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公共科学图书馆-遗传学。2006年1月；2（1）：e4。
2006年1月13日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pgen.0020004
预防性维修识别码：PMC1326221项目
PMID：16410827

哺乳动物内耳感觉祖细胞发育需要缺口配体JAG1

艾米·基尔南, 徐静霞,和托马斯·格里德利*
David Beier，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

在哺乳动物中，内耳中的六个独立的感觉区域对听力和平衡功能至关重要。每个感觉区域都由毛细胞组成，毛细胞是感觉细胞，以及与之相关的支持细胞，两者都来自一个共同的祖细胞。对于支配这些感觉器官发育的分子机制知之甚少。Notch信号通过配体Delta-like 1和Jagged（JAG）2介导侧向抑制，在毛细胞和支持细胞的分化中起着关键作用。然而，另一个Notch配体JAG1在细胞分化前的感觉斑早期表达，这表明Notch信号可能在耳朵的感觉发育中发挥早期作用。这里，使用条件基因靶向，我们表明Jag1型该基因是内耳内所有六个感觉器官正常发育所必需的。克里斯塔完全缺乏Jag1型-有条件淘汰赛（奇科）突变体内耳，而耳蜗和胞果显示部分感觉发育。囊状黄斑存在但畸形。使用SOX2和p27基普1作为前庭结构域的分子标记，我们发现JAG1最初在耳朵的所有前庭区域表达，但在胚胎第14.5天，当细胞退出细胞周期并分化时，在Corti的新生器官中表达下调。我们还显示了SOX2和p27基普1在中下调Jag1-cko公司内耳。综上所述，这些数据表明JAG1在耳蜗和前庭区域的前庭结构域早期表达，并需要维持SOX2和p27的正常表达水平基普1这些数据表明JAG1介导的Notch信号在内耳前庭区的早期发育中至关重要。

简介

耳聋和成人期听力损失是严重的健康问题。在大多数情况下，内耳中的感觉细胞（毛细胞）由于环境或遗传原因退化时，会导致耳聋或前庭功能障碍。在哺乳动物内耳中，毛细胞及其相关的支持细胞存在于六个不同的斑块中，这些斑块具有与听力或平衡相关的特殊功能。不幸的是，与鸟类或鱼类不同，哺乳动物的毛细胞几乎没有再生能力，一旦受损，就会导致永久性听力或平衡障碍。在这里，作者表明，哺乳动物内耳所有六个感觉区域的正常发育需要一种称为JAG1的蛋白质，它是Notch信号通路中的配体。在缺少JAG1的耳朵中，一些感觉斑完全消失，而其他的则很小，缺乏特定的细胞类型。作者表明，JAG1是产生毛细胞和支持细胞的感觉前体祖细胞所必需的。通过了解感觉区域是如何正常发育的，人们希望能够开发出分子工具来帮助哺乳动物内耳的感觉再生。

介绍

哺乳动物的内耳是一个复杂的结构，由一个盘绕的耳蜗、三个正交定位的半规管、一个中央前庭以及一个向后突出的内淋巴管和淋巴囊组成。除了内淋巴管和囊外，耳朵的不同部位都含有由感觉毛细胞及其相关支持细胞组成的感觉器官。有三种不同的感觉器官：嵴，位于每个半规管的底部；黄斑，位于中央前庭内；和Corti的器官，它排列在耳蜗导管上。听觉只需要一个感觉器官，即Corti器官；其他五个器官对平衡很重要。不幸的是，在哺乳动物中，如果这些区域因环境或基因侮辱而受损，它们将无法再生，从而导致永久性听力和/或平衡障碍。

虽然在理解耳朵感觉区域内的单个细胞类型是如何形成的方面取得了一些进展[1,2]但对于建立前感觉谱系的分子机制以及不同感觉器官类型是如何形成的，知之甚少。有趣的是，脊椎动物内耳感觉分化的分子机制与果蝇属感觉器官发育[三–5]. 例如，在果蝇属外部感觉器官的发育，需要Notch信号介导的侧向抑制来限制感觉器官前体细胞命运的采用，从而产生整个感觉器官[6–8]. 类似地，在脊椎动物耳朵中，Notch信号介导的侧向抑制对于限制能够接受毛细胞命运的细胞数量似乎很重要[9–15]. 谱系分析还表明，至少在鸡身上，毛细胞和支持细胞来自一种常见的祖细胞[16]与接受侧向信号传递以指定细胞命运的等能上皮相一致。与中不同果蝇，它有一个Notch受体和两个配体（Delta和Serrate/Jagged），在哺乳动物中，Notch信号通路成分包括四个受体（Notch 1-4）和五个配体[8,17–19]). 在小鼠中，DLL1和JAG2都在新生毛细胞中表达[10,20]并在侧向抑制期间发挥协同作用[15]. DLL1和JAG2似乎都通过NOTCH1受体发出信号[15]. 在果蝇，经历侧抑制的前感觉区首先通过表达无调性的或瘦果盾基本螺旋-环-螺旋转录因子家族。进一步与果蝇属发现无调性的同源数学1基因，是毛细胞分化所必需的[21–23]. 然而，情况并不完全类似于果蝇，因为MATH1似乎不需要建立产前区[22,24]. 事实证明，内耳的感觉器官形成需要另一种转录因子HMG-box因子SOX2[25]. 这一发现并没有证明与果蝇属感觉器官的形成，因为果蝇属SOX2同源物SoxNeuro公司和二甲醚在外周感觉器官形成中没有已知的作用。相反，这两个基因在中枢神经系统神经前体细胞的形成中都起作用[26,27]. SOX2与前驱作用一致，在发育早期标记感觉祖细胞，并作用于数学1耳朵感觉器官形成过程中的基因[25]. 有趣的是，其中一种Notch配体JAG1在耳朵前庭区的早期表达[4,20]表明Notch信号也可能在早期感觉器官形成中发挥作用。与这一发现一致，小鼠杂合性N个-乙基-N个-亚硝基脲诱导的点突变Jag1型基因显示耳朵有轻度感觉器官缺陷[28,29]. 不幸的是，胚胎纯合子的可用突变等位基因Jag1型由于血管缺陷，该基因不能在胚胎期第11.5天存活，无法对其内耳进行分析。为了避免这种早期致命性，我们创造了一个条件等位基因Jag1型基因使用Cre/loxP技术。使用福克斯1-Cre在早期耳囊中表达Cre重组酶的小鼠系[30,31]，我们已经破坏了耳朵中的JAG1功能，并表明内耳中的感觉形成在这些突变体中严重减弱。头发和支持细胞形成的模式分析Jag1型-有条件淘汰赛（奇科）内耳表明较少的祖细胞形成于美洲虎1 cko内耳。这一结果通过对前体标记SOX2和p27的分析得到了证实基普1，早在E12.5就下调，表明Jag1型该基因在感觉祖细胞形成的早期起作用。这些数据证明了Notch信号在建立内耳感觉祖细胞中的早期作用。

结果

创建Jag1型基因

我们通过侧翼的Delta-Serrate-Lag2（DSL）域编码外显子（外显子4），创建了一个JAG1功能条件失活的等位基因Jag1型具有loxP位点的基因(图1). DSL结构域是DLL和JAG蛋白与Notch家族受体相互作用的区域[32,33]; 因此，去除基因的这一区域应该会产生一种无功能蛋白质。为了证明该等位基因编码一种非功能蛋白，我们将其杂交Jag1型弗洛克斯/+在雌性生殖系中表达Cre重组酶的小鼠对小鼠Zp3型发起人(Zp3-芯小鼠）；这个Zp3-芯小鼠品系在第一次减数分裂完成之前，在生长中的卵母细胞中表达Cre重组酶[34]. 女性Zp3-芯/+;Jag1型弗洛克斯/+然后将后代与雄性B6小鼠杂交，以产生杂合的后代，这些杂合的子代与floxed等位基因（指定为Jag1型del2（删除2）/+; 看见材料和方法). 杂合的Jag1型del2（删除2）/+小鼠被交叉，并且Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）对纯合后代进行E9.5和E11.5之间的缺陷分析。Jag1型del2（删除2）/Jag1型三角形2突变胚胎表现出与我们之前描述的靶向纯合胚胎相同的血管表型Jag1型无效等位基因，Jag1型del1（删除1）[35]. 具体来说Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）突变胚胎表现出卵黄囊血管重构缺陷和颅内出血，并且经常表现出心包囊扩大(图2A–2D） ●●●●。全部Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）E11.5使突变胚坏死，E10.5使大多数胚胎出现血管缺陷。使用跨越固定外显子4的引物从突变胚胎合成的cDNA的RT-PCR表明，如预期的那样，该区域被删除(图2E） ●●●●。这些数据表明，删除Jag1型弗洛克斯等位基因产生无功能的Jag1型突变等位基因。

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条件等位基因的构建Jag1型基因

（A） 显示生成策略的示意图Jag1型弗洛克斯老鼠。目标载体设计用于插入液氧磷外显子4（DSL域编码外显子）两侧的位点（黑色箭头）（外显子4中的白色区域）。新霉素抗性盒（用于阳性选择）的两侧是FRT公司位置（灰色箭头），以便稍后可以通过交叉到FLPe公司-表达小鼠。纳入白喉毒素基因进行阴性选择。虚线表示FLPe或Cre重组酶存在时发生的重组事件。基因分型的引物位置显示为黑色小箭头（a，DSLF；b，J1LoxR1；c，J1FlpF1；参见材料和方法用于序列）。DT，白喉毒素；R、 EcoR1；十、 Xba1。

（B） 使用（A）所示的外部探针对来自ES细胞的EcoRI消化DNA进行Southern blot分析。左边显示野生型带（12.3kb），中间和右边显示正确靶向的ES细胞，它们既有野生型带又有较小的突变带（9.4kb）。

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Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）胚胎表现出血管缺陷和致死性，与JAG1功能丧失一致

（A和B）E10.5胚胎显示大血管丢失（[A]中的白色箭头）Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）卵黄囊（B）与其他类似Jag1型功能丧失突变体。（C和D）E11胚胎显示小的坏死Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）胚胎（D）。（D）中的白色箭头表示心包囊扩大（扩大，插入），这在表现出心血管缺陷的突变体中经常观察到。使用从E10.5对照组（+）和ZP3-Cre公司删除胚胎（−）（E）。上部带（541 bp）表明存在野生型等位基因。较低的频带（286 bp）表示Jag1型del2（删除2）不含外显子4的突变等位基因。

停用Jag1型耳内功能

为了破坏内耳内的JAG1功能，我们穿过Jag1型弗洛克斯/Jag1型弗洛克斯双杂合小鼠福克斯1-Cre等位基因（这些小鼠在整个耳囊、前脑、眼睛和前肠表达Cre重组酶）[30]和Jag1型del1（删除1）等位基因[35]. 基因型后代福克斯1-Cre/+;Jag1型del1（删除1）/Jag1型弗洛克斯（以下简称Jag1-cko公司)通过E18.5存活，并对内耳缺陷进行分析。我们检测了Cre介导的切除模式Jag1-cko公司通过使用特异检测缺失外显子4的探针进行原位杂交，在E10.5和E16.5–E18.5的耳蜗中检测胚胎(图3). 这些结果表明E10.5在耳囊中的表达较弱或缺失(图3B） ●●●●。此外，对后期耳蜗表达的分析显示E16.5无表达(图3F） 和E18.5（未发布数据）。这些数据表明，如前所示，有条件删除成纤维细胞生长因子受体1（Fgfr1）固定等位基因[31]，的福克斯1-Cre行有效删除Jag1型弗洛克斯等位基因在内耳发育早期。

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有条件的Jag1型使用停用福克斯1-Cre线路

（A–D）使用Jag1型外显子4特异性探针。白色箭头（A）指向Jag1型耳囊中的信号（左箭头）和眼睛中的信号（右箭头），这两个结构中表达了Cre重组酶。在Jag1-cko公司E10突变，此信号缺失或极弱。黑色箭头（A和B）表示在脊髓和肾管中的表达，Cre重组酶在这些区域的表达未见报道福克斯1-Cre老鼠。然而，这些区域的表达一直较弱Jag1-cko公司胚胎，表明Cre重组酶在Jag1-cko公司胚胎。在（D）中，耳囊和眼睛由虚线勾勒出来。在这些区域观察到很少表达，这与福克斯1-Cre表达式。

E16.5耳蜗原位杂交显示Jag1型在野生型（E）和Jag1-cko公司耳蜗（F），表达完全缺失。比例尺=500μm。

内耳畸形Jag1-cko公司突变体

为了检查Jag1-cko公司内耳，在E15.5对突变体和对照的内耳进行油漆填充(图4). 分析结果表明Jag1-cko公司内耳与室友对照(图4C和​和4D）。4D） ●●●●。具体来说，除了部分前半规管和外半规管外，大部分半规管都不存在。此外，椭圆囊变小，球囊畸形，耳蜗被掩盖。相比之下，内耳中与感觉形成无关的部分，包括内淋巴管和淋巴囊以及小腿，似乎相对未受影响。

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内耳畸形Jag1型 +/−和Jag1-cko公司胚胎

E15.5经过喷漆填充以显示其整体形态的内耳。

（A） 野生型内耳形态正常。结构标记如下：aa，前壶腹；asc，前半规管；cd、耳蜗管；ed，内淋巴管；la，壶腹外侧；lsc，外侧半规管；pa，后壶腹；psc，后半规管；囊，球囊；呃，胞果。

（B）Jag1型杂合子内耳（或Jag1型del1（删除1）/+或福克斯1-Cre/+;Jag1型弗洛克斯/+)显示截断的后半规管和缺失的壶腹（星号）。箭头指向前壶腹和后壶腹，与野生型对照组相比较小（A）。

（C和D）在美洲虎1 cko动物。无壶腹和少量半规管发育；星号表示前管残留。在（D）中，也有侧管的残余（箭头所示）。胞果和球囊较小，耳蜗较短且未被包裹。比例尺=500μm。

感觉缺陷Jag1-cko公司突变体内耳

自从Jag1型基因在耳朵的感觉区表达，因为Jag1-cko公司突变体内耳似乎主要影响耳朵中包含感觉器官的区域，我们检查了耳朵的感觉区域是否存在缺陷。我们在E18.5用扫描电子显微镜（SEM）检查了耳蜗感觉器官Corti的器官(图5). 到这个阶段，Corti器官内的所有毛细胞都已退出细胞周期，大多数分化良好，但尚未完全成熟[36]. 通过SEM观察，在美洲虎1 cko变异耳蜗。这种表型在耳蜗的基底弯处最为显著，那里没有观察到毛细胞的形成(图5D） ●●●●。在Corti器官的中基部区域，毛细胞形成斑块，在斑块内没有明显的排列或内外毛细胞的区别(图5F） ●●●●。更顶端的毛细胞沿着Corti器官更连续(图5H） ●●●●。然而，尽管毛细胞存在于顶端区域，但其数量明显减少；与正常、有序的四排毛细胞不同，只有两排排列松散、类型模糊的毛细胞。

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耳蜗毛细胞图案缺陷

扫描电子显微镜显示毛细胞沿耳蜗长度产生的不同模式美洲虎1 cko胚胎。

（A–D）耳蜗顶部和底部的低倍视野。（A）和（B）中沿底座的装箱区域在（C）和（D）中以较高的放大倍数显示。请注意底部没有毛细胞Jag1-cko公司耳蜗，除了耳蜗顶端的一小块细胞（箭头所示）。比例尺=500μm。

（E和F）在中基底区，观察到更多的毛细胞，但它们呈斑块状排列，内外毛细胞没有明显区别。

（G和H）在顶端转弯处，毛细胞是连续的，但通常只排列成两行。比例尺=100μm。

异常毛发和支持细胞模式Jag1-cko公司内耳

为了确定哪些感觉细胞类型在Jag1-cko公司突变体耳蜗、特异性标记物被用于识别整个耳朵的毛细胞和支持细胞亚型(图6). 在耳蜗中，我们使用MYO7A抗体标记所有毛细胞，使用S100A1抗体标记内毛细胞、Deiter支持细胞和内指骨支持细胞[24]. 当两种标记结合使用时，可以区分内毛细胞、外毛细胞和一些支持细胞类型(图6A–6F） ●●●●。该分析表明，在耳蜗顶端，存在内毛细胞，并且通常形成双股毛细胞(图6B） ●●●●。他们的相关支持细胞，内指骨细胞，也存在。该区域不存在外毛细胞及其相关的支持细胞，即Deiter细胞。在耳蜗的中部，存在着内部毛细胞和偶尔出现的外部毛细胞，尽管它们的图案明显异常(图6D） ●●●●。此外，Corti的通道并不明显，内部毛细胞经常成对生长，外部毛细胞行数增加，但没有伴随Deiter的支持细胞。如扫描电镜所示，耳蜗基底部的毛细胞和支持细胞均缺失(图6F） 。

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头发和支持细胞标记物显示Jag1-cko公司内耳

使用两种标记物，肌球蛋白VIIA（红色；所有毛细胞）和S100a（绿色；内毛细胞、迪特细胞和内指骨细胞）的免疫细胞化学显示，对照和Jag1-cko公司内耳。

（A–F）通过耳蜗指定转弯处的截面。请注意Jag1-cko公司耳蜗。正常形态显示（A）和标记结构如下：GER，大上皮嵴；IHC，内毛细胞（彩色编码黄色）；LER，小上皮嵴；OHCs，外部毛细胞（颜色编码为红色）；SC，支持细胞（绿色编码）。

（G–J）前庭系统中毛发和支持细胞生成的模式。椭圆黄斑非常小，毛细胞很少（H），而球囊（J）显示出强劲的毛发和支持细胞生成，尽管器官的形状较小且畸形。

使用相同的标记物，我们还检查了Jag1-cko公司变异内耳(图6G–6J） ●●●●。与通过油漆填充观察到的半规管和壶腹形成缺失相一致，没有证据表明有嵴形成。这个Jag1-cko公司椭圆黄斑非常小，分化毛细胞很少(图6H） ●●●●。令人惊讶的是，球囊及其黄斑在美洲虎1 cko内耳(图6J） ●●●●。虽然整个囊状结构的形状与对照组不同，但毛细胞分化似乎相对未受影响，这一特征也在彩绘填充标本中观察到（参见图4C和​和4D）。4D） ●●●●。这些数据表明，内耳内的所有感觉器官在Jag1-cko公司内耳。然而，一些感觉器官，如嵴，似乎对JAG1功能的丧失更为敏感。

检查异常毛细胞图案是否Jag1-cko公司耳蜗是由于毛细胞形成或随后分化的缺陷造成的，我们在早期检查了毛细胞模式（E16.5）。使用与毛细胞静纤毛结合的凝集素，我们检查了E16.5的毛细胞形成模式是否与E18.5的模式相似(图7). 野生型耳蜗E16.5处毛细胞分化梯度明显(图7A、，​A、 7C、，7C、，​C、 7E中，7E、 和​和7G）；7G） ；在基底区，内外毛细胞都能被识别（未发表的数据），而在中间区，大多数标记物只能清楚地检测到内毛细胞(图7A和​和7C）。7C） ●●●●。在更顶端的区域，在此阶段几乎没有毛细胞分化(图7E和​和7G）。7G） ●●●●。在Jag1-cko公司耳蜗，其形态与E18.5相似，在中基底部有成片的毛细胞(图7B和​和7D）7D） 基底部完全没有毛细胞(图7B） ●●●●。这些数据表明Jag1-cko公司突变体在毛细胞形成而非分化方面存在缺陷。此外Jag1-cko公司与对照组相比，耳蜗没有表现出更大的分化(图7E–7H） 他反对将早熟分化作为突变耳蜗毛细胞数量减少的解释。

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中分化模式的早期分析Jag1-cko公司Cochlea表示缺陷是由感觉细胞形成失败引起的，而不是随后的退化

E16.5全耳蜗凝集素染色。

（A） 野生型对照耳蜗的正常模式。GER，更大的上皮嵴。

（B） 图中显示了耳蜗的基底部和中间部分，但由于对照组（A）的耳蜗更长，耳蜗最基底的部分已被切除。注意基底部缺少毛细胞Jag1-cko公司耳蜗。

（C–H）方框中的（A）和（B）区域在（C）和（D）中以较高的放大倍数显示。（D）中的箭头表示在E18.5中也观察到毛细胞的异常斑块。类似地，（E）和（F）的方框区域在（G）和（H）中以更高的放大倍数显示，这表明在对照组和突变体（箭头）的该区域中只有少数毛细胞刚刚开始分化。相应面板的比例尺=500μm。

年中断的散文发展Jag1-cko公司内耳

为了确定JAG1配体在感觉发育过程中的功能，我们使用了几个前感觉结构域的标志物，包括p27基普1和SOX2，并在野生型和Jag1-cko公司突变耳蜗(图8). 在E14.5，Corti器官中的大多数毛细胞和支持细胞已完成最终分裂，耳蜗基底部的毛细胞开始分化[36]. 第27页基普1是一种细胞周期抑制物，是耳蜗感觉祖细胞按时退出细胞周期所必需的，也是耳蜗前感觉域的既定标记[22,37]. 第27页基普1当毛细胞和支持细胞在E13.5至E14.5左右退出细胞周期时，开始在耳蜗内的离散区域表达(图8A、，​A、 8B、，8B、，​B、 8D、，8D、 和​和8E）。8E） ●●●●。最近研究表明，内耳前庭区的建立需要SRY相关转录因子SOX2[25]. 利用荧光免疫细胞化学双重标记，我们检测了这些标记物与野生型和野生型JAG1蛋白表达之间的关系Jag1-cko公司耳蜗。如前所述[22]，根据p27评估，JAG1在前感觉域内未表达基普1E14.5表达，但在耳蜗（科利克器官）的内部（神经）部分紧邻处表达（可能有一些轻微重叠）；图8A和​和8D）。8D） ●●●●。相反，SOX2确实显示出与p27有很大重叠的域基普1(图8B和​和8E），8E） ，如最初所述[25]. 然而，SOX2表达结构域略大于p27基普1结构域，延伸至科利克器官并与JAG1结构域重叠。尽管JAG1在E14.5的前感觉域中没有表达，但这两个p27基普1耳蜗基底部无SOX2表达(图8C） 表明这些耳朵的前庭结构已经被破坏。在心尖部，观察到这两个标记的弱表达(图8F） ，这与以下事实一致：Jag1-cko公司耳蜗。

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在E14.5中，JAG1直接表达在被中断的散文域附近Jag1-cko公司内耳

使用前感觉结构域的两个标记Sox2和p27在E14.5进行免疫细胞化学基普1，与JAG1在耳蜗的基底匝和顶端匝中结合。注意，JAG1域（红色）没有与p27重叠基普1域（绿色）（A和D），而SOX2域在很大程度上与p27重叠基普1（黄色）（B和E）。SOX2和p27基普1在Jag1-cko公司耳蜗（C和F），尽管这两种标志物在心尖（F）中的表达较弱。GER，大上皮嵴；LER，较小的上皮嵴。

为了确定JAG1是否曾在耳蜗前感觉区表达，我们检测了一个更早的年龄段（E12.5），并将JAG1结构域与SOX2结构域进行了比较（自p27基普1在E13.5到E14.5之前，内耳中没有表达）。野生型和Jag1-cko公司耳蜗进行免疫染色以检测JAG1或SOX2蛋白(图9). 该分析表明，在感觉祖细胞仍在分裂的野生型耳蜗基底区，JAG1的表达确实与SOX2结构域重叠(图9A和​和9B），9B） ，表明JAG1最初在前感觉域中表达。然而，在感觉前体停止分裂的顶端区域，JAG1和SOX2的表达没有重叠(图9D和​和9E）。9E） ●●●●。在Jag1-cko公司耳蜗SOX2在基底区缺失，在顶端区显著下调(图9C和​和9F）。9F） ●●●●。这些数据表明，JAG1在早期阶段在耳蜗的前感觉区表达，如果没有JAG1功能，则在感觉毛细胞和非感觉支持细胞的细胞周期退出和分化之前，感觉形成被破坏。

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在E12.5，JAG1在Prosensory域中表达，SOX2在该域中表达下调Jag1-cko公司耳蜗科

（A、B、D和E）使用JAG1或SOX2抗体对对照胚胎进行免疫细胞化学处理的交替切片。注意JAG1和SOX2在耳蜗底部（A和B；括号）占据的类似区域。在顶端区域，这两种蛋白质没有共定位（D和E）。SOX2不表达于Jag1-cko公司耳蜗（C），并且仅在心尖（F）中表现出弱表达。bv、血管；cd，耳蜗管。

我们还比较了野生型和野生型内耳前庭区JAG1和SOX2的表达Jag1-cko公司突变胚胎。JAG1和SOX2的表达域大致重叠，与耳朵前庭部分五个感觉器官的位置相对应(图10). 这两个表达域仅在前嵴和后嵴中存在显著差异，其中JAG1表达在其表达域的中间有一个负斑片，而SOX2表达没有显示相同的斑片(图10A、，​A、 10B，10B、，​B、 10克，10G、 和10H）。JAG1阴性区域可能与十字嵴对应，十字嵴是一个位于前嵴和后嵴中部的无感觉区域，尽管尚不清楚SOX2为什么会在那里表达。在Jag1-cko公司前庭感觉斑片中SOX2的表达与E18.5观察到的感觉分化模式一致。例如Jag1-cko公司球囊显示SOX2表达相当正常(图10C） 与囊状黄斑的几乎正常发育相一致。相反，胞果中SOX2的表达很弱，表达域比对照组小得多(图10F） 与年椭圆黄斑分化严重中断相一致Jag1-cko公司内耳。SOX2在Jag1-cko公司嵴，事实上，即使在这个早期阶段，整个壶腹似乎也缺失或严重受损(图10C和​和10I；10I；虚线区域），与后期观察到的嵴和壶腹缺失一致。

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JAG1和SOX2标记前庭前庭感觉区，SOX2表达与前庭感觉形成受损相关Jag1-cko公司前厅

（A和B、D和E、G和H）交替切片显示对照内耳前庭区JAG1或SOX2表达。

（C、F、I）通过Jag1-cko公司内耳显示SOX2表达。虚线表示嵴和壶腹缺失的区域Jag1-cko公司内耳。ac，前嵴；lc，侧嵴；pc，后嵴；囊，囊状黄斑；ut，椭圆黄斑。

讨论

我们已经证明，由JAG1配体介导的Notch信号在发育早期是耳朵感觉区形成所必需的。通过比较JAG1与前感觉结构域的两个标记SOX2和p27的表达基普1我们已经表明，JAG1标记了早期（E12.5）耳朵的所有前感觉区，但当感觉祖细胞退出细胞周期并开始分化为毛细胞和支持细胞时，E14.5在Corti器官中表达下调。SOX2和p27基普1在受影响的前庭区下调Jag1-cko公司内耳，证明JAG1对于内耳中早期感觉祖细胞的发育是必要的。

毛细胞形成的独特模式Jag1-cko公司内耳提示祖细胞数量减少

我们研究的一个有趣结果是，这六个感官区域并没有同样受到Jag1型功能。例如，在Jag1-cko公司前庭系统、嵴全部缺失，只有少量毛细胞在椭圆黄斑区分化。相反，囊状黄斑在毛细胞形成方面几乎没有受到干扰，尽管器官的整体形状异常。在Jag1-cko公司耳蜗、毛细胞的分化模式因其顶部或底部位置而异。例如，在耳蜗的顶端区域，只有内部毛细胞形成，这些毛细胞通常排列成多行，而不是正常的单行。在耳蜗的中基部和中基部转弯处，经常观察到带有非感觉干预区的毛细胞斑块。在这些斑块中，有时会出现外毛细胞，尽管图案异常，并且没有S100A1标记的Dieter细胞。在耳蜗的基底区域，既没有毛细胞，也没有支持细胞。

耳蜗基底部发现的毛细胞斑块以及耳蜗基部和顶端突变的差异效应特别有趣，因为至少在另外两个已知在耳朵感觉前体生成中起作用的基因突变小鼠中发现了类似的缺陷。例如Fgfr1级基因显示耳蜗部分毛细胞斑块[31]. 类似于Jag1-cko公司表型，这些斑块位于Fgfr1级条件突变体主要包含内部毛细胞，通常排列成多行，外部毛细胞很少。与Jag1-cko公司表型，Fgfr1级仅耳蜗需要功能。另一种小鼠突变体Sox2系统基因（黄色潜水艇；Sox2系统ysb公司)，也显示耳蜗基底部的毛细胞斑块和耳蜗顶部的轻度表型[25]. 更类似于Jag1-cko公司表型，耳蜗和前庭感觉区都需要SOX2[25]. 在这些变异的耳蜗中，主要是内毛细胞分化的发现可能是因为内毛细胞是最先分化的[10,37]这表明，如果祖细胞数量减少，它们可能会分化为内毛细胞而不是外毛细胞。同样，这些突变体顶端区域的表型较温和，可能是因为细胞在顶端最早退出细胞周期[36]. 这可能意味着，如果祖细胞数量减少，它们将位于耳蜗的顶端而不是基底部。

观察到的多排内毛细胞Jag1-cko公司其他突变体可以用许多不同的场景来解释。一种可能性是，多行并不是内部毛细胞数量实际增加的结果，而是由于它们的最终排列因较短而产生的缺陷Jag1-cko公司耳蜗。最近对具有平面细胞极性和会聚延伸缺陷的小鼠突变体的研究（该术语指细胞嵌入，导致组织在没有增殖的情况下一维生长）表明用这种方法可以获得多排毛细胞，并且经常在耳蜗的顶端区域观察到[38–41]. 另一种可能性是，多行是JAG1配体的第二个稍后功能的结果，与此处描述的前体作用不同。第三种可能性是p27的下调基普1，一种抑制耳蜗前体细胞持续增殖的蛋白质，导致剩余感觉祖细胞继续分裂，最终导致其形成区域内的内毛细胞数量过多。这些数据综合起来表明，感觉祖细胞在耳蜗中减少Jag1-cko公司内耳和Notch信号、成纤维细胞生长因子信号和转录因子SOX2都在内耳感觉祖细胞产生的共同或平行途径中发挥作用。

《耳朵上的凹痕》的散文角色

包括p27在内的早期前驱标记的检测基普1和SOX2，证明在Jag1-cko公司内耳，这与这些突变体中祖细胞减少的说法一致。我们的数据表明，JAG1在耳朵发育中起着早期的前感觉作用，这与其他Notch配体DLL1和JAG2在发育后期所起的作用很不一样，后者参与侧向信号传导和分化[10,15]. 这些数据与Notch信号在内耳祖细胞维持中的早期作用一致。在许多其他系统中，包括神经系统和最近在肠上皮中，已经证明Notch信号参与维持细胞处于未分化状态[42–46]. 在哺乳动物的神经系统中，已经证明Notch信号的丢失会导致早期分化和祖细胞库的减少[42]. 与这些发现一致，体外研究表明Notch信号突变体的神经圈生成频率降低[47,48]，表明干细胞潜能丧失。此外，研究还表明，Notch信号可以促进放射状胶质细胞的特性，这种细胞类型被证明是中枢神经系统的祖细胞[49–52]. 我们的结果表明，与神经系统类似，通过JAG1的Notch信号对内耳感觉前体的形成或维持很重要。然而，与神经系统不同，我们没有发现早熟分化的证据，相反，JAG1可能影响感觉前体的规格、存活或增殖能力。

最近来自小鸡的证据表明，JAG1可能对最初的感官规范事件很重要。通过表达Notch的组成活性形式（Notch1-ICD），Daudet等人[14]表明异位感觉斑可以被诱导，表明早期Notch信号可能对感觉区的诱导很重要，而不仅仅是对其维持。然而，应该注意的是，异位感觉区只在耳朵的某些区域形成，这表明这种效果需要一些感觉能力。通过在鸡内耳中过度表达一种活化形式的β-catenin（典型Wnt信号通路的基本成分），也获得了类似的结果[53]. 与Notch1 ICD研究一样，获得了异位感觉区域，但同样，仅在耳朵的某些区域。然而，与诺奇获得功能研究不同，β-catenin的过度表达也导致感觉区特征（即耳蜗到前庭）的改变，这表明Wnt信号不仅控制感觉区是否形成，还控制将形成的感觉区类型果蝇，Notch和Wingless（Wnt信号分子家族的成员）之间的相互作用已经得到了很好的证实[54,55]脊椎动物也开始积累相互作用的证据[45,56,57]. 骨形态发生蛋白（BMP）信号传导对感觉形成也很重要，特别是对感觉嵴，因为BMP4已被证明在小鼠发育早期就标记了小鼠嵴[58]. 在鸡身上的实验表明，阻断BMP信号有时会导致感觉发育障碍[59]. 综上所述，这些数据表明，根据表达模式、先前的研究和本文提供的证据，JAG1是负责耳内Notch通路前感觉功能的配体。此外，Notch通路可能与其他信号通路（如Wnt、FGF和BMP通路）相互作用，以创建适当大小、组织和特征的感觉器官。

感觉仍在发生美洲虎1 cko内耳

一个有些令人困惑的问题是，如果JAG1对感觉祖细胞的发育很重要，为什么在Jag1-cko公司内耳？一种可能是另一个Notch配体正在补偿JAG1功能的丧失。这种解释似乎不太可能，因为没有其他Notch配体在耳朵中显示出与JAG1相似的表达模式。例如Dll1号机组和Jag2型基因在新生毛细胞退出细胞周期并开始分化后表达。然而，除了毛细胞表达外，还存在Dll1号机组耳囊前中央区E10.5左右的基因[4,20]，这可能与JAG1域的至少一部分重叠（请参见图2) [60]. 这个表达域以前被认为与成神经细胞的形成有关，成神经细胞从耳上皮分层，然后分化为神经细胞，为毛细胞提供神经支配[4]. 斑马鱼的研究表明，正确的神经母细胞形成需要Notch介导的侧向信号传导[9]; 然而，在哺乳动物中，尚未明确表明这是Dll1号机组基因在早期发挥作用。这为DLL1表达的早期域可能至少部分参与前体规范提供了可能性，类似于JAG1表达域。

非感觉缺陷Jag1-cko公司内耳

除了在Jag1-cko公司内耳，突变体内耳也表现出无感觉缺陷。具体来说，除了部分前、侧半规管外，大部分半规管缺失。此外，所有三个壶腹均不存在，胞果较小，耳蜗被覆盖。根据最近的研究，这些缺陷可能是仅次于感觉缺陷的。例如，已有研究表明，感觉嵴中表达的FGF通过上调BMP2促进半规管的形成[61]. 因此，嵴的丧失预计会严重影响渠道的形成。来自小鼠突变体的新证据表明，参与感觉形成的基因会导致内耳严重畸形。例如Sox2系统基因导致的畸形与此处描述的非常相似Jag1-cko公司突变体。两种不同突变等位基因的胚胎内耳纯合子Sox2、Sox2lcc/lcc和Sox2系统ysb/ysb,表现为管形成中断；较小的卵泡室和囊状室；和更薄、未煮熟的胭脂虫[25]. 此外，FGF10小鼠敲除也显示嵴发育中断，并伴有椎管结构丢失[62]. 然而，与管结构不同，耳蜗的形成似乎并不严格依赖于Corti器官的发育，因为耳蜗虽然短而薄，但会在没有任何感觉形成的情况下形成[25]. 然而，正常的耳蜗长度似乎依赖于感觉形成，至少部分是通过会聚延伸。最近，在耳蜗中发现了一些导致平面细胞极性缺陷和耳蜗缩短的基因，可能是由于收敛延伸缺陷所致[38,41]. 因此，很可能观察到耳蜗缩短Jag1-cko公司突变体至少部分是由于感觉前体的数量减少导致收敛延伸失败的结果。

此处显示的数据表明Jag1型内耳感觉前体发育需要基因。需要进一步研究来确定JAG1介导的Notch信号在早期感觉祖细胞中的确切作用，以及它与FGF信号和SOX2表达所起作用的关系。了解感觉前体是如何形成的是再生研究的重要先决条件，再生研究可能为治疗听力损失和前庭障碍提供分子工具[63].

材料和方法

建造Jag1型弗洛克斯内奥等位基因。

要构建Jag1型弗洛克斯尼奥等位基因，包含Jag1型通过与1.8-kb小鼠杂交，从RPCI-22（129S6/SvEvTac）小鼠细菌人工染色体库（从研究遗传学获得的过滤器）中分离出基因组位点Jag1型cDNA探针。为了使靶向载体的5′同源区域更短，分离出外显子4上游的2.2-kb KpnI片段，并将其钝端化，亚克隆到含有loxP-FRT-PGK的改良pBS载体的SmaI位点新的-FRT磁带。含有外显子4的1.5-kb KpnI片段也被亚克隆到loxP-FRT-PGK中新的-FRT磁带。为了构建更长的3′同源区，将含有外显子5的3.5-kb KpnI-SmaI片段进行钝端化，并亚克隆到另一个含有单个loxP位点的改良pBS载体的EcoRV位点。然后将该构建物中的3.5kb SmaI-SalI片段克隆到含有白喉毒素基因的pKO 905载体的SmaI-XhoI位点进行阴性选择。来自loxP-FRT-PGK的5.7kb SalI-NotI片段新的-然后将FRT构建克隆到包含3′同源区的pKO 905载体的SalI-NotI位点，以生成最终的Jag1型弗洛克斯内奥目标向量（请参见图1).

的生成Jag1型弗洛克斯老鼠。

这个Jag1型弗洛克斯尼奥如前所述，用Not1将靶向结构线性化并电穿孔到CJ7胚胎干细胞[64]. 利用内外引物集对288个ES细胞克隆的DNA进行PCR筛选，然后用位于靶向结构3′的1.7-kb Stu1-EcoRI片段探测EcoRI-消化DNA，通过Southern blot对阳性克隆进行确认（参见图1). 该探针还检测到远端loxP位点丢失的部分重组事件；在这些情况下，获得了稍大的片段（11kb而不是9.3kb）（参见图1A） ●●●●。使用位于loxP位点两侧的引物（DSLF和J1LoxR1；序列见下文）通过PCR进一步证实了loxP远端位点的存在。将正确靶向的克隆注射到C57BL/6J（B6）囊胚中，获得嵌合小鼠。将嵌合体雄性小鼠与B6雌性小鼠交配，并对agouti子代进行检测，以确定是否存在Jag1型弗洛克斯内奥PCR等位基因Jag1型弗洛克斯尼奥特异性引物。Jag1型弗洛克斯尼奥/+将小鼠进行杂交以产生纯合子Jag1型弗洛克斯尼奥/Jag1型弗洛克斯尼奥后代。纯合子Jag1型弗洛克斯尼奥/Jag1型弗洛克斯尼奥小鼠表现正常和健康，表明新霉素耐药盒（PGK新的)没有负面影响Jag1型表达式。控制PGK存在的任何可能影响新的磁带，FRT侧翼PGK新的盒式磁带通过配对被删除Jag1型弗洛克斯尼奥鼠标至FLPe公司-重组酶表达小鼠(Gt[ROSA]26Sor公司tm1（FLP1）动态;Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine，United States）生产Jag1型弗洛克斯老鼠。两者都有Jag1型弗洛克斯尼奥和Jag1型弗洛克斯在这些实验中使用了小鼠，没有观察到结果表型的差异。将该等位基因的缺失形式与我们之前报道的区分开来Jag1型空突变等位基因（Jag1型del1（删除1）)[35]，我们指定Jag1型Cre重组酶介导的Jag1型弗洛克斯或Jag1型弗洛克斯尼奥等位基因Jag1型del2（删除2）等位基因。

小鼠饲养和基因分型。

福克斯1-Cre老鼠([30]; 罗布·伯吉斯（Rob Burgess）的礼物是在瑞士韦伯斯特（Webster）的长辈背景下保存的。ZP3 Cre公司老鼠([34]; Mimi de Vries和Barbara Knowles的礼物）保持在B6背景。通常情况下，两种基因都杂合的男性福克斯1-Cre等位基因和我们先前构建的Jag1型无效等位基因（Jag1型del1（删除1）)[35]（保持在B6背景上）Jag1型弗洛克斯/Jag1型弗洛克斯保持B6/129背景的雌性。基因型小鼠福克斯1-Cre/+;Jag1型del1（删除1）/Jag1型弗洛克斯和福克斯1-Cre/+;Jag1型del1（删除1）/Jag1型弗洛克斯内奥可以互换使用，并指定为Jag1-cko公司本报告中的老鼠。

要对Jag1型弗洛克斯小鼠，使用的引物为：DSLF，5′-TCAGGCATGATAACCCTAGC-3′（正向）和J1LoxR1，5’-CTACAGATCTACATGC-3′（反向）；这些引物侧翼为5′LoxP位点。为了对CRE介导的重组进行基因分型，使用了3′LoxP位点上游的引物：J1FlpF1，5′-CAGGTAGTGCTGACTTAG-3′，以及J1LoxR1反向引物。为福克斯1-Cre和ZP3-Cre公司等位基因，Cre公司-使用特异性引物：Cre1，5′-TGATGGTCGCAAGAACC-3′（正向）和Cre2，5′-CAATGAGAACGAACCTGG-3′（反向）。Jag1型del1（删除1）突变体的引物如下：JGKO1，5′-TCTCACTCAGGCATGATAAACC-3′（正向）和SOL1，5′-TGGATGTGGGAAATGTGCGAG-3′（反向）。用不同的反向引物JGKO2，5′-TAACGGGACTCCGG ACAGGG-3′检测野生型等位基因。Littermates（野生型，Jag1型del1（删除1）/+或Jag1型弗洛克斯/+)作为所有实验的对照。

补漆和扫描电子显微镜。

The paintfilling of theJag1-cko公司内耳于E15.5进行。该技术的实施如前所述[28]. 如前所述，使用四氧化锇-硫代碳酰肼方法制备内耳以进行SEM[65]. 使用日立3000N扫描电子显微镜（日本东京日立）对样本进行检查。

免疫组织化学和凝集素染色。

为了进行免疫组化，将胚胎头部平分并固定在PBS中4%多聚甲醛中1-2小时。将半个头部嵌入石蜡中，并在标准的7微米切片上进行免疫细胞化学。使用的抗体包括抗Myo7a（1:1000；A.EL-Amraoui和C.Petit的礼物）、抗p27基普1（1:100；英国剑桥郡索姆Stratech公司的Neomarkers）、抗SOX2（1:2000；美国加利福尼亚州特梅库拉Chemicon公司；AB5603）、抗JAG1（1:100）、美国加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz Santa Cruz Biotechnology公司；H-114）和抗S100A1（1:50；丹麦Glostrup Dako公司）。对于所有使用的抗体，通过在10 mM柠檬酸中煮沸切片10分钟来执行抗原回收步骤。使用的二级抗体为Alexa-Fluro 488或546山羊抗鼠或兔抗体（1:400；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）。用DAPI（Vector Laboratories，Burlingame，California，United States）将载玻片覆盖在Vectashield HardSet安装介质中。凝集素染色使用单形狮鹫凝集素（矢量实验室）基本如所述[15].

原位杂交和RT-PCR。

自从Jag1型del2（删除2）突变的等位基因造成DSL结构域的框内缺失，设计了一个原位探针来检测Jag1型弗洛克斯原位杂交等位基因。该探针是通过扩增包含外显子4的433 bp产物（引物：J1-420F，5′-CGACCGTAATCGCATCGTAC-3′和J1-853R，5′-ATGCACTGTGCAGTACAG-3′）并将产物亚克隆到PCR II载体（Invitrogen）中而创建的。对于原位全山胚胎，胚胎在4%多聚甲醛中固定过夜。原位杂交基本上如所述进行[66]. 对于原位耳蜗，从头部解剖内耳并在4%多聚甲醛中固定过夜。在PBS中清洗后，去除耳蜗的骨壳和纹，并在甲醇中脱水。按照说明进行原位杂交[67]，除了杂交后清洗，按照[68]. 对于RT-PCR，从E10.5对照和Jag1型del2（删除2）/Jag1型del2（删除2）胚胎，使用RNEasy试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚齐根）并遵循制造商的说明。使用AMV逆转录酶（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）和特异性引物J1-961R（5′-AGTCCACAGTAATTCAGATC-3′）进行第一链cDNA合成。使用位于外显子4两侧的引物（J1-420F、5′-CGACCGTAATCGCATCGTAC-3′和J1-961R）从cDNA中扩增产物。

致谢

我们感谢A.El Amraoui、C.Petit、R.Burgess、M.de Vries和B.Knowles博士提供的试剂；杰克逊实验室组织病理学和显微镜服务的彼得·芬格（Peter Finger）为扫描电镜处理提供帮助；以及用于胚泡注射的Jackson实验室细胞生物学和微注射核心设施。这项工作得到了美国国立卫生研究院对AEK（DC05865）和TG（NS036437和DK066387）以及Jackson实验室（CA034196）的资助。

缩写

BMP公司骨形态发生蛋白
奇科有条件淘汰赛
动态链接库类Delta
数字用户线Delta-Serrate-Lag2三角洲
E[编号]胚胎期天数
锿胚胎干
FGF公司成纤维细胞生长因子
JAG公司参差不齐的
扫描电镜扫描电子显微镜

脚注

作者贡献。AEK和TG构思并设计了实验。AEK和JX进行了实验。所有作者都分析了数据。AEK撰写了这篇论文。

相互竞争的利益。提交人声明，不存在相互竞争的利益。

本文的前一版本于2005年12月1日作为早期在线发布（DOI:10.1371/journal.pgen.0020004.eor（英文）).

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