分子细胞生物学。2002年8月；22(16): 5897–5911.
蛋白激酶C-整合素相互作用的定点干扰阻断癌细胞趋化性
,1 ,1 ,2 ,2 ,2 ,1 ,1 ,三，† ,三，‡ ,三和1,*
梅迪·帕森斯
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
梅兰妮·凯普勒
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
亚当·克莱恩
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
安西亚·梅森特
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
马丁·汉弗莱斯
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
露丝·吉尔克里斯特
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
伊恩·哈特
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
Corinne Quittau-Prevestel公司
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
威廉·E·休斯
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
彼得·帕克
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
掌控十亿级交易数据
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
Richard Dimbleby/英国癌症研究部，GKT医学院，圣托马斯医院，伦敦SE1 7EH，1曼彻斯特大学生物科学学院威康细胞基质研究信托中心，曼彻斯特M13 9PT，2英国伦敦癌症研究所蛋白质磷酸化实验室，英国伦敦WC2A 3PX三
*通讯作者。通讯地址：英国伦敦癌症研究所，林肯Inn Fields实验室，英国伦敦WC2A 3PX，林肯Inn-Fields 44号。电话：44（0）207-269-3054。电子邮件：ku.gro.recnac@gN.T。 †现住址：INSERM U469，34090 Montpellier，France。
‡现住址：澳大利亚新南威尔士州悉尼市加文医学研究所，邮编：2101。
2002年2月27日收到；2002年4月4日修订；2002年5月22日接受。
摘要
细胞极化运动是肿瘤转移的必要条件；因此，干扰肿瘤细胞运动机制将显著改变其转移行为。蛋白激酶Cα（PKCα）与迁移细胞表型的促进有关。我们报道，乳腺癌细胞中佛波酯诱导的细胞极化和定向运动由PKCαV3铰链结构域中的12-氨基酸基序（氨基酸313至325）决定。该基序也是PKCα和β1整合素之间直接关联所必需的。β1整合素与PKCα的有效结合需要整合素远端细胞质域中同时存在NPXY基序（细胞-2和细胞-3）。基于β1整合素PKC结合序列的细胞渗透抑制剂可以阻断PKCα驱动和表皮生长因子（EGF）诱导的趋化性。当通过逆转录病毒转导将其作为小基因导入人类乳腺癌细胞时，该抑制剂导致向EGF梯度的趋化性显著降低。总之，这些发现确定了PKCα和β1整合素之间的直接联系，这对肿瘤细胞定向迁移至关重要。重要的是，我们的发现勾勒出一个关于癌细胞趋化性如何增强的新概念，并为干预肿瘤细胞扩散提供了概念基础。
转移级联中的早期关键步骤包括细胞极化和定向细胞运动。然而，对控制这些事件的机制却知之甚少。细胞与细胞外基质（ECM）蛋白、细胞因子或化学引诱剂或靶组织或血管表面表达的配体结合可触发细胞极化信号。对这些细胞外信号的感知导致膜受体的重新分布和运输(1,19)和/或细胞内信号蛋白以及可以是稳定的或瞬时的蛋白质复合物的局部形成。
整合素受体家族的成员在介导细胞基质粘附方面至关重要，并与提供细胞运动的持久性和方向性有关，如在伤口愈合中(7). 具体而言，许多研究表明，β亚基细胞质结构域参与细胞迁移的控制。因此，β1中两个NPXY基序的酪氨酸残基对于通过整合素底物涂层过滤器响应生长因子趋化梯度的定向细胞迁移很重要(22,23). 事实上，当表达为与异源细胞外结构域（如白细胞介素-2受体（IL-2R）tac亚单位）连接的嵌合受体时，β1整合素胞质尾部充当内源性整合素功能的主要负性抑制剂(4). 此外，GRGDS肽或抑制性抗体对整合素-ECM相互作用的抑制也被证明可以消除神经嵴细胞运动的持续性或方向性(7).
蛋白激酶C（PKC）可能被视为破译细胞内钙的时空变化的分子机制的一部分2+和二酰基甘油信号(18). 第二信使的产生是对细胞表面受体感知到的ECM环境变化的响应。用钙蛋白C阻断PKC被证明可以抑制肿瘤细胞向多种ECM蛋白的迁移(21). 依赖αvβ5的癌细胞在玻璃体凝集素上的迁移也需要PKC激活(32). 我们以前曾报道过，瞬时表达PKCα-GFP（绿色荧光蛋白）的MCF-7乳腺癌细胞向β1底物的亲合迁移显著增加(16). 总之，这些数据表明PKC家族成员在介导整合素依赖性肿瘤细胞迁移中起着关键作用。
最近，我们发现PKCα与常见的β1整合素亚单位相关，并且该PKC亚型的过度表达导致该受体的表面上调，这种效应归因于PKCα调节域（RD）而非激酶域(16). 在佛波酯活化后，整合素以钙/磷脂酰肌醇3-激酶/动力素-1依赖的方式内化到再循环内体中。本研究报告了PKCα上的β1胞质尾部结合位点与RD的V3铰链序列中的12-氨基酸区域的映射。此外，我们还表明，该铰链结构域序列特异性地结合到β1胞浆尾部的远端区域（包含Cyto-2和Cyto-3结构域）。当作为微小基因插入到用于感染人类乳腺癌细胞的逆转录病毒载体中时，这种整合素细胞质域序列导致PKC和表皮生长因子（EGF）驱动的趋化性显著降低。
材料和方法
细胞培养和转染。
人类乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）和Phoenix双嗜性逆转录病毒包装细胞（加利福尼亚州帕洛阿尔托斯坦福大学）均在37°C含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。MCF-7培养物在添加胰岛素（10μg/ml）的培养基中生长。Lipofectamine Plus（Gibco）的典型转染效率为40%（对于各种GFP-PKCα构建体）、35%（对于IL-2R-β1A整合素嵌合体）和15%（对于pECE-β1A）。
质粒构建物。
GFP-PKCα质粒的构建和PKCα的各种GFP-RD结构已在别处描述(15-17,27). 这些RD结构被亚克隆到带有红色荧光蛋白（RFP）标记的载体（dsRed；Clontech）中，使用生态RI和千磅I限制站点。
GFP-C2V3构建物由引物5′-GGGGAATTCGCACACTGAGAGGGGCGGATTACC和3′-GGGTCGGCGTGTTTCACTCGGAAGG产生。然后使用生态RI和萨尔I限制站点。以野生型（WT）GFP-PKCα质粒为模板生成GFP-PKC-αV3截短结构。所有PCR均使用相同的5′引物5′-GGGGAATTCCATGGCTGTTCCCGGGC-3′，3′引物为aa1-337（氨基酸1至337）（5′-GggGTCGGCGTGAGTTCCACTCGTCAAGG-3′）、aa1-325（5′-GGGTCGGTTCCCCGTCCAGAGGCGCGCATG-3′，和aa1-301（5′-GGGGTCGAGGGAGTCCATGTCTTCCTCG-3′）。然后使用生态RI和萨尔I限制站点。通过测序验证了所有PCR-扩增PKC截断结构的完整性。将全长β1A亚克隆到pECE质粒中(8)生成pECE-β1A。通过PCR产生GST-PKCα结构体（RD+V3、RD或C1AC1B[aa32-156]），并使用生态RI和Xho公司I站点。IL-2R-WTβ1A整合素嵌合体（Susan LaFlamme的礼物）(10)被用作模板来生成aa757-796和aa757-784截短构建体。在所有PCR中使用相同的5′引物5′-GGGGAAGCTTTTAATGATAATTCATGAC-3′，3′引物为aa757-796（5′-CGCATTGTTGACACCAGACTGGAGCTCGGG-3′）和aa757-784（5′-TTTTACCCGTGCCCACTTACTGGAGCTCGGG-3′）。然后使用Hin公司dIII和Xho公司I限制站点。通过产生全长正、反义寡核苷酸（GK21义[GGGAATTCAGTGTGGAAAATCCTATTTAAAGAGTGCCGTAACTACTGTGGTCATCCGAAGTGAGTGAGAGAGAGCGAGAGAGGAGAGAGA），制备编码β1胞质尾部肽和等效扰民肽的逆转录病毒载体和GK21反义[CCCGTCGACCTACAGGTCCTCCTGAGATCACTCTGCTCTTTTCCCTCACTACTTCGGATCACAGTTGTTACGGCACTCTTATAAATAGAGTCTCCACTGAATCCCCCCCCCC]）编码整个肽，包括myc标签，两侧有生态RI和萨尔I限制站点。将等量的正、反义寡核苷酸在缓冲液中加热至90°C，缓慢冷却，用相关限制性内切酶消化，并连接到pBABE中[希神]普洛逆转录病毒主干。
抗体和与荧光团的直接结合。
MC5是一种识别PKCαV3区的鼠单克隆抗体（MAb）(33). P4C10是一种抗β1阻断抗体，从Chemicon获得。抗α五阻断抗体（L230）从美国型培养物收集中心（马里兰州Rockville）获得。抗谷胱甘肽单克隆抗体S公司-转移酶（GST）用于Western blotting（Zymed Laboratories）。根据制造商的方案，使用ImmunoPure Fab制备试剂盒（Pierce）从小鼠免疫球蛋白G（IgG）中生成并分离Fab片段。如前所述，在pH 8.5（IgG）或pH 9.0（Ig G Fab）条件下，将IgG或IgG Fab片段直接偶联到荧光团Cy3（Amersham Life Science）(2).
β1整合素细胞域肽和下拉分析。
合成了四个基于人β1整合素细胞质序列的重叠肽，并在N末端进行生物素化（见图。). 对于体外下拉分析，细胞提取物（通过用含有1%[wt/vol]的改良放射免疫沉淀分析[RIPA]缓冲液赖氨酸转染细胞获得n个-辛基-β-天-含有全长GFP-PKCα蛋白或其中一个GFP-PKC-αRD构建蛋白的吡喃葡萄糖苷）与各种β1整合素细胞域肽在珠上在4°C下翻滚过夜（使用1mg/ml肽溶液预涂链霉亲和素偶联琼脂糖珠[Sigma]在4°C下持续1小时，然后用细胞提取缓冲液进行广泛清洗）。然后用RIPA缓冲液洗涤GFP-PKCα/肽复合物三次，用Tris-生理盐水缓冲液（pH 7.4）洗涤一次，然后再悬浮在Laemmli样品缓冲液中，并使用抗GFP兔抗血清（Clontech）进行免疫印迹分析。通过将含有全长PKCα蛋白或RD PKCα蛋白质的细胞提取物与等量含有混合磷脂酰丝氨酸（PS）和佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（TPA）的RIPA缓冲液预培养，研究了PKCα与β1整合素细胞域肽结合的构象要求胶束（每毫升2.5毫克PS和2.5μg TPA在加入细胞提取物之前进行超声处理）。对于GST-PKCα下拉分析，各种GST-PKC-α结构（以大肠杆菌和洗脱的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠）替代清洁剂细胞提取物与β1整合素细胞域肽GK21结合。
第三可变结构域（V3）是PKCα与包含细胞-2和细胞-3氨基酸基序的β1整合素细胞质肽的脂质依赖性结合所必需的。基于人β1整合素的细胞质序列合成了四个N末端生物素化重叠肽：KM（aa757-776）、KLLMIIHDRREFAKFEKEKM；HT（aa763-782），HDRREFAKFEKEKMNAKWDT；NT，（aa777-794），NAKWDTGENPIYKSAVTT；GK，（aa783-803），GENPIYKSAVTTVVNPKYEGK。（A） 在体外下拉试验中（如材料和方法所述），全长GFP-PKCα与β1整合素Cyto-2-和Cyto-3-肽GK结合最有效。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（珠）与含有未结合蛋白的相应上清液（Sup）的五分之一一起运行。阴性对照区（−）表示仅用链霉亲和素偶联琼脂糖珠进行孵化。使用抗GFP多克隆抗血清（Clontech）进行免疫检测。该图显示了三个实验的代表性结果。（B） 通过将含有不同PKCα结构体的细胞提取物与含有PS和TPA（+脂质）的混合胶束预孵育，研究了WT PKCα和不同GFP标记的PKCαRD结构体与β1整合素细胞域肽GK21结合的脂质或激活剂需求，与非脂质或非激活剂控制（−脂质）相比。
TUNEL法检测细胞凋亡。
收集细胞并固定在2%多聚甲醛中。根据制造商的方案（Promega）进行末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）分析。使用荧光素结合的dUTP检测细胞凋亡。通过流式细胞术分析样品，以确定群体中凋亡细胞的百分比。
细胞表面生物素化、免疫沉淀和蛋白质印迹。
用（i）GFP-PKCαRD结构域构建的β1-pECE质粒或（ii）IL-2R-β1整合素嵌合体转染β1-null GD25细胞。如前所述，使用Amersham蛋白生物素化模块（Amersham Pharmacia）对细胞表面蛋白进行生物素化，并在含有1%Brij 96的缓冲液中对细胞进行裂解(34). β1整合素是使用抗β1兔血清（皇家癌症研究基金会J.Ivaska的一份礼物）从洗涤剂可溶细胞组分中免疫沉淀出来的。使用抗β1整合素单克隆抗体（克隆DF7；Affiniti UK）进行Western blotting。免疫沉淀物在样品缓冲液中变性，在还原条件下在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后用兔抗GFP抗血清或针对PKCαC末端的抗血清检测斑点。将膜剥离并用辣根过氧化物酶（HRP）结合链霉亲和素重制，以检测生物素化蛋白。
Dunn chamber趋化试验。
在Dunn趋化室中，使用细胞行为的延时显微镜对二丁酸佛波酯（PDBu）梯度反应进行细胞趋化性评估（Weber Scientific International，Ltd.，Teddington，United Kingdom）(36). 简言之，该腔室由两个圆形井组成，由位于滑道上表面下方20μm的平台隔开。内孔填充控制介质，外孔填充含有1μM PDBu的介质。然后将盖玻片放在腔室上方，并在边缘用蜡密封，以便在平台距离上建立扩散梯度。然后在16小时内对平台一个区域内的细胞进行拍摄，并在顶部（0°)使用10倍物镜的图像。
细胞追踪和迁移统计分析。
双向分析（Δ年)速度数据是通过在延时数字图像序列中手动跟踪每个场中的细胞来执行的（运动分析软件；英国默西塞德郡的动力学成像）。将生成的细胞轨迹转换为单个角度，然后将这些点合并并汇总为圆形直方图，显示18°间隔内的细胞方向数(35). 通过对方向和细胞平均速度跟踪数据应用方差分析（ANOVA），对不同组的实验进行比较(35).P（P）值<0.05表示细胞方向在梯度（向上）周围显著聚集，因此表现出正的趋化性。
Transwell腔室迁移分析。
MDA-MB231细胞被来自凤凰包装细胞（斯坦福大学）的培养基短暂感染，该培养基含有编码myc标记的GKβ1肽或加扰等效物的完整逆转录病毒，或仅含有pBabe载体。用抗myc抗体染色的平行固定培养物检查感染效率。在感染后48小时，231个细胞被胰蛋白酶化并以5×10的浓度重新放置在6孔（直径24mm的插入物）Transwell板中5细胞/孔。每种情况下的底部井都含有补充有1μM PDBu或每毫升100 ng EGF的无血清培养基，但对照井除外，其仅含有培养基。然后将细胞在37°C下培养8小时，从每个顶部和底部孔中分离胰蛋白酶，离心，并固定在4%多聚甲醛中。然后使用CASY-1细胞计数器（德国Sharfe System GmbH）计算每个细胞室中的细胞总数。
FLIM测量。
本工作中用于荧光共振能量转移（FRET）测定的荧光寿命成像显微镜（FLIM）设备的详细描述可以在其他地方找到(19,24). 该仪器通过显微镜进行基于相位和调制的成像荧光测定。所有图像均使用蔡司Plan-APOCHROMAT 100×/1.4-数字孔径（NA）3相油物镜拍摄，零差相敏图像以80.224MHz的调制频率记录。
共焦显微镜。
使用配备40×/1.3Plan-Neofluar和63×/1.4Plan-APOCHROMAT油浸物镜的共焦激光扫描显微镜（型号LSM 510；Carl Zeiss Inc.）获取共焦图像。每幅图像代表一个由两个或三个切片组成的二维投影z系列，以0.2-μm的间隔在细胞中部拍摄。
视频显微镜。
在37°C下，添加PDBu（1μM）后，使用63×/NA 1.4 Plan-Neofluar，在配备外荧光和相控显微镜的倒置显微镜（Axiover 200 TV；Carl Zeiss）上观察细胞。数据是由AQM-NT-MC强大的多通道延时成像核心软件（Kinetic imaging，Ltd.）驱动的滨松的背照冷却电荷耦合器件相机（Orca ER）采集的，并存储为16位数字图像。帧之间的时间为5秒。
结果
PKCα诱导的定向迁移需要存在V3铰链结构域。
表征PKCα介导的MCF-7细胞迁移的分子决定因素(16)将转染不同GFP-PKCαRD结构或空载体对照的细胞置于Dunn运动室中PDBu梯度。全长GFP-PKCα的瞬时表达，而不仅仅是GFP的瞬时表达赋予了向具有显著方向性的趋化梯度迁移的能力(P（P）<0.001（方差分析）（图。). 相同浓度的生物活性4α-佛波醇的控制梯度没有显示出趋化作用（数据未显示）。表达两个包含V3铰链区的RD结构的细胞，GFP-PKCαRD+V3和GFP-Δ(P（P）<0.001和P（P）<0.01），表明PKCα驱动的定向细胞运动不需要第一可变区（V1）、假底物位点和催化域。然而，表达GFP-Δ（V1-PS）RD结构的细胞（不含V3区）没有明显的方向性。未转染的MCF-7细胞（没有检测到内源性PKCα）也没有向PDBu梯度显示出显著的方向运动。总之，这些数据表明PKCα的铰链区域包含了细胞定向运动的分子决定因素。
不同GFP-PKCαRD结构对PDBu梯度诱导的MCF-7细胞迁移的影响。（A） 表达全长GFP-PKCα的MCF-7细胞或两个可变区域V3的RD结构[GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3]对PDBu梯度（Dunn室外孔1μM）表现出显著的定向趋化性(P（P）< 0.001,P（P）<0.001，以及P（P）分别<0.01）。瞬时表达GFP-PKCα（V1-PS）RD结构的细胞不包含V3区域或空载体，对梯度没有方向性(P（P）= 0.3). 未转染的细胞没有明显的方向运动。使用方差分析对三个独立实验中的追踪细胞与单独载体等效物进行比较。PDBu梯度（0°）的显著定向趋化性由高亮弧线表示，相应的P（P）值显示在相关位置。显示跟踪的单元格总数（N）。轨迹图显示了每个实验的整个时间过程中的所有细胞轨迹。每个点表示特定时间点的细胞位置，该位置由每组细胞轨道下方的伪彩色刻度（时间单位为小时）表示。细胞轨迹轴以微米为单位。（B） 表达GFP-PKCαRD+V3的细胞的定向细胞运动依赖于β1，而非αV整合素功能。将瞬时转染的细胞单独放置或与抗β1（P4C10）或抗αV整合素（L230）抑制MAb（10μg/ml）预孵育1 h，然后在存在相应阻断抗体的情况下进行上文所述的a组趋化性分析。（C） 双吲哚甲酰胺（BIM）抑制表达GFP-PKCαRD+V3细胞的定向细胞运动。
先前我们研究表明，MCF-7细胞瞬时表达全长PKCα-GFP后，向β1而非αV底物的亲合迁移显著增加(16). 图表明，瞬时表达含V3的GFP-PKCαRD结构所赋予的细胞运动方向性也可以通过抗β1而非抗αV整合素阻断抗体特异性地消除，这与我们之前发表的结果一致。此外，表达GFP-PKCαRD+V3的细胞的定向细胞运动，尽管没有催化结构域，但对双吲哚甲酰亚胺的抑制敏感（图。).
PKCα的V3区是PKCα-β1整合素结合所必需的。
我们之前报道过，经TPA治疗后，GFP-PKCαRD+V3蛋白与活化的β1整合素复合(16). 为了进一步表征结合位点，根据人β1整合素的细胞质序列合成了四个N末端生物素化的重叠肽。其中，同时包含细胞-2和细胞-3结构域的GK21对下调MCF-7细胞中表达的全长GFP-PKCα（WT）蛋白最为有效（图。). 图表明该肽可以与GFP-PKCαWT、GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V三结合，但在体外不能以PS或TPA依赖的方式与GFP-Δ（V2-PS）RD结合。GK21体外对PKCαΔ（V1-PS）RD+V3的下拉效率低于PKCαRD+V三，提示V1-PS结构域可能在PKCα-β1整合素关联中发挥额外的调节作用。
在TPA刺激的细胞中，通过检测12G10-阳性、活化的β1整合素和GFP-PKCαRD+V3和GFP-PKCαΔ。这些数据如图所示。并通过图中右侧的像素count-versus-FRET效率图进行总结。活化的β1整合素与GFP-PKCαΔ。这意味着活化后PKCα的可变区V3是PKCα-β1整合素结合所必需的。
β1整合素结合中PKCαRD的结构要求及其在MCF-7细胞中的定位。（A） 用不同GFP标记的PKCαRD构建物[GFP-Δ（V1-PS）RD+V3、GFP-△（V1-PS）RD和GFP-PKCαRD+V3]瞬时转染MCF-7细胞。用TPA（400 nM）刺激细胞，并在37℃孵育20分钟后固定°C，然后留作对照或用MAb 12G10 Fab染色（+12G10 Fab-Cy3）。显示了供体（GFP-PKCαRD）和受体（整合素12G10 Fab-Cy3）的荧光图像<τ> 是τ的平均值第页和τ米，其伪彩色比例适用于所有四个寿命映射。FRET效率（Eff）假彩色图仅适用于+12G10 Fab-Cy3寿命图（Eff=1−τ达/τD类，式中τ达是在受体和τ存在的情况下供体的寿命图D类是在没有受体的情况下供体的平均寿命[至少四个单独的GFP-PKC RD对照细胞的平均<τ>的平均值]）。右侧的像素计数-相对-FRET效率图总结了不同RD结构在结合活化β1整合素[GFP-PKCαRD+V3（蓝色迹线）、GFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3]（红色迹线）和GFP-PKC-αΔ。GFP-PKCαRD+V3的结果与之前使用相同试验发布的结果相似(16)并总结了在像素计数-versus-FRET效率图中进行比较。GFP-PKCα供体单独的累积寿命（绿色）和在受体荧光团存在下测得的累计寿命（红色）(n个=5）绘制在右侧插入的二维图上。（B） 未刺激的、混有副甲醛的MCF-7细胞共聚焦图像，共表达RFP-PKCαΔ（V1-PS）RD+V3或RFP-PKC-αRD+V5和GFP-actin。棒材=10μm。（C） 用PDBu（1μM）模拟活MCF-7细胞共表达RFP-PKCαRD+V3（电影1）或RFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V5（电影2）和GFP-actin的补充电影1和2的静态图像。帧001分别对应于向组织培养基中添加PDBu（1μM）后的1分钟（电影1）和3分钟（电影2）。按照材料和方法中的描述，采用时间序列。在拍摄过程中，有时必须手动调整显微镜以重新建立焦距，即使温度保持在37°C，高倍物镜的焦距也不太稳定。白色箭头指向RFP-PKCαRD+V3富集的小泡，这些小泡进出富含肌动蛋白的细胞皱褶（电影1），以及RFP-PKC-αΔ（V1-PS）RD+V3富集小泡，随着细胞对PDBu刺激的反应而突起，小泡定向流入前沿（电影2）。蓝色箭头指向细胞尾部，几乎没有RFP-PKCαRD+V3囊泡交通（电影1）和PDBu诱导的细胞突起（电影2）。（D） 第一组显示GFP-PKCαRD+V3与PKCδ共沉淀，以响应佛波酯（1μM PDBu）（+）的刺激。装载第一次离心后沉淀（unbound）后，蛋白G珠（bound）上的所有结合蛋白和细胞提取上清液中剩余的五分之一未结合蛋白。首先用兔抗PKCδ多克隆抗体探测含有抗PKCα（MAb MC5）免疫沉淀物的印迹，然后用抗GFP兔血清（Clontech）剥离并复制。重复运行+PDBu样本。显示了分子质量标记的位置。第二组是第一组实验的重复，使用模拟免疫沉淀（IP）控制（即免疫前血清免疫沉淀）；用兔抗GFP血清进行GFP-PKCαRD+V3免疫沉淀。
宽视野荧光寿命显微镜中微通道板探测器产生的增强光图像不具备足够的分辨率，无法确定RD结构是否为PKCαΔ（V1-PS）RD+V3，该结构缺乏V1-PS结构域，但保留与质膜或囊泡相关β1整合素相互作用的能力，能够有效地转移到膜室以应对佛波醇处理。然而，共聚焦显微镜显示，虽然大多数PKCαΔ（V1-PS）RD+V3（RFP标记以允许用佛波酯刺激的活细胞中同时显示PKCα和GFP-actin）似乎是细胞溶质，但一个亚群与囊泡室相关（图。). 相反，大多数RFP-PKCαRD+V3是膜或囊泡结合的，这与先前发表的研究结果一致，表明传统PKC中V1-PS结构域的质膜靶向作用(18,27). PKCαΔ（V1-PS）RD+V3的囊泡结合亚群，如PKCαRD+V三，在细胞对PDBu刺激作出反应时，向前缘主动进行定向交通。这些延伸的细胞过程以富含肌动蛋白的皱褶膜为特征，并以富含肌动蛋白的膜泡为靶点（图。以及补充电影1和2）。对不含内源性PKCα的转染MCF-7细胞免疫沉淀物的Western blot分析表明，内源性PKC-δ也以PDBu反应的方式被招募到含有PKCαRD+V3的信号复合物中。经PDBu处理后，抗PKCα免疫沉淀物中PKCδ的比例回收率增加了约84%和85%（图。，面板I和II）。我们还证明了纯化的、细菌表达的GST-PKCαRD+V3，而不是GST-PKCαRD或PKCαC1AC1B（aa32-156）与β1整合素Cyto-2-和Cyto-3-肽GK21之间的直接体外相互作用（图。)进一步证实了V3结构域对PKCα和β1整合素之间直接关联的需求。我们没有观察到GST-PKCαRD+V3与涂有搅乱GK21肽的链霉亲和素琼脂糖珠或与非肽对照的任何结合（图。). GST-PKCαRD+V3在谷胱甘肽珠上与游离GK肽预孵育，而非其搅乱等效物，消除了其与体外MCF-7细胞提取物中的β1整合素结合的能力（图。)
体外纯化的GST-PKCαRD与β1整合素胞质肽的直接关联。（A） 在体外下拉试验（如材料和方法所述）中，比较了GST-PKCαRD+V3、GST-PKCαRD、PKCαC1AC1B（aa32-156）或GST单独与β1整合素Cyto-2-和Cyto-3-肽GK的结合。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（结合）与含有未结合蛋白（未结合）的相应上清液的五分之一一起运行。（B） GST-PKCαRD+V3与涂有GK的链霉亲和素-琼脂糖珠的结合，但不是其加扰等效物（scra）或无肽（no-peptide）对照物。（C） 谷胱甘肽珠上的GST-PKCαRD+V3未经处理（无肽[无肽]）或在4°C下与游离GK肽或其炒制等效物（scr）（1 mg/ml）预孵育1 h，用细胞提取缓冲液洗涤，然后与MCF-7或β1整合素缺失GD25细胞的细胞提取液翻滚。然后通过免疫印迹分析结合部分的β1整合素和GST-PKCα含量。
全长人β1整合素/IL-2R-β1整合素嵌合体与人PKCα在β1-null GD25细胞中的免疫共沉淀。
为了检测体内PKCα和β1整合素之间的相互作用，将表面生物素化的GD25（β1-null）细胞与全长β1A整合素ECE和各种GFP标记的PKCαRD构建物共转染。与β1整合素共沉淀WT GFP-PKCα、GFP-PKC-αRD+V3和GFP-C2V3，而不是GFP PKCα-Δ。). 此外，β1的细胞质尾部与IL-2R的跨膜和胞外结构域之间的融合嵌合体瞬时表达(14). 该结构不会与功能性整合素α亚单位二聚，因此被用于检测β链对PKC/整合素复合物形成的独特贡献。该构建物在β1-null细胞系GD25中表达，其中细胞表面蛋白被生物素化，随后通过HRP-结合链霉亲和素探针检测抗IL-2R免疫沉淀物。在GD25细胞中，IL-2R-WTβ1A整合素嵌合体与内源性PKCα的结合比IL-2R-β1A（aa757-796）更有效，后者缺乏细胞-3亚结构域（图。). IL-2R-β1A（aa757-784）缺乏细胞-2和细胞-3亚结构域，不能与内源性PKCα共沉淀（图。). 因此，Cyto-2和Cyto-3氨基酸簇均参与整合素/PKCα复合物的形成。
通过联合免疫沉淀人β1整合素/IL-2R-β1整合素嵌合体与PKCα在β1缺失的GD25细胞中的结合位点定位。（A） β1A整合素（用兔抗人β1整合素多克隆抗血清免疫沉淀）与GFP-PKCαWT、GFP-PKC-αRD+V3和GFP-PKC-αC2V3共沉淀，但不与GFP-PKCαΔ（V1-PS）RD或GFP-PKC/αRD共沉淀，如抗GFP抗体所检测。这些蛋白来自细胞表面生物素化的GD25细胞，GD25细胞与全长未标记的β1A整合素和各种GFP标记的PKCαRD结构共同转染。将蛋白质G珠上的所有结合蛋白（结合）和沉淀后第一次离心（未结合）后留在细胞提取上清液中的五分之一未结合蛋白装入。剥离含有抗整合素免疫沉淀物的印迹，并用抗β1整合素单克隆抗体重制；用HRP-共轭链霉亲和素探测一个类似制备的重复印迹。使用抗β1多克隆抗体免疫沉淀两种主要的生物素化表面蛋白，代表β1整合素α/β异二聚体（低带与抗β1整合素MAb检测到的β链结合）。显示了近似分子质量标记的位置。（B） 兔抗PKCα多克隆抗血清检测到IL-2R-WTβ1A整合素或其截短结构物（包含IL-2R的细胞外[EC]和跨膜[TM]结构域以及β1A的细胞内[IC]部分）与内源性PKCα共沉淀。这些蛋白来自转染IL-2R-β1A整合素（aa757-803、WT或aa757-796或aa757-284）嵌合物的GD25细胞。装载第一次离心后沉淀（unbound）后，蛋白G珠（bound）上的所有结合蛋白和细胞提取上清液中剩余的五分之一未结合蛋白。剥离印迹，并用HRP-结合链霉亲和素（Strep-HRP）重制。
PKCαV3结构域内的一个12-氨基酸基序包含β1整合素结合位点和细胞定向运动的决定因子。
为了进一步表征PKCαV3结构域内的整合素结合位点，图。使用在MCF-7细胞中表达的各种GFP标记的PKCαV3结构域截断构建物重复（图。). aa1-313和aa1-325截短之间的GK21结合显著减少（73%至83%），表明12个氨基酸的基序（G314NKVISPSEDRK公司325)参与整合素结合（图。). 通过使用识别LRQKFEKAK（aa301-309）表位的抗PKCαMAb进行免疫检测，确认aa1-313蛋白结构的完整性（数据未显示）。接下来，我们在β1整合素缺失的GD25细胞中表达了相同的PKC结构，通过共沉淀法可重复检测到转染全长β1A整合素与GFP-PKCαV3结构域截断aa1-325或aa1-337（而不是aa1-301）之间的体内关联(n个=3）（图。). 与aa1-325相比，截断结构aa1-313与β1A整合素的结合显著受损（平均减少82%，P（P）< 0.001,n个= 3). 在β1A整合素结合方面，aa1-325和aa1-337之间没有统计学差异(P（P）= 0.256,n个= 3). 在Dunn室中检测表达相同PKCαV3结构域截断结构对定向细胞运动的影响。表达V3结构域截断aa1-325或aa1-337，但不表达aa1-301或aa1-313的MCF-7细胞能够向PDBu梯度方向迁移（图。).
鉴定PKCα第三可变结构域（V3）内的12-氨基酸区域，以包含β1整合素的脂质依赖性结合位点和细胞定向运动的分子决定簇。（A） 各种PKCαRD+V3截断构造的示意图。（B） 如图图例所示，MCF-7细胞中表达的各种GFP标记的PKCαV3结构域截断结构体（在PS和TPA存在[+]和不存在[−]的情况下）：301（aa1-301）、313（aa1-313）、325（aa1-325）和337（aa1-337）与生物素化GK21肽之间的复合物形成。（C）β1A整合素（免疫沉淀[IP]与兔抗人β1整合素多克隆抗血清）与PKCα325（aa1-325）和337（aa1-337）共沉淀，如抗GFP抗体检测到的。这些蛋白质来自细胞表面生物素化的GD25细胞，GD25细胞与全长未标记的β1A整合素和上述GFP标记的PKCαV3结构域截短物共同转染。将蛋白质G珠上的所有结合蛋白（结合）和沉淀后第一次离心（未结合）后留在细胞提取上清液中的五分之一未结合蛋白装入。剥离含有抗整合素免疫沉淀物的印迹，并用HRP-结合链霉亲和素（Strep-HRP）进行复制。使用抗β1多克隆抗体免疫沉淀两种主要的生物素化表面蛋白，代表β1整合素α/β异二聚体，如图所示。显示了近似分子质量标记的位置。（D） 与GFP载体控制转染细胞相比，相同的PKCαV3结构域截断构建物对朝向PDBu梯度的定向细胞运动的影响（重复图。使用不同的V3截断变种）（参见图的图例。).
β1整合素胞质序列消除PKCα和EGF诱导的乳腺癌细胞趋化性。
我们使用两种不同的方法来研究β1细胞质尾部在PKCα诱导的细胞运动中的作用。首先，由β1A胞质域（aa783-803；GENPIYKSAVTTVVNPKYEGK）衍生的肽（GK21）通过化学合成与触角媒介第三螺旋（残基43至58）序列（RQIKIWFQNRRMKWKK）和罗丹明，以便可视化（ANT-GK21）。研究表明，全长GFP-PKCα在体外与ANT-GK21肽相关，但与扰乱的对照肽（GTAKINEPYSVTVPYGEKNKVRQIKIWFQNRRMKWKK）无关（图。). 在我们的Dunn小室实验中，ANT-GK21被证明可以消除PKC驱动的细胞迁移的方向性（朝向PDBu梯度）以及EGF诱导的趋化性（图。). 这些数据表明，含有细胞-2和细胞-3的β1肽干扰内源性β1整合素和PKCα之间的相互作用，对这些细胞的迁移表型产生显性负面影响。
细胞渗透型GK21对乳腺癌细胞趋化性的影响。（A） 在存在PS和TPA（+脂质）的情况下，全长GFP-PKCα与通过化学合成与触角第三螺旋（残基43至58）序列（GK21-ANT）串联而成的GK21肽结合，而不是其加扰版本（GK22-ANT加扰）或单独的触角序列（ANT）。对于每个样品，所有肽结合的GFP-PKCα（珠）与含有未结合蛋白的相应上清液（Sup）的五分之一一起运行。（B） 瞬时表达全长GFP-PKCα的MCF-7细胞在Dunn室中对PDBu梯度表现出显著的定向趋化性(P（P）<0.001）。这种PKC驱动的定向运动通过用8μM的细胞渗透剂（触角足标记）、罗丹明形式的GK21（GK21-ANT）预处理细胞而消除，但不是其扰频版本。参见图的图例。用于解释轨迹图。（C） 未转染的MDA-MB-231细胞在Dunn室（外孔0.1μM，P（P）<0.001）。通过用8μM的细胞发酵液（触角标记的）、罗丹明形式的GK21（GK21-ANT）预处理细胞，消除了对EGF的趋化作用，但不消除其打乱版本。
为了实现更可控的肽递送系统，我们构建了逆转录病毒构建物，编码β1细胞质肽GK21序列或其扰码等效物，并用myc表位标记，以便在细胞中进行后续检测。将这些逆转录病毒构建物导入MDA-MB231细胞，并在Transwell趋化性分析中分析其对运动的后续影响。感染后48小时，约70%的细胞表达myc标记序列，如MAb染色所示（数据未显示）。表达扰乱序列或pBABE空载体的细胞表现出与未感染细胞相似的迁移能力（图。). 相比之下，表达β1细胞质GK21序列的感染细胞对PDBu的趋化性显著降低（在三个独立的双盲检测中降低90%；P（P）<0.001（方差分析）（图。)或EGF（在两个独立的双盲分析中减少75%；P（P）<0.001（方差分析）（图。). 使用TUNEL评估潜在的细胞毒性效应。图证明没有与任何逆转录病毒结构相关的显著细胞死亡。
逆转录病毒转导编码GK21序列的小基因插入物可消除EGF诱导的趋化性。MDA-MB231细胞感染来自Phoenix包装细胞的培养基，该包装细胞含有编码myc表位标记的GK21β1细胞质序列的完整逆转录病毒、其扰码等效物或单独的pBabe载体。使用平行培养物检查逆转录病毒转导效率，这些培养物用抗myc MAb 9E10固定并染色。感染后48小时，对231个细胞进行胰蛋白酶化，并进行8小时Transwell室迁移试验（如材料和方法所述）。细胞采集和计数由两人以盲法进行，随后由第三名研究人员对样本进行解码。大约10%和14%的未感染细胞在8小时的时间过程中分别通过过滤器向PDBu（A）和EGF（B）梯度迁移。在同一实验中，根据迁移的未感染细胞的平均百分比（设定为100%），对每次治疗后迁移的细胞群体百分比（低孔细胞计数/高孔细胞计数）进行标准化。所示为迁移至±标准偏差的细胞的平均百分比n个=每个处理3口井。结果代表了三个独立实验。
通过TUNEL分析（Promega）评估引入仅编码pBABE载体、GK21或GK21乱序的逆转录病毒构建物对细胞存活的影响。阳性对照细胞与30μM染料木素孵育48小时。通过荧光激活细胞分选分析检测到的TdT介导的荧光素结合dUTP摄取量来监测细胞凋亡。M1表示在阴性截止值以上显示明显凋亡的细胞亚群，这是由在没有TdT的情况下加入的荧光素结合的dUTP的数量决定的。结果代表了两个独立的实验。
讨论
在三维培养和裸鼠中用抗β1整合素阻断抗体治疗的人类乳腺癌细胞的已发表研究表明，β1整合素在恶性表型的发展中起作用，表现为体内致瘤性和侵袭性的增加(29). 先前我们已经表明PKCα与β1整合素在物理上结合，并且PKCα表达的增加促进了乳腺癌细胞的迁移。因此，我们试图（i）确定PKCα上的分子决定簇，该决定簇对赋予细胞定向运动能力至关重要，（ii）确定PKC-α和β1整合素相互作用所需的最小序列，以及（iii）确定PKCα-β1整合素复合物的定点扰动是否会影响乳腺癌细胞的定向运动反应。
我们报告PKCα的RD，或者更具体地说是V3铰链区域内的12氨基酸区域（aa313-325），是决定PKCα驱动的β1整合素依赖性细胞迁移方向性的关键位点。这种活性与PKCα催化结构域无关。体外和完整细胞中的PKC-β1整合素结合也需要V3结构域。关于这个域在PKC中的功能知之甚少。然而，负责PKCα细胞质隔离的最小序列被认为包含在C2-V3区域内(27). 已知福尔波酯刺激可增加结肠癌和乳腺癌细胞的运动活性和触觉反应(16,21). 重要的是，在没有激酶结构域的情况下，PKCα的RD（带V3铰链）足以诱导细胞极化并随后定向细胞向佛波酯梯度运动。然而，在转染MCF-7细胞向β1整合素底物的触觉迁移过程中需要激酶结构域(16). 该模型旨在检测不同背景下的癌细胞迁移，其中PKCα激活是由整合素连接（而非佛波酯）刺激的，似乎需要全长蛋白；可以推测，在这些情况下，其他PKC的激活方式不足以支持RD+V3域的活动。表达PKCαRD+V3的MCF-7细胞也无法向EGF梯度迁移（M.Parsons和T.Ng，未发表的数据），强调了在此背景下的激酶结构域需求。瞬时表达含V3的GFP-PKCαRD结构所赋予的细胞运动方向性可被抗β1整合素阻断抗体而非抗αV整合素抗体特异性消除。这与我们的发现一致，即V3结构域包含靶向PKCα到β1整合素的先决条件结合序列。整合素受体是细胞运动期间参与极化内吞循环的细胞极性蛋白质(5,11,12,16). 我们认为，β1整合素作为一种与V3结构域特异性相互作用的结合蛋白，可以将PKC导向前沿，从而触发肌动蛋白成核和聚合等下游事件(25,26). 事实上，我们的延时实验（电影1和电影2）表明，在缺乏激酶结构域的情况下，当细胞对PDBu刺激作出反应时，我们的两个含V3的PKCαRD结构体可以主动定向地向前缘（富含肌动蛋白的皱褶膜）交通。此外，我们观察到内源性PKCδ也被招募到含有PKCαRD+V3的信号复合物中，以响应PDBu的刺激，这可以解释PKCαRD+V3定向迁移对双吲哚甲酰胺抑制的敏感性。
PKCα与β1整合素胞质结构域的关联是直接的，如（i）纯化的GST-PKCα融合蛋白与β1尾源肽GK21的结合，（ii）在缺乏相关整合素α链的情况下，IL-2R-β1整合素嵌合体与内源性PKCα在体内的关联，以及（iii）FLIM在含V3的GFP-PKCαRD结构和Cy3标记的抗β1整合素IgG Fab片段之间证明FRET。后一种数据将荧光团对置于纳米范围内(9,15-17,19,30). 最近，PKCα还与整合素α3和α6亚基以及跨膜4超家族成员CD81共沉淀，为PKCα-TM4SF-α3/α6β1整合素复合物的存在提供了有力证据(34). 对于这些复合物中的每一个，似乎至少有三个直接相互作用对，结合位点全部或部分确定（PKCα-β1整合素[图。到]，TM4SF-PKCα[34]和TM4SF-整合素[三,13,31])。共沉淀分析表明，β1整合素Cyto-2和Cyto-3氨基酸簇均参与整合素/PKCα复合物的形成。值得注意的是，两个NPXY基序的酪氨酸残基已经被证明对通过整合素底物涂层过滤器响应生长因子趋化梯度的定向细胞迁移很重要(22,23). 我们发现，当作为细胞渗透肽或通过逆转录病毒转导引入细胞时，含有细胞-2和细胞-3的β1尾部序列对定向细胞迁移具有主要抑制作用，这一发现以前尚未报道，并且与这些早期研究一致，这些研究记录了各种NPXYβ1A突变体对细胞定向运动的影响。
本文证明引入含有细胞-2和细胞-3的β1整合素细胞质序列作为一种细胞发酵肽，可以消除PKC介导的乳腺癌细胞的趋化性。GST-PKCαRD+V3在谷胱甘肽珠上与游离GK肽预孵育，而非其搅乱等效物，在体外消除了其与β1整合素结合的能力。除PKCα外，GK肽序列靶向的另一个β1整合素结合蛋白是整合素胞质域相关蛋白1（ICAP-1）(6). 在细胞运动的背景下，需要进一步研究PKCα和ICAP-1与远端β1细胞质区域结合的时间关系。
EGF受体在约40%的乳腺癌中异常表达；通过生长因子受体的信号传导与β1整合素的信号传导相互依赖(28). 细胞渗透性ANT-GK21肽和基于β1整合素的PKCα结合序列的逆转录病毒编码的肽抑制剂均被证明对细胞向EGF的定向运动有效，EGF是这些乳腺癌细胞的病理生理相关化学引诱剂。
在多发性骨髓瘤细胞中也发现了PKCα和β1整合素之间形成的组成性蛋白复合物(20). 当被镀在β1整合素底物上时，这些骨髓瘤细胞可以受到血管内皮生长因子（VEGF）的刺激而迁移，VEGF以磷酸肌醇3-激酶依赖的方式诱导PKCα（而非PKCɛ）膜移位和活化。此外，在这些黑色素瘤研究中，β1整合素阻断抗体和PKC抑制剂双吲哚甲酰胺的使用清楚地说明了PKCα-β1整合素信号复合物在VEGF应答的迁移表型发展中的主导作用。重要的是，我们的新发现明确定义了这种蛋白复合物形成的分子决定因素以及PKC介导的定向细胞运动成分。此外，使用逆转录病毒编码抑制剂的本研究结果证明，PKCα-β1整合素相互作用的干扰将抑制与转移性疾病相关的迁移表型。
致谢
帕森斯先生和凯普勒先生对这项工作的贡献是一样的。
我们特别感谢詹姆斯·莫尼佩尼在延时实验和图像处理期间提供的技术援助。我们感谢约翰·马歇尔和菲奥娜·瓦特审阅了手稿并提出了许多有益的建议。J.Ivaska提供了一种兔抗人β1整合素多克隆抗血清。
这项研究得到了联合王国癌症研究所、联合王国医学研究委员会（以授予T.N.的临床医生科学家补助金的形式）和威康信托基金（M.J.H）的部分支持。
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