前脂肪细胞因子1(Pref-1/Dlk1)是一种含有表皮生长因子(EGF)重复序列的跨膜蛋白,与Notch/Delta/Serrate家族同源(14,22). Pref-1在细胞外区域被裂解,生成可溶性的Pref-1(27). Pref-1在多个胚胎组织中表达,出生后,除前脂肪细胞、胰腺β细胞、胸腺细胞和肾上腺细胞外,其在大多数组织中的表达消失(2,7,11,18). 因此,Pref-1已被多个实验室用作前脂肪细胞标记物(21,33). 组成性Pref-1表达或添加可溶性形式的Pref-1抑制3T3-L1脂肪细胞分化,通过反义表达下调Pref-1促进脂肪生成,表明Pref-1可能在维持前二糖状态中发挥作用(22-27). 在原代培养大鼠前脂肪细胞的脂肪转化过程中,Pref-1的表达也被抑制,而可溶性Pref-1可抑制其分化(7).
基因组印迹,通过DNA甲基化机制,导致印迹基因从母体或父体来源的染色体上差异表达。当两个等位基因都是从父母一方遗传时,这种基因调控的表观遗传控制的扰动(单亲二体[UPD])会导致先天性疾病——母亲UPD7、父亲UPD11和UPD15,分别被描述为Russell-Silver综合征、Beckwith-Widemann综合征和Prader-Willi/Angelman综合征(13,19). 最近,有报道称,由于甲基化差异,Pref-1从父系等位基因表达,而不是从母系等位蛋白表达(20,30,31). 印记基因簇,包括首选-1,日期,全球技术标准2,销钉11,反表皮11、和兆欧8,位于小鼠12号染色体、人类14号染色体和绵羊18号染色体的同步区(三-6,12,30,31). 对小鼠mUPD12和人类mUPD14的研究表明,该染色体区域存在的印记基因对胚胎的生存和生长非常重要,受影响的个体患有包括脊柱侧凸、低张、青春期早期、肥胖和眼睑营养不良在内的畸形(1,5,6,16,29,32). 然而,印迹基因或相关基因及其相关表型尚未确定。
为了进一步明确Pref-1在脂肪生成中的作用,并了解Pref-1对人类mUPD14表型的作用,我们通过靶向缺失产生了Pref-1基因敲除小鼠。我们的研究表明,Pref-1的缺失会干扰胚胎的正常发育、出生后的生长和脂肪沉积的体内平衡。缺乏Pref-1会导致加速肥胖,类似于人类mUPD14患者出现生长缺陷和肥胖的情况。因此,我们目前的研究确定首选-1作为负责小鼠mUPD12和同系人mUPD14大多数印迹相关表型的基因。
材料和方法
Pref-1-null小鼠的产生。
12千字节Xba公司我-Xba公司通过用全长小鼠筛选129/SvJ文库,分离出I片段小鼠基因组克隆首选-1用作探针的cDNA。基因组首选-1等位基因被新霉素抗性盒(NEO)破坏。靶向结构包含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和pPNT-NEO片段,该片段取代了1.5kb英国标准协会我-生态RI基因组片段首选-1对应于外显子2至外显子3区域的基因。目标构造用线性化巴姆HI和通过电穿孔导入SvJ129胚胎干细胞。通过Southern blotting筛选G418-和更昔洛韦耐药克隆进行同源重组,272个克隆中有5个克隆突变基因阳性。将阳性克隆显微注射到3.5天的C57BL/6J或BALB/c囊胚中,以产生嵌合体动物。随后通过如下所述的Southern印迹法或用从小鼠尾部分离的基因组DNA进行PCR对动物进行基因分型。野生型等位基因的PCR引物为5′引物5′-GCATCAAGACACACACACCAAAATG-3′和3′引物5'-ATTGACACAGCAGGGCAGTACTAC-3′,目标等位基因引物为5'引物5’-GCAGCTGCTCGACGTTC-3′和3'引物5'-CGCAAGCTCTTCAGCATACAC-3′。在94°C初始变性1分钟后,进行35次94°C变性1分钟、57°C退火1分钟和72°C延伸1分钟的循环。通过标准程序从四个独立的Pref-1-null ES细胞系中产生雄性嵌合体小鼠(9). 将来自每个细胞系的雄性与C57BL/6J或BALB/c雌性交配,从每个细胞系获得Pref-1突变的生殖系传递。为了排除观察到的Pref-1-null表型由混合遗传背景(SVJ129×C57BL/6J)引起的可能性,将来自靶向等位基因生殖系传播的小鼠回交到C57BL/6J背景上4至9代,并进行同胞杂交以获得纯合null小鼠。我们使用年龄匹配的野生型C57BL/6J小鼠作为对照小鼠,因为Pref-1杂合子杂交产生的野生型同窝小鼠具有混合遗传背景(SVJ129×C57BL/6J)。还产生了回交到BALB/c背景上的小鼠。除眼睑研究外,在C57BL/6J背景下对Pref-1-null动物进行了实验。这些实验是根据加州大学伯克利分校动物护理和使用的动物实验指南进行的。
ES细胞和小鼠的Southern blot分析。
用酶消化ES细胞和小鼠尾部活检的基因组DNA生态RI或生态RI公司-Hin公司dIII限制性内切酶,在1%琼脂糖凝胶上分馏并印在Hybond N上+尼龙膜(Amersham)。用5′和3′外探针证实了同源重组Pst(磅/平方英尺)我-Bgl公司II片段和a巴姆嗨-Xba公司I片段。
Northern印迹分析和RT-PCR。
用Trizol试剂(Invitrogen)从小鼠组织中分离出总RNA。对于Northern印迹,总RNA(15μg)在1.2%琼脂糖甲醛凝胶上电泳,并转移到Hybond N上+尼龙膜。在UV交联后,膜与[∏-32P] 用ExpressHyb杂交液(Clontech)标记脂肪酸合成酶(FAS)和硬脂酰辅酶A(CoA)去饱和酶(SCD-1)的dCTP cDNA探针。在室温下,在2×SSC(1×SSC是0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠)和0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)的混合物中进行杂交后洗涤40分钟,在50℃下在0.1×SSC和0.1%SDS的混合物中洗涤30分钟。对于逆转录-PCR(RT-PCR),根据制造商的规范,使用寡核苷酸(dT)引物和上标II逆转录酶(Invitrogen)逆转录5μg总RNA。将两微升cDNA样品用作PCR模板。gtl2型利用引物5′-ATGTGGACCAAGACTG-3′和5′-GAAGCACCATGAGCCACTA-3′对胚胎或白色脂肪组织进行cDNA扩增,分别在95℃变性45s、54℃退火45s、72℃延伸30s。用引物5′-AGACTGAATGGCTGATGGCA-3′和5′-GAAGGAATGGTGTGA-3′扩增亲环素cDNA 18个周期,95℃变性45s,54℃退火45s,72℃延伸30s。
蛋白质印迹分析。
从纯合Pref-1缺失或杂合胚胎(胚胎发育第17.5天[E17.5])中提取总蛋白。胚胎在60mM Tris-HCl(pH 6.8)、1%SDS和0.5mM苯甲基磺酰氟的混合物中裂解,并超声处理1分钟。裂解物以12000×克持续3分钟,用Bradford法测定上清液中的蛋白质浓度。为了确保等效负载,每个样品中等量的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),并在西方分析之前用考马斯蓝染色凝胶以确认数量。蛋白质样品在Laemmli缓冲液中煮沸5分钟,然后在SDS-PAGE凝胶(11%聚丙烯酰胺)上电泳。然后将蛋白质转移到硝化纤维素膜上,用5%脱脂干乳在Tris-buffered saline-Tween 20(TBST)缓冲液(10 mM Tris-HCl[pH8.0],165 mM NaCl,0.05%Tween 20])中封闭膜。在封闭缓冲液中用抗Pref-1抗体(1:3000稀释度)探测膜1 h,用TBST洗涤,并用辣根过氧化物酶(Bio-Rad)标记的抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体1:5000稀释度反应1 h。清洗后,用增强化学发光系统(NEN生命科学)显影印迹,并通过放射自显影术进行可视化。
生长曲线和生理测量。
小鼠在21天大时断奶后,可随意喂食高脂肪饮食(45 kcal%的脂肪来自猪油和大豆油,35 kcal%碳水化合物来自玉米淀粉和麦芽糊精,20 kcal%蛋白质来自酪蛋白)(D12451;Research Diets,Inc.,New Brunswick,N.J.),并每隔4天称重以监测生长。在16周龄时,在13:00至15:00之间处死小鼠进行组织解剖和血液样本。通过心脏穿刺采集血液,以2000×克,并在测量代谢物之前储存在−20°C。分别用甘油三酯(INT)10和英菲尼迪胆固醇试剂(Sigma)分析血清甘油三酸酯和胆固醇水平。用NEFA C(Wako Chemicals)测定血清游离脂肪酸水平。对于统计分析,学生t吨使用了测试,并且P(P)<0.05的值被认为是显著的。
组织学分析。
腹股沟脂肪被固定在Bouin的液体中(LabChem,Inc.),并通过一系列酒精处理进行脱水。组织用石蜡包埋,切片成8-μm切片,并用苏木精和伊红染色(Fisher)。使用NIH Image软件进行图像采集和脂肪细胞大小测量。
骨染色.
将胚胎或小鼠取出内脏,并在90%乙醇中固定至少1周。软骨染色用0.01%阿尔西安蓝(Sigma)在80%乙醇和20%冰醋酸中染色。然后用一系列70%、40%和15%的乙醇培养液对样品进行再水化处理,每次培养2小时。对于骨染色,样品在1%氢氧化钾中与0.001%茜素红(Sigma)孵育5天。用1%氢氧化钾多次冲洗后,将样品储存在甘油中。
结果
Pref-1-null小鼠的产生。
为了确定Pref-1在生长和脂肪生成中的作用以及Pref-1对小鼠mUPD12和人类mUPD14综合征的作用,我们使用基因靶向产生Pref-1缺失小鼠。基因组首选-1通过将新霉素抗性盒插入首选-1(图。). 筛选G418和更昔洛韦抗性克隆进行同源重组,并将阳性克隆微注射到3.5天的C57BL/6J或BALB/c胚泡中以产生嵌合动物。获得了每个克隆的生殖系传递,并且没有观察到不同品系之间的后续差异。雄性嵌合体与C57BL/6J或BALB/c雌性嵌合体交配,产生Pref-1杂合子(+/-)。Pref-1的交叉口+/−小鼠产生Pref-1-null小鼠。在F中检测到野生型(7.0或5.5kb)、杂合子(7.0和5.2kb或7.3和5.5kbs)或纯合子(5.2或7.3kb)Pref-1等位基因2F交配产生的幼崽1杂合子(图。B) ●●●●。为了证实Pref-1缺失胚胎(E17.5)中没有正常的Pref-1蛋白,我们用我们用细菌表达的小鼠Pref-1免疫兔子制备的鼠Pref-1多克隆抗体进行了Western blot分析(25). 图研究表明,在野生型胚胎中,Pref-1抗体检测到多种形式的Pref-1蛋白,我们之前已经证明其来源于选择性剪接和翻译后修饰(25). 纯合胚胎中未检测到Pref-1蛋白。
有针对性地中断首选-1基因。(A) 上图是野生型的示意图首选-1具有五个外显子的等位基因。Pref-1外显子由黑箱表示。中间的图显示了分别以pPNT-NEO和胸苷激酶(TK)作为阳性和阴性选择标记的靶向结构。下图显示了首选-1同源重组突变的等位基因。指出了用于Southern blot分析的探针和检测到的限制性片段的大小。E、,生态RI;H、,Hin公司dIII;X、,Xba公司I.(B)Southern blot分析生态RI-cut(3′探头)和生态RI公司-Hin公司从F制备的dIII-cut(5′探针)小鼠尾部DNA2F相互作用产生的小鼠1杂合子(首选-1+/−). 7.0-kb和5.5-kb带代表野生型等位基因,5.2-kb带和7.3-kb带表示首选-1-无效等位基因。(C) 胚胎Pref-1的Western blot分析(E17.5)。使用抗小鼠Pref-1的多克隆抗体。胚胎是通过杂交产生的首选-1杂合子。通过选择性剪接和翻译后修饰(括号内)产生的多种形式的Pref-1在野生型中检测到,但在纯合型中未检测到(首选-1−/−)胚胎。*,非特异性条带,表明样品负载量相等。
缺乏Pref-1的小鼠表现出出生前和出生后生长迟缓、眼睑和骨骼异常。Pref-1-null小鼠的平均窝产仔数显著降低(每窝4.26±0.26只幼崽,n个=25)比野生型小鼠(每窝6.75±0.32只幼崽,n个= 27,P(P)<0.001),表明Pref-1在胚胎发育中起重要作用。我们还测量了Pref-1杂合子杂交产生的小鼠在E18.5时的胚胎大小。Pref-1-null胚胎(0.96±0.004 g,n个=9)在E18.5时小于野生型同窝卵(1.18±0.003 g,n个= 12,P(P)<0.0001)(图。). 大约50%的空白小鼠在出生后2天内死亡,这表明Pref-1对围产期生长和存活至关重要。我们观察到野生型雌性和Pref-1缺失或杂合雄性小鼠交配产生的幼崽的新生儿死亡率相似,如下所述,这些小鼠不表达Pref-1。这表明存活率完全取决于幼崽的表型,而不是母亲的表型。我们还发现了骨骼畸形,包括肋骨到胸骨的不对称连接以及胚胎和出生后死亡小鼠肋骨的融合(图。). 骨骼异常和肺部缺陷,以及由这些缺陷引起的其他问题,如哺乳能力差,可能是导致在空白小鼠中观察到的出生后高死亡率的原因(8). 如图所示。,Pref-1-null小鼠也表现出眼睑异常,类似于在个体中观察到的眼睑萎缩,14q32处缺失,与首选-1mUPD14患者的基因座或(29,32). 然而,这是菌株依赖性的,在BALB/cJ背景下的Pref-1-null小鼠中观察到,但在C57BL/6J背景下没有观察到。
缺乏Pref-1的小鼠出生前和出生后生长迟缓和眼睑异常。(A) 宫内生长迟缓。在E18.5,Pref-1-null胚胎比野生型胚胎小。胚胎由Pref-1杂合子(+/-)杂交产生。(B) 眼睑营养不良。27天龄小鼠的前视图显示在BALB/cJ菌株背景下观察到的左眼睑或双眼眼睑缺陷。(C) 骨骼畸形。箭头显示Pref-1-null小鼠胸骨不对称锯齿状,肋骨融合。(D) C57BL/6J背景Pref-1-null小鼠的生长迟缓。雌性和雄性野生型和Pref-1-null小鼠(n个=27至37个/组),从21天起随意喂食高脂肪(45 kcal%)饮食,每隔4天称重一次。使用双尾进行统计t吨测试。对于雌性小鼠从第21天至第68天,P(P)<0.01,从第72天到第76天,P(P)< 0.05. 对于雄性小鼠,从第21天到第52天,P(P)< 0.01.
断奶时,雌性和雄性Pref-1-null小鼠的体重均低于野生型小鼠(雌性,7.34±0.21 g,n个分别为8.51±0.19克,n个= 27,P(P)< 0.0001; 雄性,7.58±0.25克,n个=36,与8.81±0.21克相比,n个= 37,P(P)分别<0.0001)。最初,在3周龄断奶后,给小鼠喂食常规的食物。在15周龄时,我们发现Pref-1-null小鼠存在生长迟缓,脂肪垫质量中等偏大(数据未显示)。为了更清楚地观察Pref-1对脂肪组织发育的影响,我们对喂食高脂肪(45 kcal%)饮食的小鼠进行了所有后续研究,如材料和方法所述。Pref-1-null小鼠在断奶后的即刻阶段,高脂肪饮食的体重增加速度较慢。然而,如图所示。在大约90天时,雌性和雄性的体重都在追赶。到16周龄时,零型和野生型小鼠的体重没有差异(雌性,24.94±0.99 g,n个=14,与25.35±0.50克相比,n个= 11; 雄性,35.60±0.97克,n个=14克,与35.72±0.37克相比,n个= 16). 这些数据向我们表明,在这一后期阶段,体重加速增加可能是由于脂肪组织质量增加所致。
缺乏Pref-1的小鼠肥胖增加。
我们研究了在后期观察到的空白小鼠的加速体重增加是否是由于脂肪堆积所致。在早期(8周),空白小鼠和野生型小鼠(雌性,3.80%±0.37%,n个=7,与3.33%±0.62%相比,n个= 10,P(P)= 0.2061; 男性,3.17%±0.33%,n个=7,与3.12%±0.34%相比,n个= 4,P(P)= 0.9286). 然而,如图。16周龄时,雌性Pref-1基因敲除小鼠喂食高脂肪饮食(45 kcal%)13周后的白色脂肪垫(以体重百分比表示)重量显著高于野生型小鼠(腹股沟2.34%±0.2%对1.64%±0.1%,P(P)= 0.0182; 腹膜后,1.50%±0.1%对0.90%±0.1%,P(P)= 0.0096; 参数试验,3.16%±0.5%对1.78%±0.2%,P(P)= 0.0296; 棕色脂肪分别为0.29%±0.01%和0.22%±0.01%,P(P)=0.0045)为空(n个=10)与野生型(n个=7)小鼠。图此外,除附睾脂肪垫外,Pref-1基因缺失雄性小鼠的所有区域都观察到脂肪垫质量的类似增加。与脂肪垫重量相比,Pref-1-null小鼠在后期的其他器官重量,包括肺和肾,没有赶上,但仍然小于野生型小鼠。有趣的是,如表所示,Pref-1-null小鼠出现肝脏肿大(雌性,4.41%±0.13%,n个=9,与3.77%±0.08%相比,n个= 7,P(P)= 0.001; 男性,4.10%±0.14%,n个=7,对3.60%±0.12%,n个= 7,P(P)=0.0224),总脂质含量增加(雌性,8.77±0.57 mg/g肝脏,n个=4,而肝脏为5.76±0.31 mg/g,n个= 7,P(P)= 0.0046; 男性,10.73±0.69 mg/g肝脏,n个与8.35±0.44mg/g肝脏相比,n个= 5,P(P)= 0.0239).
缺乏Pref-1的小鼠的加速肥胖。(A) 脂肪垫和器官重量相对于体重的百分比。从喂食高脂肪饮食的16周龄野生型(WT)和Pref-1-null小鼠中解剖脂肪库和器官(n个=每组7至10)。腹股沟脂肪垫;附睾脂肪垫;腹膜后脂肪垫;对位。,子宫旁脂肪垫;BAT,棕色脂肪组织。所有值均为平均值±标准误差。*,P(P)< 0.05; ∗∗,P(P)< 0.01. (B) 16周龄雌性小鼠腹股沟脂肪垫石蜡切片及脂肪细胞大小分布。用NIH Image软件测定每个样品至少300个细胞的大小(每组四只小鼠的平均值)。显示了细胞体积的分布。比例尺代表50μm。(C) 脂肪组织和肝脏中脂肪细胞标记基因的表达。从喂食高脂肪饮食的16周龄野生型(W)和Pref-1-null(N)小鼠的脂肪组织中提取总RNA。
表1。
野生型和Pref-1-null小鼠的产仔数、胚胎和体重、脂肪垫重量、脂质代谢产物以及肝脏中的总脂质含量一
变量 | 性别 | “鼠标”组
|
---|
野生型 | 前缀-1空 |
---|
产仔量(幼崽数/窝) | | 6.75 ± 0.32 (27) | 4.26 ± 0.26 (25)d日 |
体重(g) | | | |
图18.5 | | 1.18 ± 0.003 (12) | 0.96 ± 0.004 (9)d日 |
3周 | 女性 | 8.51 ± 0.19 (27) | 7.34 ± 0.21 (32)d日 |
| 男性 | 8.81 ± 0.91 (27) | 7.58 ± 0.25 (37)d日 |
16周 | 女性 | 25.35 ± 0.50 (11) | 24.94 ± 0.99 (14) |
| 男性 | 35.72 ± 0.37 (16) | 35.60 ± 0.97 (14) |
脂肪垫重量(身体重量的%)b条 | | | |
8周 | 女性 | 3.33 ± 0.62 (10) | 3.80 ± 0.37 (7) |
| 男性 | 3.12 ± 0.34 (4) | 3.17 ± 0.33 (7) |
16周 | 女性 | 4.32 ± 0.38 (7) | 6.70 ± 0.50 (9)e(电子) |
| 男性 | 6.69 ± 0.49 (7) | 8.39 ± 0.29 (7)e(电子) |
血液代谢物 | | | |
甘油三酯(mg/L) | 女性 | 8.82 ± 0.70 (5) | 12.0 ± 1.20 (6)(f) |
| 男性 | 11.1 ± 0.70 (5) | 19.6 ± 2.30 (6)e(电子) |
胆固醇(mg/L) | 女性 | 8.37 ± 0.63 (5) | 11.7 ± 1.34 (6)(f) |
| 男性 | 13.2 ± 0.54 (5) | 16.94 ± 0.85 (6)e(电子) |
游离脂肪酸(mmol/l) | 女性 | 1.56 ± 0.08 (5) | 1.79 ± 0.10 (6) |
| 男性 | 1.66 ± 0.14 (5) | 2.23 ± 0.18 (6)(f) |
肝脏中的脂质含量(mg/g肝脏)c(c) | 女性 | 5.76 ± 0.31 (7) | 8.77 ± 0.57 (4)e(电子) |
| 男性 | 8.35 ± 0.44 (5) | 10.73 ± 0.69 (5)(f) |
接下来,我们确定Pref-1-null小鼠的脂肪量增加是由于细胞肥大还是增生所致。尽管空白小鼠的脂肪垫重量高于野生型小鼠,但总DNA含量(表示脂肪组织中包括前脂肪细胞和脂肪细胞的总细胞数)没有差异(表). 如图所示。与野生型小鼠相比,16周龄雌性小鼠的石蜡切片染色和腹股沟脂肪垫的细胞大小分布检查显示Pref-1-null的脂肪细胞大小增加,表明肥大。此外,与野生型小鼠相比,Pref-1缺失小鼠脂肪细胞分化晚期标记物FAS和SCD-1的mRNA水平增加,表明脂肪细胞分化增强(图。). 我们还发现,Pref-1-null小鼠的脂肪肝增大显示FAS和SCD-1表达增加,这通常伴随着肝脏脂肪生成和脂肪合成的增加。
Pref-1仅由父系等位基因表达。
由于Pref-1仅由父系等位基因表达,因此具有母系或父系遗传的杂合子首选-1基因敲除等位基因(米−/+或+/第页−)应分别具有与野生型或空白小鼠相似的表型。具体来说,男性或女性首选-1杂合子(+/-)与野生型小鼠交配。图中E17.5胚胎的Western blot分析。表明Pref-1蛋白的表达在父系遗传杂合子中完全消失首选-1基因敲除等位基因(+/第页−). 另一方面,母体遗传的杂合子首选-1敲除等位基因(米−/+)以与野生型动物相似的水平表达Pref-1蛋白。这些结果清楚地表明,Pref-1仅由父系等位基因表达。这些动物的体重(米−/+; +/第页−)在第21天和第56天的时间点进行检测,在这两个时间点,我们证明Pref-1-null小鼠的体重显著下降。图说明,正如预测的那样,在21天大的时候,Pref-1杂合子与父亲遗传的首选-1基因敲除等位基因(+/第页−)表现出与我们观察到的Pref-1-null小鼠相同的生长迟缓[雌性,9.13±0.25 g,n个=9(+/+)对6.66±0.17克,n个= 5 (+/第页−),P(P)< 0.0001; 雄性,9.71±0.43克,n个=7(+/+)对7.51±0.17克,n个= 7 (+/第页−),P(P)< 0.0001]. 相反,母体等位基因断裂的杂合子(米−/+)的生长速度与野生型同窝卵的生长速度相同。在3至16周龄的雄性小鼠喂食高脂肪饮食后,对其脂肪垫重量(腹股沟、生殖和肾周脂肪垫的总和)进行检测时,父系遗传的杂合子首选-1基因敲除等位基因(+/第页−)与野生型窝友相比,脂肪垫重量增加了45%(米+/−, 9.45% ± 0.7%,n个= 5; 与米+/+, 6.50% ± 0.7%,n个= 6,P(P)=0.0129),与我们观察到的Pref-1-null小鼠相同(图。). 相反,母体遗传的杂合子首选-1基因敲除等位基因(米−/+)没有增加。因此,Pref-1缺失小鼠的早期生长迟缓和增加的脂肪量都是Pref-1父亲印记的结果。
母系或父系遗传的小鼠首选-1-基因敲除等位基因(米−/+或+/第页−)分别具有与野生型或空白小鼠相似的表型。(A) 雄性杂合子(+/-)和雌性野生型小鼠交配产生的E17.5胚胎中的Pref-1蛋白表达,反之亦然。Pref-1蛋白表达于米−/+杂合子,但不在+/第页−杂合子。(B) F的体重1在21日龄和56日龄时对同窝婴儿进行了测量。数值为平均值±标准误差n个=每组5至13人。*,P(P)< 0.05; ∗∗,P(P)< 0.01. (C) 脂肪垫重量(总白色脂肪,包括腹股沟、腹膜后和生殖脂肪)相对于体重的百分比(16周龄;n个=每组7至9人)。所有值均为平均值±标准误差。*,P(P)< 0.05. 使用双尾进行统计t吨测试面板B和C。
在包括Pref-1的簇中,印迹基因的表达调控是相当复杂的。Gtl2和Pref-1的表达方式与免疫球蛋白2/H19基因座(10). 因此,我们检查了全球技术标准2在Pref-1-null小鼠中,发现全球技术标准2在空白小鼠和野生型小鼠之间相似(图。). 这些数据表明首选-1基因组(外显子2和3的一部分)新产生Pref-1缺失小鼠的盒,不影响相邻相互调节印迹基因的表达,全球技术标准2我们得出结论,我们在Pref-1缺失小鼠中观察到的表型可能完全归因于缺乏Pref-1表达。
表达式全球技术标准2野生型和Pref-1-null小鼠的基因。的表达式全球技术标准2通过RT-PCR从全胚胎(E15.5)或白色脂肪组织(WAT)(16周)中检测。作为定量基因表达的参考,亲环素在与用于全球技术标准2.
Pref-1-null小鼠中脂质代谢产物水平的增加。
为了确定Pref-1基因敲除小鼠脂肪垫重量的增加是否反映在血脂代谢产物的水平上,我们评估了3至16周龄喂食高脂肪饮食的Pref-1蛋白敲除小鼠的甘油三酯、游离脂肪酸和胆固醇水平。Pref-1-null雌性和雄性小鼠的血清甘油三酯分别显著升高了36%和77%(图。). Pref-1-null雄性小鼠在喂食状态下的游离脂肪酸水平升高了34%(图。). 雌性小鼠和雄性小鼠的胆固醇水平也分别升高了21%和28%(图。). 高胆固醇血症和高脂血症,以及肥大的脂肪肝,表明Pref-1-null小鼠抗脂肪生成作用的丧失扰乱了脂质代谢的稳态。
缺乏Pref-1的小鼠的血脂代谢水平改变。(A、B和C)在16周龄的Pref-1-null和野生型(WT)小鼠中测量血清中的甘油三酯、游离脂肪酸和胆固醇水平,这些小鼠在3至16周期间进食高脂肪饮食。数值为平均值±标准误差n个=每组5至8人。使用双尾进行统计t吨测试*,P(P)< 0.05; ∗∗,P(P)< 0.01.
讨论
通过产生Pref-1敲除小鼠,我们证明了Pref-1在生长发育、围产期生存和脂肪发育中的作用。此外,母系或父系遗传的杂合子首选-1-基因敲除等位基因(米−/+或+/第页−)分别显示了Pref-1的表达模式和与野生型或空白小鼠相似的表型特征,为Pref-1父亲单等位基因表达提供了直接证据。
印迹被证明依赖于可激活或抑制表达的等位基因特异性DNA甲基化,而印迹基因通常在簇中发现,在簇中它们通常受到协调控制。在母亲UPD的情况下,父亲表达的基因可能不表达,而母亲表达的基因则可能过度表达。在所有可能的UPD中,只有一小部分被证明具有特定的表型效应或印迹效应。最近在小鼠12号染色体和人类14号染色体的一个同步区发现了一组印记基因(1,5,6,8). 在这个轨迹上首选-1,销钉11、和日期基因是父系表达的,而全球技术标准2,反表皮11、和兆欧8基因是母体表达的(三). 然而,在小鼠mUPD12或人类mUPD14中观察到的表型是否可归因于该区域的特定基因尚未研究。首选-1和销钉11是mUPD相关表型的最可能候选基因,因为该区域中的其他印记基因编码非翻译RNA。然而,非翻译转录物也可能作为RNA效应分子,以类似于Air的方式调节基因表达(用于反义igf2抗体RNA)转录物胰岛素样生长因子2受体基因(15). Pref-1-null小鼠和人类mUPD14的重叠表型表明,人类mUPD24的肥胖、骨骼畸形、眼睑营养不良和生长迟缓(1,5,8,16)可归因于Pref-1。另一方面,在mUPD14中观察到的低张力和青春期早期表型在Pref-1-null小鼠中不明显,因此可能是由另一个印迹基因的错误表达引起的,可能销钉11为了进一步研究mUPD表型的确切基因,有必要产生Peg11基因敲除或Pref-1-和Peg11双敲除小鼠。总的来说,我们的研究首次揭示了小鼠12号染色体上印迹区域的表型相关性。此外,如我们的研究所示,父代表达的Pref-1在胚胎发育过程中充当生长调节剂的事实支持基因组冲突模型,其中父代表达基因将促进生长,而母系表达基因将抑制生长(17).
我们之前的研究表明,Pref-1在体外抑制3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞的分化(22-28). 我们的数据表明,Pref-1-null小鼠体重增加的加速主要是由于后期脂肪增加所致。脂肪组织检查表明,脂肪细胞分化增强和脂肪细胞成熟增强都有助于Pref-1-null小鼠脂肪质量的增加。mUPD14中经常观察到肥胖(1,16). 因此,Pref-1-null小鼠的脂肪质量增加与人类mUPD14肥胖表型相似。有趣的是,据报道,愈伤组织(clpg公司)绵羊的基因突变导致瘦肉动物肌肉肥大,过度表达了两个父亲印记的基因,首选-1和销钉11(4). 鉴于我们发现Pref-1基因缺失小鼠的脂肪组织质量增加,可以预测clpg公司绵羊可能是由于Pref-1的抗脂肪生成作用。这与我们之前对Pref-1在脂肪细胞分化中的体外研究结果一致:(i)其在脂肪生成过程中消失,(ii)通过组成性表达Pref-1抑制3T3-L1脂肪细胞分化,以及(iii)通过反义增强分化首选-1.
总之,目前的研究表明,Pref-1对围产期生存、正常生长和脂肪沉积的动态平衡非常重要。我们建议首选-1通过基因敲除或通过Pref-1杂合子的印迹状态(+/第页−)导致新生儿期出现不良反应。在成年期,Pref-1的缺失会导致加速肥胖,与人类mUPD14患者的表现型相似,这些患者表现出生长缺陷和肥胖。我们目前的研究也表明首选-1作为负责小鼠mUPD12和同系人mUPD14大多数印迹相关表型的基因。