利用核衣壳蛋白VP30从cDNA中拯救重组马尔堡病毒

摘要

丝状病毒马尔堡病毒（MARV）和埃博拉病毒（EBOV）在人类和非人类灵长类动物中引起严重的出血热，死亡率极高。1967年首次分离出MARV，当时德国和南斯拉夫处理从乌干达进口的感染MARV的非洲绿猴的31名实验室工作人员患病。尽管进行了积极的支持性治疗，但7名患者死亡(14,23). 迄今为止最大的MARV疫情发生在2004年至2005年的安哥拉，当时有252人受到感染。此次疫情的病死率为91%。

MARV的非片段负义RNA基因组长度为19111个碱基，编码7种蛋白质(9). 其中四种蛋白质（NP、VP35、L和VP30）构成核衣壳复合体(1). NP、VP35和L足以介导MARV特异性小基因组系统中的病毒转录和复制，而核衣壳复合物的第四组分VP30则充当EBOV的转录激活剂(17,18,28). 因此，VP30在MARV VP30生命周期中的作用尚未确定。据报道，MARV VP30与NP衍生包涵体相互作用，表明VP30可能参与核衣壳成熟(16). MARV感染细胞中基于RNA干扰的VP30下调导致所有病毒蛋白显著减少，表明VP30在病毒复制和/或转录中发挥重要作用(10). EBOV VP30包含Cys_三-His基序包含氨基酸68至95，其被证明与锌离子结合。锌结合基序的完整性对于作为转录激活物的功能至关重要，但对于与NP衍生包涵体的相互作用则不重要。序列比较表明，该基序也存在于MARV VP30中（氨基酸74至99）(15). 其他唯一具有第四个核衣壳蛋白的非片段负链RNA病毒是肺炎球菌病毒。对于人类呼吸道合胞病毒，研究表明M2-1蛋白在转录过程中起着延长和抗终止因子的作用(6,8,13). 有趣的是，M2-1包含一个锌指基序，类似于VP30中发现的基序，该基序被证明对蛋白质的功能至关重要(12).

为了研究丝状病毒复制和转录方面的问题，在不进行生物安全4级控制的情况下，为MARV和EBOV建立了微基因组系统(2,11,17,18). 然而，为了在真实的环境中调查病毒生命周期的所有方面，需要一个完整的救援系统。使用抗原序列代替基因组序列有助于从cDNA中拯救负链RNA病毒(22). 自那时以来，已经为几个单核糖核酸（有关审查，请参阅参考资料7和20)，包括EBOV(19,26). 这些系统允许感兴趣的蛋白质发生特异性突变(19,26)或引入增强型绿色荧光蛋白等国外报告基因(25).

在这项研究中，我们提出了一个系统，可以从cDNA中完全恢复感染性MARV。利用该系统，研究了VP30在重组MARV抢救中的作用。

（S.Enterlein完成这项工作是为了部分满足德国马尔堡菲利普斯大学博士学位的要求。）

全长MARV克隆的克隆。

确定了MARV株Musoke的完整基因组序列，并将其作为参考序列提交给GenBank（登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“DQ217792”，“term_id”：“77543426”，“term_text”：“dQ217791”}}DQ217792号). 使用pBlueScript II KS（+）主干（Stratagene）设计了一组五个磁带，可以结合生成完整MARV抗原组的全长cDNA，称为pMARV（+。逆转录（RT）-以病毒RNA为模板的PCR和使用已有的含有MARV特异性序列的质粒的PCR被用于产生2.1至7.8 kb的片段，片段两侧有独特的限制性位点（图。​（图1）。1). 所有五种MARV特异性质粒均用图中所示的相应酶消化。​图11并连接以产生pMARV（+）。通过MegaBACE测序仪（Amersham）上的自动测序验证了正确的序列。为了区分重组病毒和野生型病毒，沉默突变（病毒RNA：a_6225→U） 通过QuikChange突变（Stratagene）引入GP基因，在核苷酸（nt）6220处产生额外的SspI限制位点。此外，MARV特异序列的第一个核苷酸被突变（A→G）以增强T7 RNA聚合酶启动子活性(21). 在克隆全长克隆之前，使用含有突变的阳性小基因组来测试A-to-G替换对复制和转录活性的影响。据观察，这种突变并不影响复制和转录效率（数据未显示）。全长克隆pMARV（+）的侧翼是前导上游的T7 RNA聚合酶启动子和拖尾下游的德尔塔肝炎病毒核酶(29). T7 RNA聚合酶对质粒的转录产生全长抗原RNA。

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图1。

全长克隆的克隆策略。（左）用于克隆的盒式磁带示意图。数字表示MARV基因组中的核苷酸位置（Musoke菌株；GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“DQ217792”，“term_id”：“77543426”，“term_text”：“dQ217791”}}DQ217792号). MARV特异性序列是以病毒RNA为模板通过RT-PCR获得的，也可以通过PCR检测来自病毒RNA的现有质粒获得。pMARV ApaI/SacI中显示的SspI位点作为遗传标记。盒两侧的限制性位点用于构建全长pMARV（+）（右）。

重组MARV的抢救。

生成重组MARV（recMARV），BSR T7/5细胞(4)长25厘米²烧瓶60至80%汇合并转染编码MARV核衣壳蛋白NP、VP35、L和VP30的质粒(17)和参考文献中描述的全长结构pMARV（+）27以全长克隆为模板进行的滴定实验表明，质粒的最佳用量为1.0μg pT/L_M（M），0.5μg pT/VP35_M（M），0.5μg pT/NP_M（M），0.1μg pT/VP30_M（M）和4.0μg pMARV（+）。此外，转染1.0μg pC-T7Pol，一种携带T7 RNA聚合酶的质粒(19). 与MARV特异性微基因组系统相比，其中0.1μg pT/NP_M（M）输入的DNA被发现是最佳的，NP特异性DNA的量必须增加到0.5μg才能产生重组病毒(17). 5至6天后，将转染的BSR T7/5细胞刮除在培养基中，并与Vero细胞混合。省略这一步骤并没有导致recMARV的可复制挽救，很可能是因为转染细胞在产生重组病毒之前死亡。6至8天后，对细胞进行裂解，通过短离心步骤清除裂解产物中的碎片，并使用上清液感染新鲜Vero细胞。感染野生型（wt）MARV或recMARV的细胞在感染后第6天（p.i.）表现出显著且类似显著的细胞病变效应（CPE）（图。​（图2A）。2安培). 为了进一步表征重组病毒，50%组织培养感染剂量（TCID₅₀)对感染细胞进行检测、RT-PCR、免疫荧光分析和纯化病毒的电镜研究，并与wt-MARV进行比较。感染细胞上清液中的病毒滴度显示出可比的CPE，与TCID测定的结果几乎相同₅₀分析（图。​（图2B）。2B型). 简单地说，用病毒四倍连续稀释液感染96周培养板中的Vero细胞，并培养至CPE保持恒定。在p.i.第12天，对CPE和TCID进行评估₅₀使用Spearman和Karber方法计算的滴度。通过RT-PCR对蔗糖缓冲纯化病毒的RNA进行遗传标记验证。感染Vero细胞的上清液通过20%蔗糖缓冲液（wt/vol）在TNE（10 mM Tris-HCl，pH 7.4；0.15 M NaCl；2 mM EDTA）中制成颗粒，并将颗粒重新悬浮在600μl RLT缓冲液中（RNeasy试剂盒；QIAGEN）。按照制造商的说明纯化病毒RNA，并使用靶向负链MARV RNA的nt 5890至5910（GP基因）的引物进行第一次逆转录（Omniscript；QIAGEN）。对第一链cDNA进行PCR扩增nt 5890到6521，其中包含额外的SspI限制位点。在用SspI纯化和消化后，两个片段（331和301 bp）验证了重组MARV（图。​（图2C，2摄氏度，泳道4），而632bp处的单个条带指示wt MARV（图。​（图2C，2摄氏度，车道2）。由于在反应中省略逆转录酶不会产生任何信号，因此不存在质粒DNA（图。​（图2C，2摄氏度，车道5）。通过免疫荧光分析进一步表征了传染性病毒的存在。Vero细胞生长在玻璃盖玻片上，感染recMARV或wt MARV，或与介质（模拟）或省略L质粒的样品（−pT/L）孵育。在48小时p.i.时，将样品在4%多聚甲醛中灭活过夜。细胞与抗MARV NP的单克隆抗体孵育（1:100稀释）。作为二级抗体，使用罗丹明结合的山羊抗鼠抗体（1:200稀释；Dianova）。此外，细胞核用0.1μg/ml 4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）染色。如图所示。​图2D，二维在感染recMARV或wt-MARV的细胞中观察到由核衣壳蛋白形成的典型包涵体。在模拟感染细胞或转染无L基因的样品中未观察到特异性染色。最后，通过上述蔗糖垫纯化病毒，在4%多聚甲醛中过夜灭活，并按照Volchkov等人的描述通过电子显微镜进行分析(26). 与wt-MARV相比，重组MARV没有表现出形态学差异（图。​（图2E）。第二版). 综上所述，recMARV可以通过编码核衣壳蛋白VP30、VP35、L和NP的质粒被拯救，并且在形态、感染性、病毒滴度和免疫荧光染色方面与wt-MARV没有区别。

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图2。

recMARV的特征。从转染的BSR T7/5细胞中回收病毒，如文中所述，该细胞与Vero细胞混合。25厘米Vero细胞²用混合培养物的裂解液接种烧瓶，并每天检查CPE。作为对照，在转染中省略了编码L基因的质粒（−pT/L）。（A） 第6天p.i.由wt MARV和recMARV引起的CPE的光镜照片（B）病毒滴度的测定。用病毒的系列稀释液感染96个平板中的Vero细胞，以测定病毒滴度。12天后，对CPE和TCID进行评估₅₀计算。（C） 遗传标记的确认。在第6天p.i通过蔗糖垫纯化感染Vero细胞上清液中的病毒。分离病毒RNA，进行逆转录（除−RT外，第5道），并对第一链cDNA进行PCR。632-bp的产物（通道1和3）在规定的地方用SspI进行纯化和消化。301和331 bp的两条带分别表明recMARV GP基因中存在遗传标签（通道4）。ctrl，控制。（D） 感染recMARV或wt MARV的Vero细胞的免疫荧光分析。Vero细胞生长在玻璃盖玻片上，感染wt MARV或recMARV，感染倍数为1。在48小时p.i.，病毒在4%多聚甲醛中过夜灭活。用小鼠抗MARV NP单克隆抗体和罗丹明结合山羊抗小鼠免疫球蛋白G进行免疫荧光分析；细胞核用DAPI染色。箭头表示病毒包涵体。（E） 纯化病毒的电子显微镜照片。病毒从感染Vero细胞的上清液中收集，每次6天，并通过蔗糖垫纯化。病毒在4%多聚甲醛中灭活过夜，并如前所述制备用于电子显微镜(26). 照片是在蔡司109电子显微镜上拍摄的，放大倍数为50000倍。

锌结合基序Cys的完整性_三-VP30内的His不需要与NP相互作用，而是在EBOV特异性小基因组系统中的转录活性。

只有在所有核衣壳蛋白存在的情况下才支持recMARV的拯救。当第四个核衣壳蛋白VP30被省略时，不可能产生重组MARV（见下文和图。​图4）。4). 同样，重组EBOV的回收也依赖于VP30的存在(19,26). 有趣的是，第四核衣壳蛋白M2-1对病毒拯救的必要性在不同的肺炎病毒中是不同的。虽然发现人呼吸道合胞病毒M2-1是生产重组病毒所必需的，但在细胞培养中成功回收了缺乏M2-1开放阅读框的重组人偏肺病毒(三,5). 关于MARV，MARV小基因组的复制和转录不需要VP30(17). 因此，产生的问题是VP30是否参与重组病毒的转录和/或复制，或者是否在核衣壳形成过程中充当结构成分。

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图4。

VP30对重组MARV和EBOV回收率的影响。（A） 用编码MARV核衣壳蛋白NP、L和VP35的质粒、全长克隆pMARV（+）和pC-T7Pol转染BSR T7/5细胞。编码MARV VP30（1区）、MARV VPN30 Zn-finger突变体（VP30）的质粒_{Zn-finger ko公司}或将EBOV VP30（通道8至10）添加到反应混合物中，或从转染中省略VP30（w/o VP30，通道2至4）。除阳性对照组（MARV VP30）外，共转染三次。转染后6天，BSR T7/5细胞与Vero细胞混合，并在适当的培养期后溶解。用上清液感染新鲜Vero细胞并孵育至第10天，p.i。对细胞进行裂解，分离总RNA并使用靶向MARV GP基因（nt 5890至6521）的引物进行一步RT-PCR。10%的反应混合物在2%琼脂糖凝胶上运行，并用溴化乙锭进行可视化。作为对照，细胞感染了MARV（MARV wt-inf，第12道）或未感染（模拟，第11道）。（B） 用编码EBOV NP、L、VP35、全长克隆pFL-EBOVe+和VP30的质粒转染BSR T7/5细胞_{欧洲银行组织}或Zn-finger突变型VP30_{E H90升}（EBOV VP30_{Zn-finger ko公司}). 转染后6天，使用上清液感染Vero E6细胞。在6天的潜伏期后测定病毒感染引起的CPE。

锌结合基序Cys_三-EBOV VP30的His被证明是转录活性所必需的，但不是与NP结合所必需的(15). 首先，研究了MARV VP30的锌结合基序在EBOV特异性微基因组系统中与NP结合和转录活性的重要性(18). 表达质粒pT/VP30_{M（M） Zn-finger击出}包含两个替换（基因组位置G_9143→C、 一个_9155→U、 mRNA感觉）通过QuikChange突变引入pT/VP30_M（M）(17)，导致假定的锌指基序（Cys_92→爵士，他的_96→Leu）（图。​（图3A）。3A级). 先前已经证明，EBOV VP30的同源氨基酸突变导致作为转录激活物的功能丧失，而与NP衍生包涵体的结合没有受到损害(15). VP30的表达_M（M）和VP30_{M Zn-finger击倒}经Western blot分析证实。因此，分别用1.0和2.0μg的pT/VP30转染BSR T7/5细胞_M（M）或pT/VP30_{M Zn-finger击倒}转染后2天裂解。VP30（视频处理30）_M（M）使用单克隆小鼠抗VP30检测到_M（M）抗体（1:1000）和过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体（1:40000）。如图所示。​图3C，3C公司，这两个结构在可比较的水平上表达。免疫荧光分析研究VP30的相互作用_{M Zn-finger击倒}BSR T7/5细胞生长在盖玻片上，并转染0.5μg pT/NP_M（M），1.5μg pT/VP30_M（M），1.5μg pT/VP30_{M Zn-finger击倒}或NP和VP30质粒的组合。2天后，细胞固定并渗透。如上所述检测NP，并使用豚鼠抗VP30抗体（1:100）和异硫氰酸荧光素结合山羊抗豚鼠抗体（1:200；Dianova）检测VP30。单次表达后，NP形成包涵体（图。​（图3B，3B公司，面板1），而VP30_M（M）和VP30_{M Zn-finger击倒}在细胞质中均匀分布（图。​（图3B，3B公司，面板2和3）。当NP和VP30_M（M）或突变型VP30_{M Zn-finger击倒}共表达，两种VP30变体被重新分配到NP衍生的包涵体中（图。​（图3B，3B公司，面板4和5）。这些数据表明，完整的锌指基序对于结合NP并不重要，正如EBOV VP30所述(15). 下一个目标是确定VP30的功能_{M Zn-finger击倒}关于转录激活。如上所述，MARV VP30在MARV特异性微基因组系统中不需要转录激活。然而，之前已经描述过，当用于EBOV特异性微基因组系统时，MARV VP30能够在一定程度上介导转录。当用编码EBOV NP、VP35、L、EBOV特异性小基因组和MARV VP30的质粒转染细胞时，观察到转录激活(18). 遵循Weik等人描述的BSR T7/5细胞转染程序(27)，我们更换了pT/VP30_{欧洲银行组织}使用2.0μg pT/VP30_M（M），pT/VP30_{M Zn-finger击倒}，或pT/VP30_{E H90升}，一个具有被破坏的Zn-finger基序的EBOV VP30突变体(15). 转染细胞在转染后第2天被裂解。所用的小基因组3E-5E由EBOV基因组的3′端和5′端和氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因作为报告基因组成(18). 小基因组的转录导致CAT基因表达，并通过CAT活性进行检测(17). 而MARV VP30的活性在10%到15%之间（图。​（图3D，三维Zn-finger基因敲除突变体均不能激活转录（图。​（图3D，三维，车道4和5）。因此，MARV和EBOV VP30的Zn-binding基序似乎具有类似的功能，尽管细节尚不清楚(15).

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图3。

VP30的本地化和功能_{Zn-finger击出}.（A）MARV VP30的推定锌结合域。pT/VP30中引入了两个突变（带下划线）_{M Zn-finger击倒}破坏假定的锌结合基序。核苷酸编号表示MARV基因组中的位置。（B） BSR T7/5细胞生长在玻璃盖玻片上并转染pT/NP_M（M）（NP），pT/VP30_M（M）（VP30）和pT/VP30_{M Zn-finger击倒}（第30页_{Zn-finger ko公司})如左侧所示。在转染后48小时，使用单克隆小鼠抗NP（α-NP）抗体和豚鼠抗VP30（α-VP30）抗体对细胞进行免疫荧光分析。NP用罗丹明结合山羊抗鼠抗体染色，VP30用异硫氰酸荧光素结合山羊抗豚鼠抗体染色。箭头表示NP形成的典型包涵体。（C）VP30的Western blot分析_{M Zn-finger击倒}BSR T7/5细胞分别转染1.0和2.0μg的pT/VP30_M（M）或pT/VP30_{M Zn-finger击倒}转染后2天进行Western blotting分析。VP30（视频处理30）_M（M）使用单克隆小鼠抗VP30检测到_M（M）（α-VP30_M（M）)抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体。（D） VP30的转录活性_{M Zn-finger击倒}使用EBOV特异的微基因组系统。用编码EBOV核衣壳蛋白和小基因组3E-5E的质粒转染BSR T7/5细胞(27). 用2.0μg VP30替换EBOV VP30_M（M）或2.0μg MARV特异性VP30的Zn-finger敲除（ko）突变体_M（M）（VP30_{M Zn-finger击倒})或EBOV特定VP30_{欧洲银行组织}（VP30_{E H90升})(15). 48小时后裂解细胞并进行CAT分析，存在pT/L；−，pT/L缺失。

MARV可以通过EBOV VP30和VP30进行救援_{M Zn-finger击倒}.

接下来，我们研究了VP30在全长救援系统中的作用。如上所述，将BSR T7/5细胞转染成三份。质粒pT/VP30_M（M）被0.1μg pT/VP30取代_{欧洲银行组织}EBOV VP30或0.5μg pT/VP30的编码_{M－Zn手指敲除}使用来自混合BSR T7/5和Vero细胞的上清液感染新鲜Vero细胞，在p.i.10天时，分离总细胞RNA，并按照前面所述进行RT-PCR。如上所述，当从转染混合物中省略VP30时，没有检测到信号（图。​（图4A，4A级，车道2至4）。这些数据表明，MARV VP30对拯救全长病毒是必要的，尽管它在微基因组系统中不需要转录和复制(17). 所有转染pT/VP30的样本都获得了强信号_{M Zn-finger击倒}（图。​（图4A，4A级，通道5至7），表明Zn-binding基序对recMARV的恢复不是必需的，尽管它对EBOV特异性微基因组系统中的转录激活是必需的（图。​（图3D）。三维). 当EBOV VP30质粒被转染时，在三个样本中的一个样本中也观察到了拯救（图。​（图4A，4A级，8至10车道）。相反，当MARV VP30用于EBOV救援系统时，不可能产生重组EBOV(24).

为了比较VP30 Zn-binding结构域对MARV和EBOV病毒恢复的影响，使用EBOV特异性救援系统进行了类似的实验。用编码EBOV核衣壳蛋白NP、VP35和L、EBOV特异性正向全长克隆pFL-EBOVe+、EBOV-VP30或Zn-finger突变VP30的质粒转染BSR T7/5细胞_{E H90升}如前所述(15,26). 简单地说，BSR T7/5细胞在25cm中培养过夜²烧瓶约60%汇合，并转染含有4μg全长质粒pFL-EBOVe+和1μg pT/VP35的质粒混合物_{欧洲银行组织}，1μg pT/NP_{欧洲银行组织}，2μg pT/L_{欧洲银行组织}和0.2μg pT/VP30_{欧洲银行组织}或VP30_{E H90升}使用Fugene 6试剂(15,26). 6天后，收集培养基并用于接种Vero E6细胞。在p.i.第6天，通过感染重组EBOV引起的强烈CPE证明成功抢救。如图所示。​图4B4B类只有在存在非突变型VP30的情况下才能观察到病毒的恢复。突变体VP30_{E H90升}然而，无法支持救援。这些数据表明，与MARV相比，完整的VP30-Zn结合结构域对于拯救重组EBOV是必不可少的，这证实了VP30作为EBOV的转录激活剂而不是MARV的假设。所以，MARV VP30可能作为一种结构成分发挥作用，可能与核衣壳的正确形成有关。然而，必须注意的是，即使支持质粒对recMARV的复制和转录较差，也可能导致感染性病毒的产生。由于重组病毒含有VP30基因的非突变版本，因此可以无限制地扩增，从而获得观察到的结果。此外，可以想象，抗原组的低效翻译产生了低水平的野生型VP30。然而，对观察结果的这种解释不太可能，因为如果是这样的话，救援也应该在没有VP30的情况下进行。为了最终阐明锌结合域在病毒拯救中的作用，下一步将评估全长基因组VP30基因中VP30突变的影响。

总之，我们为丝状病毒原型MARV建立了一个T7 RNA聚合酶驱动的全长拯救系统。该系统为研究病毒蛋白和顺式-突变病毒复制和转录中的作用元件，将帮助我们了解病毒的生命周期。

核苷酸序列登录号。

MARV Musoke株的完整基因组序列以登录号提交给GenBank{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“DQ217792”，“term_id”：“77543426”，“term_text”：“dQ217791”}}DQ217792号.

致谢

参考文献