MRN复合体：协调和介导对染色体断裂的反应

摘要

介绍

DNA损伤，如双链断裂（DSB），对基因组完整性和细胞生存构成了相当大的威胁。DSB在正常DNA处理过程中自发产生（例如，在DNA复制和减数分裂过程中），并可由多种DNA损伤剂（例如，癌症治疗剂，如电离辐射（IR）和博莱霉素）诱导。检查点信号通路需要最初检测DSB，放大该信号并将其转导以产生适当的生物反应。这些反应包括诱导转录程序、防止进入S期（G1/S检查点）、减缓正在进行的DNA合成（S内检查点），在G2和M期触发检查点，以及在存在低至中度DNA损伤的情况下，通过修改和激活特定修复因子来增强修复机制。或者，如果损伤无法修复或存在过多损伤，也需要检查点信号来诱导凋亡细胞死亡。DSB修复的两种主要机制是非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR；巴恩斯，2001;范登博世等., 2002)。这些机制的故障可能导致基因组中原本相距较远的DNA末端融合，从而产生染色体重排，如反转、易位和缺失。由此导致的基因表达中断可能扰乱正常细胞增殖或导致细胞死亡。

MRN复合体与DNA损伤的修复

高度保守的MRE11–RAD50–NBS1（MRN）复合体被认为在DSB的传感、处理和修复中起着关键作用，MRE11和RAD50的同源物在所有分类王国中都有发现。MRE11蛋白具有氨基末端磷酸酯酶基序和两个DNA结合基序(图1A)。RAD50包含核苷酸结合所需的Walker A和B基序，并由分子内相互作用所需的两个线圈区域分开(德贾格尔等., 2001;霍普夫纳等., 2001;图1A、B)。人类建筑的最新研究糠秕热球菌MRE11–RAD50（MR）复合物表明，它们在通过RAD50的线圈区域桥接DNA末端，以及可能的姐妹染色单体方面具有结构作用。Cys-X-X-Cys基序位于RAD50分子内螺旋结构域的中间，作为两个RAD50臂之间的二聚结构域发挥作用(图1B;霍普夫纳等., 2002)。在真核细胞中，MR复合物与第三种多肽相互作用，在酵母中称为Xrs2，在脊椎动物细胞中称为NBS1。NBS1与MRE11相互作用，但其在MRN复合体中的确切位置尚待确定。这种95-kDa蛋白的N末端区域包含两个不同的结构域，这两个结构域通常存在于细胞周期检查点和DNA损伤反应蛋白中：FHA（叉头相关）结构域和BRCT（BRCA1羧基末端）结构域(图1A)。其他蛋白质中的FHA结构域被证明具有特定的磷酸-残留结合结构域的功能，而BRCT结构域也被认为可以介导蛋白质-蛋白质的相互作用，例如，酵母Rad9检查点蛋白的寡聚(Soulier和Lowndes，1999年).

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图1

人类MRE11–RAD50–NBS1复合体。(A类)MRE11、RAD50和NBS1蛋白。指出了每个蛋白质的已知结构域。氨基末端在左边。(B类)MRE11–RAD50–NBS1（MRN）复合体的结构。MRN复合体通过MRE11蛋白与DNA末端结合，RAD50的线圈臂向外延伸，并在突破Cys-X-X-Cys（CXXC）基序的另一侧与MRN复合物相互作用。为了清楚起见，显示了两个MRN复合物，但许多MRN分子被认为围绕DSB聚集。RAD50臂之间的许多分子间相互作用统称为“分子Velcro”(德贾格尔等., 2001)。A和B，分别是Walker A和B基序；氨基酸；BRCT，BRCA1羧基末端结构域；FHA，叉头关联域。

除了MRN复合体的DNA结合和桥接功能外，在体外研究表明这种复合物具有酶的作用。生化实验表明磷酸酯酶结构域(图1A)MRE11的功能是作为单链和双链DNA内切酶，以及3′-5′dsDNA外切酶（有关综述，请参阅D'Mours&Jackson，2002年)。RAD50和NBS1/Xrs2刺激MRE11的酶活性，MRE11也受ATP调节(Paull和Gellert，1999年)。RAD50与ATP的结合促进MR复合体与3′末端的结合，此外，还需要ATP水解来刺激DNA发夹的断裂，诱导DNA解链活性并改变内切酶的特异性(Paull&Gellert，1999年;德贾格尔等., 2002)。其中一个或多个在体外核酸酶活性可能与DNA复制过程中形成的发夹结构的降解有关(洛巴切夫等., 2002;Mirzoeva&Petrini，2003年).

MRN复合体与疾病

MRN复合体的酵母等效物（称为MRX）的成分失活会影响大量DNA代谢过程，如HR、NHEJ、端粒维持、减数分裂DSB的形成、从减数分裂的DSB中去除Spo11、DSB的处理和检查点调节(范登博世等., 2002)。这表明该复合物参与了许多，也许是所有涉及DSB的DNA代谢过程。因此Mre11，Rad50和编号1在小鼠中导致胚胎死亡(肖维弗（Xiao&Weaver），1997年;罗等., 1999;朱等., 2001)。然而，可行的低形态半径50和编号1最近描述了等位基因(折弯机等., 2002;威廉姆斯等2002年;康等., 2002)。在人类细胞中，MRN复合体是DSB反应的核心的观点得到了以下观察结果的支持：MRE11型导致共济失调-扩张样疾病（ATLD）和国家统计局1导致奈梅亨断裂综合征（NBS）。这两种疾病都与共济失调-扩张症（AT）有关，AT是由自动取款机基因。自动取款机编码一种蛋白激酶，在DSB诱导后立即激活，是所有已知细胞对这种损伤反应的中心调节器(Shiloh，2003年)。AT患者患有小脑变性，这会导致严重的神经运动功能障碍免疫缺陷、胸腺和性腺萎缩，他们容易患癌症（尤其是淋巴瘤）。AT患者产生的细胞对DSB诱导剂极为敏感，其特点是染色体不稳定和抗辐射DNA合成（RDS），这表明无法完全诱导期内检查点。ATLD患者发展为AT的大多数特征，尽管处于晚期且进展较慢。NBS的特征是免疫缺陷、小头、精神缺陷、基因组不稳定、辐射敏感性和急性淋巴恶性肿瘤倾向。NBS表型与AT和ATLD表型有显著重叠，但小脑未发生变性。最近RAD50型因此，MRN复合体的所有三个成分都与相关的致癌疾病有关，加强了该复合体在维持基因组稳定性中的中心作用。

MRN复合体和ATM之间的功能链接

ATLD、NBS和AT患者的症状相似，表明MRN复合体和ATM之间存在功能联系。然而，在细胞水平上，at细胞的RDS程度大于NBS和ATLD患者的细胞。这表明自动取款机AT的突变更具渗透性，或者ATM激活了有效DSB反应所需的平行通路，其中一条或多条通路独立于MRN。支持后一假设的最新证据是，激活S内检查点需要依赖于ATM的MRN复合体磷酸化，而依赖ATM的，检测点激酶2（CHK2）的MRN非依赖性磷酸化激活一条平行通路，在DSB诱导剂治疗中抑制DNA合成(福克等2002年)。然而，其他研究表明，在某些情况下，激活CHK2需要NBS1(布谢米等., 2001)。这种差异的原因尚不清楚，但可能与使用的辐射剂量和/或细胞系的来源有关。ATM和MRN之间另一个有趣的联系是SMC1，它是S期姐妹染色单体内聚所需的内聚蛋白复合体的一个组成部分(平野，2002)。ATM通过IR诱导的SMC1磷酸化依赖于NBS1，并且是抑制DNA合成所必需的(基姆等., 2002;亚兹迪等., 2002)这表明姐妹染色单体凝聚力的调节可能对DSB发生后的检查点调节很重要。

当以下任一情况发生时，会产生类似的细胞和全动物表型自动取款机或者编码MRN复合物的组分的基因发生突变表明MRN复合物可能对ATM激活的DSB特异性组分具有中心重要性。事实上，ATM和NBS1之间的相互作用已经显示出来（赵等., 2000;盖特等., 2000)。此外，ATM磷酸化NBS1（主要在Ser 278和Ser 343）以响应DNA损伤，这是激活S期检查点所需的事件(林等., 2000;赵等., 2000)。ATM被招募到DSB后，被认为通过磷酸化G1/S、intras和G2/M检查点、DSB转录反应、诱导DSB修复所需的底物，或在修复不完全的情况下，通过磷酸化凋亡来协调DSB反应。

Foci和DSB响应

对DSBs的细胞反应包括以动态组织和及时的方式将复杂的蛋白质阵列定位到病变周围的区域。这些蛋白质形成一个非常大的、重叠的多组分集合，称为焦点(奈姆斯等., 1998)。已描述了两类主要的DSB依赖性病灶：小的早期病灶，通常在细胞中观察到，暴露于DNA损伤剂后10分钟至8小时；以及较大的晚期病灶，这些病灶在4小时后开始出现，并持续到治疗后至少24小时(微波激射器等., 1997)。目前，损伤诱导病灶的生理作用尚不清楚，但DSB附近的蛋白质隔离对于放大损伤诱导的检查点信号和促进持续损伤的修复可能很重要。特别是晚期病灶可能会标记出特别持久且难以修复的病灶的位置。

最近定义的介体蛋白类的成员，包括原型酵母检查点蛋白Rad9、乳腺癌相关蛋白1（BRCA1）、p53结合蛋白1（53BP1）和新发现的DNA损伤检查点蛋白1介体（MDC1）；图2)，是第一批招募到DSB位点病灶的蛋白质。它们最初可能作为其他蛋白质招募的支架（例如，修复和/或扩增DNA损伤信号所需的因子），并在DNA末端之间提供结构连接。现在很清楚，除了被ATM磷酸化外，这些介质中的每一个都与磷酸化H2AX（γ-H2AX）共定位，后者是分布在大多数基因组中的组蛋白变体。H2AX在其C端含有高度保守的丝氨酸残基(图2)快速磷酸化(罗加库等., 1998)以ATM相关方式出现DSB之后(缅甸等., 2001;费尔南德斯·卡佩蒂略等., 2002)。然而，请注意，H2AX的磷酸化在自动取款机^−/−高剂量IR下的细胞，这表明存在多余的通路，在存在大量DSB的情况下激活H2AX(费尔南德斯·卡佩蒂略等., 2002)。经过修饰后，这种变异组蛋白对于促进许多不同蛋白质向DNA损伤区域的局部募集至关重要(保罗等2000年).

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图2

人类ATM、γ-H2AX和介体蛋白。参与双绞线断裂（DSB）反应的关键分子。指出了每个蛋白质的已知结构域。ATM中的ATM和RAD3相关（ATR）区域功能未知。53BP1，p53结合蛋白1；ATM，共济失调毛细血管扩张症突变；BRCA1，乳腺癌相关蛋白1；BRCT、BRCA1羧基末端；FAT、FRAP/ATM/TRRAP；FATC，FAT羧基末端；FHA，相关叉头；MDC1，DNA损伤检查点蛋白1的介导物；PI（3）激酶、磷脂酰肌醇-3-OH激酶。

决胜赛跑

大多数用于检查病灶的显微镜技术都无法检测到单个或少量分子。因此，DSB最初的蛋白质补充可能经常被忽略，显微镜下可见的病灶的出现实际上可以反映DSB反应中的后期事件。因此，很难确定哪些成分首先在病变处发挥作用。在未受损的细胞中，ATM分子在核质中以二聚体（或高阶多聚体）的形式结合在一起，每个分子的激酶域被另一个ATM分子的FRAP/ATM/TRRAP（FAT）域结合并失活(Bakkenist&Kastan，2003年; 看见图2和​和3A）。3A级)。已提出DSB对染色质结构的特异性改变（可能是由于含有DSB的受扭转限制的染色体环的解开）可以激活可溶性低聚物ATM激酶(图3B)。这种激活也可以通过将细胞暴露于染色质修饰药物或低张力应激来实现，这些治疗被认为不会导致DSBs。重要的是，染色质结构的扰动导致可溶性ATM活化的机制尚未完全描述，尽管已知涉及1981年Ser ATM的分子间自磷酸化以及由此导致的非活性ATM多聚体的破坏(Bakkenist&Kastan，2003年)。活性的可溶性ATM单体随后在核质内自由迁移，磷酸化任何可溶性底物（如p53）并结合到断裂染色体的末端。当时不溶的、染色质结合的ATM可以与DSB中已有的底物（如H2AX，如果MRN复合体的初始定位非常迅速，还可以与NBS1）以及随后被纳入DSB的其他底物（例如MDC1、53BP1和BRCA1；图3C-E)。一个重要的观察结果是，ATM通过NBS1磷酸化来响应DNA损伤是激活体内检查点所必需的，但ATM不会影响MRN在DSB诱导下向损伤部位的募集(Mirzoeva&Petrini，2001年)。这表明MRN复合体绑定到DSB的能力与ATM无关(图3C)。另一种可能性是MR复合物在损伤部位早期被招募，NBS1被磷酸化，随后被带到复合物中，在那里调节其活性。因此，至少MR或MRN与病灶的最初结合可能与ATM的结合一致，甚至先于ATM。MRE11的DNA结合能力和MR复合体的结构设计非常适合于在感知和系留断裂染色体方面发挥重要的早期作用(图1B)。根据中的研究建议酿酒酵母，Mre11的核酸酶活性可能对断裂的初始处理很重要，因此有助于其修复(苏加瓦拉和哈伯，1992年)，尽管DSB的重组修复不需要它们(布雷森等., 1999;莫罗等., 1999)。随后MRN向病灶附近的募集可能与病灶的增长有关，而不是与DSB的最初感觉有关。

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图3

双绞线断裂响应循环的模型。(A类)染色体的未受损部分，显示两个染色质环和一个无活性的ATM二聚体。(B类，C类)DNA双链断裂（DSB）的诱导、染色质的修饰、ATM的激活以及ATM和MRE11/RAD50/NBS1（MRN）的招募。显示了MRN在ATM之前绑定的可能性，但事件的确切顺序未知。细黑线表示染色质发生了改变。(D类，E类)随着H2AX磷酸化浪潮的到来，介质（DNA损伤检查点蛋白1（MDC1）、p53结合蛋白1（53BP1）和乳腺癌相关蛋白1（BRCA1）的介体）被招募到不断增长的焦点，以及它们的ATM依赖性磷酸化。焦点的分子结构未知。(F类)病灶解体、ATM失活和染色质重塑。该模型表明，至少有两种不同形式的可溶性ATM：一种是非活性低聚物，另一种是活性单体，以及至少两种不同的活性、不溶性形式：一种直接位于病变处，另一个是与不断增长的病灶不可分割的。请注意，MRN复合体也是日益增长的焦点的一个组成部分，但为了清楚起见，这里省略了。复杂的持续性病变被认为更难修复，这反映在不断增长的病灶所达到的大小上。有关更多详细信息，请参阅文本。插图包含所示分子的彩色编码键。

被招募到断裂染色体上的ATM可以在断裂两侧数兆碱基的距离内磷酸化组蛋白H2AX(罗加库等1999年;图3D)。最近，有研究表明，小鼠H2ax的丢失会导致基因组不稳定，Nbs1和介体蛋白（如53bp1和Brca1）在IR诱导的核病灶中的招募和浓度有缺陷(塞莱斯特等., 2002)。然而，观察到细胞周期检查点在H2AX型^−/−细胞表明，MRN复合体和ATM在H2AX磷酸化缺失的情况下仍能检测损伤并向下游效应器发出信号。类似地，酵母H2a中保守丝氨酸残基的磷酸化对于检查点激活来说是不需要的(Downs公司等., 2000)。然而，H2AX会导致基因组不稳定和辐射敏感性(塞莱斯特等., 2002)表明这种组蛋白变体对于DSB的有效修复（如果不是来自DSB的信号）非常重要。因此，对于某些病变的修复，尤其是那些复杂且难以修复的病变，可能需要动态组装大且不断增长的病灶，而不是最初的DSB信号。无力H2AX型^−/−细胞将修复蛋白集中在DSB附近，这将有助于有效修复，这可能是这些细胞在基因组不稳定性方面的关键缺陷。或者，最近对芽殖酵母的研究表明，尽管这种组蛋白修饰有助于DSB的有效修复，但对于拓扑异构酶I介导的DNA损伤的修复尤其重要(雷登等., 2003).

最近发现的MRN相互作用蛋白MDC1可能参与其他蛋白向DSB的募集，因为它以ATM依赖的方式磷酸化，并在暴露于IR的几分钟内形成与γ-H2AX广泛共定位的病灶(戈德伯格等., 2003;卢等., 2003;斯图尔特等2003年)。重要的是，MDC1的下调抑制了含有NBS1、53BP1和BRCA1的病灶的形成，但不抑制NBS1的磷酸化。关于病灶形成，这些观察结果表明，MDC1在上述蛋白质的上游发挥作用，并需要调节其病灶积聚。因此，MDC1促进紧邻DSB的NBS1、53BP1、BRCA1和其他蛋白质的装载。因此，在ATM依赖的H2AX磷酸化波后，它似乎介导损伤反应蛋白的扩张结构的组装，这些损伤反应蛋白在损伤两侧有核(图3E)。目前，尚不清楚在DSB周围不断增长的核蛋白结构中，哪些蛋白质随后被招募到MDC1中。然而，王和同事（2002）已提供证据证明BRCA1没有局限于53制动踏板1突变细胞，表明蛋白质向损伤部位募集的层次顺序(图3E)。类似地，BRCA1是暴露于IR后NBS1和CHK2的ATM依赖性磷酸化所必需的，但对于H2AX磷酸化是不必要的(福雷等., 2003)。在扩大的焦点中，ATM磷酸化介体蛋白（例如MDC1、53BP1和BRCA1），这些介体蛋白反过来又可以招募更多参与修复、信号转导或两者兼有的损伤反应蛋白（例如RAD51、CHK1、CHK2等）。

当修复完成时，病灶的分解，可能包括去除一些修饰（例如某些磷酸化）、添加新的修饰（例如泛素化）、蛋白水解、染色质重塑等，可能与病灶的初始形成一样受到严格的调控(图3F).

结论

染色体断裂可由内源性和外源性来源引起，是一种特别危险的遗传损伤类型。新出现的数据有力地支持了MRN复合体在预防染色体断裂的遗传毒性后果方面的关键作用。作为DSB特异性的“基因组守护者”，MRN复合体被认为在抑制转化和恶性肿瘤中发挥作用。也许MRN复合体在维持基因组稳定性方面的核心重要性的最佳指标是观察到，在所有分类王国中都发现了这种复合体的变体，并且在高等真核生物中，细胞活力依赖于MRN。此外，观察到腺病毒以这种特殊的宿主复合体为降解目标，以促进其整合到宿主基因组中，这表明MRN复合体在DSB反应中起着关键作用(施特拉克等., 2002)。通过灭活宿主细胞的MRN复合体，病毒抑制宿主的DSB反应，从而为其整合留出时间。

尽管最近有大量关于MRN复合体的数据，但其确切的分子作用机制仍不清楚。例如，完整的MRN复合体总是被招募到DSB中，还是MR子复合体有作用？也许一个MR亚复合物与DNA断裂结合，NBS1随后被招募。MDC1是否在MR或MRN复合物的初始招募中起作用，或者对随后将这些复合物加载到不断增长的焦点中更重要？MRN组分的酶活性在体外对DSB反应重要的研究？也许酶活性与MRN在DNA复制中的作用更相关。显然，还有许多问题需要解释。

致谢

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