×10培养过夜⁵将水疱性口炎病毒（VSV）的PFU添加到每个孔中。同时使用干扰素-α/β标准物生成标准曲线（Access Biomedical）。其他对照组包括未经治疗的有或无VSV感染的单层细胞。培养2天后，用2%甲醛固定微孔，并用结晶紫染色。通过比较VSV诱导的细胞杀伤与已知量IFN-α/β的保护作用，测定测试样品IFN-α／β的浓度。

记忆性脾细胞的体外刺激。

用模拟、NDV-WT、NDV-F或RSV免疫小鼠，然后用RSV攻击小鼠，在攻击后8天采集脾细胞。在RPMI 1640中培养每组五只小鼠的脾细胞，加入5%胎牛血清和5%大鼠T-STIM（协作生物医学产品，马萨诸塞州贝德福德），并加入H-2K型^d日-限制性肽（10μg/ml）1周。RSV F蛋白的主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类限制性肽KYKNAVTEL_85-93年)由Research Genetics，Inc.（Invitrogen）合成(9). 第7天，收集每个治疗组的细胞培养上清液，然后使用肽脉冲γ射线照射的幼稚野生型BALB/c小鼠脾细胞用肽重新刺激细胞6小时。在TRIzol（马里兰州Rockville，Life Technologies）中对受刺激的细胞进行裂解，并根据制造商的说明，使用RiboQuant mck1多探针（BD Pharmingen）通过RNase保护检测10至20μg RNA的细胞因子转录物。使用Storm Phosphor Imager（分子动力学）和ImageQuant软件进行定量。将每个样品中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）信号强度的值归一化后，将数据绘制成图表。

ELISA和ELISPOT分析。

根据每个试剂盒中的说明，通过ELISA（Becton-Dickinson）对BAL、淋巴细胞培养上清液和肺匀浆上清液进行IFN-γ蛋白测试。使用从U-CYTECH（荷兰乌得勒支）购买的试剂盒进行IFN-γELISPOTS

树突状细胞研究。

DC研究使用来自BALB/c WT或IFNAR BM的培养物进行^−/−老鼠。BM细胞在RPMI中清洗并在2×10的条件下进行电镀⁶根据Gilliet等人的方法，在含有10%胎牛血清和20ng/ml鼠GM-CSF（R&D）或100ng/ml人Flt-3L（Peprotech）的RPMI中培养细胞/10cm板(19). 该方案常规提供>90%的CD11c纯人群⁺DC在细胞因子和（80至85%）CD11c混合物中培养8天后⁺CD11b型⁺B220型⁻mDC和（15至20%）CD11c⁺CD11b型⁻B220型⁺在Flt-3L中培养8天后的pDC。以5-10倍的感染率感染细胞，并在48小时后收集细胞进行分析。用藻红蛋白（PE）标记的CD11c生物素化抗体、PE结合的链霉亲和素以及FITC-标记的CD40、CD80、CD86和MHC II类抗体对DC进行染色。所有抗体均购自eBioscience。使用FACSCalibur流式细胞仪（Becton-Dickinson）和FlowJo软件分析染色细胞。

NDV-F是比RSV更有效的IFN-α/β诱导剂。

NDV被选为病毒载体，因为它能够诱导强烈的IFN-α/β反应(2,6). 众所周知，IFN-α/β通过MHC I类途径增强抗原提呈(30,37,53,57)，我们预测RSV蛋白如果在更强的IFN-α/β诱导的背景下表达，将具有更强的免疫原性。为了测量我们构建的嵌合病毒的IFN诱导能力，我们使用NDV-F和RSV（A2株）经静脉感染BALB/c小鼠，并用5×10⁵每个PFU。尽管NDV-F-和RSV-接种小鼠在BAL液中测得的IFN-α/β诱导动力学相似，但在感染后的不同时间点，NDV-F中IFN-反应的幅度是RSV-治疗动物的1000倍（图。​（图3）。三). 在相同时间点比较NDV-WT-、NDV-F-和RSV治疗小鼠肺匀浆中的IFN-α/β生物活性水平时，也获得了类似的结果（数据未显示）。到48小时，所有样本中的干扰素水平都降低了，但NDV-F诱导的应答持续了更长的时间（图。​（图3）。三). 对照组在鼻腔滴注尿囊液后9、24或48小时缺乏任何可检测的IFN-α/β反应。

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图3。

NDV-F是体内IFN-α/β的有效诱导剂。对BAL上清液进行IFN-α/β生物测定，以确定鼻内接种NDV-F或RSV后9、24和48小时的诱导水平。尿囊液作为阴性对照。星号表示具有统计显著性(P（P）<0.05）NDV-F-和RSV-治疗动物之间的差异。

NDV-F免疫可防止RSV攻击，但不会增强病理学。

为了确定NDV-F粘膜免疫是否具有保护作用，10只BALB/c小鼠的队列被模拟感染或用5×10⁵重组NDV-WT或NDV-F的PFU对照组接受等量尿囊液。启动四周后，免疫动物被10⁷在挑战后第5天，当RSV复制达到或接近峰值时，RSV的PFU也在静脉注射(24)对每组5只免疫小鼠的肺进行病毒滴度测定。模拟免疫小鼠的病毒载量约为10⁵每克肺组织的PFU，与用野生型NDV免疫的小鼠检测到的水平相似（图。​（图4）。4). 相比之下，用NDV-F免疫的小鼠在三次实验中始终显示RSV肺滴度下降了10倍（图。​（图4）。4). 通过对每个实验组动物的肺切片中的RSV抗原进行免疫组织化学染色，可以更好地了解NDV-F免疫接种后病毒滴度下降1 log的意义。该研究如图所示。​图55在使用低功率10倍物镜（×100倍放大）拍摄的显微照片中。模拟免疫小鼠的肺（图。​（图5B）5亿)在RSV攻击后第5天显示出弥漫性RSV特异性免疫染色，在肺泡腔内的肺细胞中最亮。在NDV-F引物小鼠的肺部也检测到RSV抗原（图。​（图5D），第五天)但在这些动物中，染色非常集中，约为模拟免疫对照组的10%。用NDV-WT启动的动物与模拟感染的对照组相似，没有图片显示。激发后第8天，在任何动物中都无法检测到病毒抗原。

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图4。

NDV-F处理的小鼠受到RSV攻击的保护。模拟免疫或NDV载体或NDV-F、WT（A）和IFNAR免疫后四周^−/−（B） 用10只小鼠进行攻击⁷5天后通过斑块试验测定RSV A2的PFU和肺病毒滴度。星号表示对照免疫小鼠（模拟和NDV）和NDV-F治疗小鼠之间的显著差异(P（P）=0.05（对于WT小鼠）；P（P）IFNAR=0.025^−/−老鼠）。在另外两个实验中复制了面板A中的数据。

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图5：。

免疫小鼠肺实质RSV感染减少10倍。肺组织显微镜检查显示NDV-F免疫动物中RSV感染程度显著降低。用苏木精和伊红（A和C）或多克隆抗呼吸道合胞病毒兔血清（B和D）对模拟感染（A和B）或新冠病毒F引发（C和D）小鼠的肺切片进行染色。RSV抗原阳性的细胞呈红色。

在取自相同组织块的相应苏木精-伊红染色切片中（图。5A和C)，两组间炎症严重程度无显著差异。除了显微镜检查外，还使用来自类似处理小鼠的BAL标本对激发后所见炎症细胞的数量和类型进行定量评估。模拟和NDV-F引物小鼠的细胞计数与RSV继发感染的动物相似（数据未显示）。在挑战后第8天，这些组之间的差异细胞计数也相似（数据未显示）。在模拟、NDV-WT和NDV-F免疫动物中，浸润物主要由分布在气道和血管周围的淋巴细胞和巨噬细胞组成。因此，NDV-F免疫的动物在RSV攻击后不易发生增强的免疫病理学变化，只会遭受相对轻微的淋巴细胞炎症，这是RSV原发感染的典型症状

NDV-F推广CD8⁺T细胞激活。

观察到NDV-F启动可保护动物免受RSV攻击，我们想知道免疫动物启动了哪种类型的免疫。攻击后第8天，在任何组的血清中均未检测到中和抗体（数据未显示），因此我们有兴趣了解RSV特异性CD4⁺和/或CD8⁺在免疫动物中可以发现T细胞反应，这些反应与之前感染RSV的小鼠有何不同⁵NDV-WT、NDV-F或RSV的PFU。我们观察到，与模拟免疫、载体免疫或之前RSV感染的动物相比，NDV-F免疫小鼠在病毒攻击后4天的肺部IFN-γ水平增加了四倍（图。​（图6A）。6A级). 此时，先前RSV感染小鼠的肺IFN-γ水平与模拟或NDV免疫对照组的肺IFN-γ水平没有显著差异。

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图6。

NDV-F诱导CD8增强⁺T细胞反应无Th2细胞因子分泌增强。新冠病毒F免疫小鼠对呼吸道合胞病毒攻击产生的IFN-γ显著高于先前感染呼吸道合胞病毒的小鼠。通过ELISA测定呼吸道合胞病毒攻击后4天肺匀浆中的IFN-γ水平。（A） 一个重要的(P（P）与所有其他治疗组相比，NDV-F免疫小鼠中观察到增加。在模拟感染的、NDV-WT引发的、NDV-F引发的或RSV免疫小鼠的RSV攻击后8天收获的脾细胞中发现了类似的结果。（B） 用MHC类I限制性F在体外刺激细胞_85-93年收集肽和第7天淋巴细胞培养上清液并用ELISA进行分析。再次，NDV-F免疫小鼠的细胞产生IFN-γ增加。未感染的培养物是指直接从未经免疫或激发的小鼠中提取的脾细胞。（C） 不同免疫动物对病毒F蛋白的细胞因子反应的比较。RSV攻击8天后，采集脾细胞并用肽培养，如上所述。通过分析归一化为GAPDH mRNA水平的核糖核酸酶保护试验数据，比较每个培养物中IFN-γ和IL-13转录物的相对丰度；灰色条，IL-13。（D） 相关ELISPOT数据。在本实验中，每个队列的脾细胞在活病毒攻击后第8天合并并直接进行分析。

作为RSV免疫力的一种更为特异的测量方法，我们观察能否在NDV-F免疫小鼠的脾脏中检测到识别已知免疫显性RSV F蛋白表位的记忆性T细胞。将RSV攻击后8天处死的小鼠脾细胞用于每个实验组(n个=5）并用MHC I类限制F刺激_85-93年肽（KYKNAVTEL）(9)体外试验。与肺匀浆一样，肽刺激后培养基中测得的IFN-γ水平在NDV-F免疫小鼠的T细胞培养物中是其他免疫组培养物的六倍（图。​（图6B）。6亿). 肽刺激淋巴细胞产生的细胞因子转录物的核糖核酸酶保护试验显示，在NDV-F免疫小鼠产生白细胞介素-13（IL-13）的同时，IFN-γ转录物也有类似（四倍）的增加（图。​（图6C）。6摄氏度). IL-13被选为Th2细胞因子产生的指标，因为之前在STAT1中发现该细胞因子在RSV感染后占主导地位^−/−缺乏产生Th1反应能力的小鼠(33). 正如在挑战后4天采集的肺样本中观察到的那样，与模拟免疫动物的培养物相比，以前感染RSV的小鼠脾细胞产生IFN-γ的能力没有显著增强。使用相同的F进行IFN-γELISPOT_85-93年肽，也表明NDV-F-与RSV-激发的动物相比，记忆性T细胞的数量增加了两倍（图。​（图6D）。第6天). 因此，NDV-F似乎能够刺激RSV F蛋白特异性CD8⁺T细胞介导的对挑战的反应比以前RSV感染引起的反应更强烈。

我们最初预测NDV-F的作用取决于NDV载体产生的IFN-α/β，为了验证这一假设，我们使用缺乏IFN-α／β受体的BALB/c小鼠重复了这些研究(43). 与对照组相比，NDV-F引物动物感染的肺匀浆的病毒滴度降低了10倍（图。​（图4B），4B类)和RSV F蛋白特异性CD8的数量⁺与对照组相比，野生型和IFNAR中的T细胞显示出相同的增加^−/−动物（图。​（图77).

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图7。

NDV-F成功免疫WT和IFNAR^−/−老鼠。产生IFN-γ的CD8的数量⁺激发和激发野生型（黑条）和IFNAR后，用ELISPOT检测T细胞^−/−（灰色条）BALB/c小鼠。对4-5只动物进行模拟引物或感染NDV-F，然后在RSV攻击后第36天即第8天处死。将各组小鼠的脾（A）和肺（B）淋巴细胞分离、结合，并与F淋巴细胞混合_85-93年肽，并直接镀在抗体涂层板上。在两种基因型的小鼠中，NDV-F免疫组与模拟免疫组相比，反应增加了约10倍。

我们感谢理查德·卡达根提供了出色的技术援助。我们还感谢JoséMelero为我们提供LF1质粒和47F单克隆抗体。抗新冠病毒HN的单克隆抗体由西奈山医学院的杂交瘤共享研究机构产生。

这项工作得到了国家卫生研究院对A.G.-S、E.F.和J.E.D.的拨款支持。