βTrCP直接参与Gli3蛋白加工的证据

摘要

分泌型刺猬（Hh）信号蛋白在从昆虫到人类的多细胞生物的胚胎模式中起着基本作用(1,2). 在果蝇属Hh信号通路由含锌指转录因子cubitus interrutus（Ci）介导。在缺乏Hh信号的情况下，全长Ci蛋白（Ci155）的重要部分从其C末端蛋白水解到锌指DNA结合域，生成转录阻遏物Ci75(三). Hh信号通路阻断Ci155的处理并诱导Ci155易位到细胞核(4,5). 因此，Ci蛋白在执行Hh信号转导的转录反应中既有积极作用也有消极作用，并且Ci蛋白处理的调节是Hh信号传导的关键步骤。

虽然Ci处理反应的机制尚未完全理解，但已经证明Ci处理需要cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）活性和Ci蛋白C末端区域内的五个PKA位点(6–8). 前三个PKA位点的磷酸化似乎引发了相邻糖原合成酶激酶3（GSK3）和酪蛋白激酶1（CK1）位点的进一步磷酸化，这两个位点对Ci155的加工也至关重要(9,10). 与这些观察结果一致，Hh途径活性可由蓬松的GSK3的苍蝇同源基因(9,10)或通过RNA干扰（RNAi）介导的CK1αmRNA在培养的苍蝇细胞中的敲除(11).

除了上述三种激酶外纤细中的函数果蝇属也会导致Ci处理失败和Hh信号通路激活(12). Slimb编码SCF复合物的F-box/WD40-重复蛋白(12,13). 对苍蝇Slimb脊椎动物同源物βTrCP的研究表明，βTrCP通过DSpGX特异性结合其磷酸化底物_2-4Sp结合基序，其中Sp指磷酸丝氨酸，X指任何残基(14–21). βTrCP结合将泛素化机制招募到其底物并介导多种泛素的结合，从而导致降解或加工(22). Slimb在Ci加工中的参与增加了Ci加工可能依赖蛋白酶体活性的可能性。事实上，Ci处理可以被特定蛋白酶体抑制剂抑制(4,23). 基于这些观察结果，很容易推测Ci加工是由蛋白酶体介导的。但尚不清楚Slimb是否直接或间接参与Ci处理，因为尚未证明它是否能够结合磷酸化的Ci蛋白。由于难以检测到多泛素化形式的Ci蛋白，有人提出Slimb可能通过未知因子间接起作用(4,11). 为了理解Hh信号的分子机制，区分Ci处理中Slimb作用的直接模式和间接模式非常重要。

脊椎动物的同系物果蝇属Ci包括Gli1、Gli2和Gli3，其中只有Gli3被证明被加工成Gli3-83阻遏物体内(24). 与Ci处理一样，Gli3处理也被Shh信号抑制(24–26)并需要其C末端区域内的PKA和6个PKA位点的活性。然而，尚不清楚βTrCP、CK1和GSK3是否参与Gli3的加工，或者蛋白酶体是否介导Gli3加工。在本研究中，我们发现PKA引发的Gli3磷酸化可进一步通过CK1和GSK3磷酸化，并且PKA引发磷酸化是Gli3加工所必需的。与Slimb在Ci处理中的作用类似，Gli3处理也需要βTrCP。最重要的是，我们证明了βTrCP可以直接结合磷酸化的Gli3蛋白在体外和体内，Gli3在细胞中是多泛素化的，并且Gli3的加工需要蛋白酶体活性。我们的发现有力地支持了βTrCP直接作用于Gli3蛋白以及Gli3加工受蛋白酶体影响的假设。

结果

βTrCP在Gli3蛋白加工中的作用。因为在中进行Ci155处理需要Slimb果蝇属(12)，我们询问βTrCP是否也参与了Gli3蛋白的加工。在HEK293细胞中，Gli3与人βTrCP（hβTrCP）或myc标记的小鼠βTrCP(图1一，车道2、4和6）。然而，用激活PKA的福斯科林（FSK）治疗，通过增加Gli3-83蛋白水平，显著增强了Gli3的处理(图1一，车道3、5和7）。当组成活性PKA共表达或转染鸡肢芽细胞原代培养物时，也观察到βTrCP对Gli3处理的类似增强（数据未显示）。这些数据表明，βTrCP也参与脊椎动物的Gli3加工，并且在PKA下游作用于Gli3的加工。

在单独的窗口中打开

图1。

Gli3处理需要βTrCP。如上述印迹所示，用表达构建物或与βTrCP siRNA或GFP siRNA对照物一起转染HEK293细胞，并用FSK处理过夜。用抗Gli3抗体免疫印迹法检测Gli3蛋白。βTrCP的过度表达导致Gli3-83水平增加(一，将通道5和7与通道3进行比较），而βTrCP RNAi阻止Gli3处理(B类，将车道6与车道4和5进行比较）。

为了确定Gli3加工是否需要βTrCP，使用RNAi敲除内源性βTrCP基因产物。Gli3表达构建物与双链βTrCP小干扰RNA（βTrCP siRNA）共转染，先前已证明该双链βTrCP siRNA能有效地敲低HEK293细胞中的βTrCP RNA(27)，显著抑制Gli3-83的生成(图1B类，将车道6与车道4和5进行比较）。然而，使用对照GFPsiRNA的RNAi对Gli3加工几乎没有影响(图1B类，比较车道5和车道4）。βTrCP RNA的定量RT-PCR分析证实了βTrCP RNAi的作用（图6，发布为支持信息在PNAS网站上）。这些结果表明，Gli3加工需要βTrCP。

通过GSK3和CK1对PKA引物Gli3进行磷酸化。我们之前已经证明，PKA刺激诱导Gli3蛋白的过度磷酸化，这是通过缓慢迁移的Gli3物种在SDS/PAGE中的积累来测量的。Gli3蛋白的过度磷酸化依赖于6个PKA位点(24) (图2B类，将第13条车道与第4条车道进行比较），但不能仅用PKA位点的磷酸化来解释，因为在体外PKA对免疫沉淀Gli3蛋白的磷酸化未引起蛋白迁移的明显变化（数据未显示）。最近的两项研究表明，Ci C末端区域前三个PKA位点的磷酸化引发了相邻GSK3和CK1位点的进一步磷酸化，这似乎是Ci155处理所必需的(9,10). 因为这些位点在Gli3中是保守的，所以我们测试了它们对Gli3蛋白过度磷酸化的作用。

在单独的窗口中打开

图2。

PKA通过CK1和GSK3引发Gli3蛋白的磷酸化。(一)hGli3蛋白的示意图。六个点代表PKA位点，一个填充框代表锌指DNA结合域。箭头表示大致的解理位置。下划线是以粗体显示的PKA磷酸化与S残基的一致序列。行下面的数字对应于Gli3突变结构的指定名称。GSK3和CK1的PKA引物磷酸化位点分别被圈出和装箱。上覆的是可能成为GSK3和CK1磷酸化位点的次级S残基。(B类)免疫印迹分析显示，经双脱氧FSK（ddFSK）和FSK处理后，转染鸡肢芽细胞中蛋白质的迁移率发生了变化，从而检测到Gli3及其突变体的磷酸化。用5%SDS/PAGE分离蛋白质。(C类)CK1和GSK3对GST-Gli3PR（839–920 aa）及其突变体的PKA诱导磷酸化在体外亲和纯化的GST-Gli3PR及其突变蛋白首先在非放射性ATP存在下与PKA催化亚单位孵育，然后在[γ]存在下与CK1或GSK3孵育-³²P] ATP。磷酸化蛋白通过SDS/PAGE进行解析，并通过放射自显影术进行检测。

Gli3 C末端区域包含6个而不是5个PKA位点；六个PKA位点中的第一个位点两侧仅为CK1位点，第二、三和四个位点两侧均为GSK3和CK1位点(图2一). 将点突变单独或组合引入三个GSK3位点或四个CK1位点中的一些位点，包括GSK3站点2、2–3和2–4或CK1站点1–2、1–3和1–4（分别指定为Gli3N2、Gli3N2–3、Gli3G2–4，或Gli3C1–2，Gli3C1-3和Gli3C1-4）。在转染的原代鸡肢芽细胞中检测Gli3突变体蛋白对PKA刺激的磷酸化状态。虽然单个GSK3或CK1位点的突变对Gli3蛋白的磷酸化几乎没有影响（通过蛋白质迁移率变化测量），但两个或多个GSK3和CK1位点突变显著降低了Gli3蛋白质的迁移率变化(图2B类，将车道14–19与车道4进行比较，数据未显示）。减少的程度似乎与突变位点的数量直接相关。然而，Gli3N2–4和Gli3C1–4突变蛋白的迁移速度没有Gli3P1–3和Gli3P3–6快(图2B类，将16和19号车道与11和13号车道进行比较）。这一发现与以下观点一致：体内只有在蛋白被PKA磷酸化后，GSK3和CK1才会磷酸化Gli3。

为了通过GSK3和CK1直接检测PKA引发的Gli3磷酸化，我们进行了在体外顺序激酶反应（参见材料和方法详细信息），使用与GST融合的人Gli3片段（839–920个残基）。融合蛋白GST-Gli3PR(Gli3蛋白灵魂第页egion），包含前四个PKA位点、三个GSK3位点和四个CK1位点，即使没有与PKA预孵育，也被CK1弱磷酸化(图2C类，通道1），表明CK1可以磷酸化融合蛋白而不启动PKA位点在体外然而，与PKA预孵育后，融合蛋白确实通过CK1表现出更强的磷酸化作用(图2，将车道2与车道1进行比较）。PKA磷酸化还诱导GSK3磷酸化融合蛋白(图2C类，将车道7与车道6进行比较）。通过CK1和GSK3进一步证实PKA引发的Gli3磷酸化在体外使用磷酸化位点GST-Gli3PR突变体进行相同的激酶分析。PKA或CK1位点（分别为P1–4和C1–4）的改变显著降低了CK1对融合蛋白的磷酸化作用，尽管不是完全降低(图2C类，将泳道3和4与泳道2进行比较）。类似地，PKA或GSK3位点（N2-4）的突变完全消除了GSK3对融合蛋白的磷酸化(图2C类，将车道8和9与车道7进行比较）。从这些结果中，我们得出结论，Gli3蛋白前四个PKA位点的磷酸化启动了CK1和GSK3对该蛋白的进一步磷酸化在体外.同样的协同磷酸化现象也可能发生体内因为当Gli3在鸡腿芽细胞中表达时，它被过度磷酸化，而蛋白PKA位点的突变则消除了过度磷酸化(图2B类) (24).

GSK3和CK1位点在Gli3加工中的作用。为了确定Gli3磷酸化在Gli3加工中的重要性，我们询问GSK3或CK1位点的突变是否影响Gli3的加工。我们还检测了Gli3PKA（更名为Gli3P）突变体，以便在我们的新转染条件下使用鸡肢芽细胞的原代培养物进行处理。包括Gli3P1–3、Gli3P4–6和Gli3P3–6在内的六个PKA位点的组合突变完全抑制了Gli3的加工，而六个PKA-位点中的每一个的单一突变都导致Gli3–83蛋白水平显著降低(图3一)表明所有六个PKA位点都有助于Gli3的加工，并证实了我们之前的发现(24). 同样，Gli3-C和Gli3-N突变体的Gli3蛋白加工程度似乎与CK1或GSK3位点突变的数量直接相关。而前两个CK1位点或第一个GSK3位点的突变对Gli3的处理几乎没有影响(图3B类第5和第8车道；注意，Gli3N2在这个特定实验中表达较低），所有四个CK1位点或所有三个GSK3位点的突变都完全阻断了Gli3的处理(图3B类，第7和第10车道）。这些结果表明，与PKA位点一样，CK1和GSK3位点也是Gli3处理所必需的。PKA、CK1或GSK3位点的突变也阻止了βTrCP促进Gli3加工的能力（图7，发表于支持信息表明βTrCP作用需要PKA、CK1和GSK3磷酸化位点，βTrCP在这些激酶的下游起作用。

在单独的窗口中打开

图3。

Gli3蛋白中假定的PKA、CK1和GSK3磷酸化位点是Gli3加工所必需的。(一和B类)用野生型Gli3或其PKA位点点突变的突变体构建物转染原代鸡肢芽单层培养物(一)或CK1或GSK3站点(B类)（请参见图2一突变位点）。用FSK、双脱氧FSK（ddFSK）或DMSO载体处理细胞16–18小时，用抗Gli3抗体免疫印迹检测Gli3处理。Gli3P1–3、Gli3P4–6和Gli3P1–6未检测到Gli3–83蛋白(一，11–13车道）和Gli3C1–4和Gli3N2–4(B类，第7和第10车道）。

βTrCP直接与Gli3相互作用。对几种βTrCP底物的研究表明，βTrCP只识别磷酸化的底物(22). βTrCP与其底物的结合招募E1、E2和SCF复合物，以便多泛素链可以与这些底物偶联。尽管绝大多数多泛素化底物随后会被蛋白酶体完全降解，但一些泛素化蛋白质已被证明会受到蛋白酶体介导的有限位点特异性加工。最好的例子是蛋白酶体介导NF-κ(28–33).

由于βTrCP是Gli3加工所必需的，我们接下来通过检查βTrCP和Gli3之间的物理相互作用来询问βTrCP是否直接参与Gli3的加工。如所示图4一βTrCP只有在与野生型Gli3蛋白而非Gli3P1-3、Gli3P3-6、Gli3C1-4或Gli3N2-4突变蛋白共表达时，才能由Gli特异性DNA珠共沉淀（比较平面6和平面7-10）。βTrCP的共沉淀一定是由于它与Gli3蛋白的特异性相互作用，因为当βTrCP单独表达或在没有FSK的情况下与野生型Gli3蛋白质一起表达时，相同的珠未能沉淀βTrCP(图4一，车道4和5）。此外，所使用的Gli结合珠必须特异性识别Gli3蛋白，因为非特异性Gli结合珠既不沉淀Gli3蛋白也不沉淀βTrCP(图4一，泳道1-3）。我们还试图进行一项相互实验，看看抗myc抗体是否可以共免疫沉淀Gli3蛋白，但尝试失败了，很可能是因为沉淀myc-mβTrCP的效率低下。根据这些结果，我们得出结论，βTrCP与细胞中磷酸化的Gli3蛋白相互作用，Gli3中的PKA、GSK3和CK1位点是βTrCP结合所必需的。

在单独的窗口中打开

图4。

βTrCP与Gli3蛋白的直接相互作用。(一)细胞内βTrCP与Gli3的相互作用。将myc-mβTrCP单独或与Gli3或其突变体构建物一起转染HEK293细胞，并用FSK隔夜处理，如下图所示。将细胞中的蛋白裂解物与含有特定Gli-binding共识序列（Gli-bining树脂）或非特异性序列（对照）的DNA-共轭Sepharose珠培养。然后用7%的SDS/PAGE将沉淀的蛋白质溶解，并转移到硝化纤维过滤器中。过滤器被水平切成两半。上半部用抗Gli3抗体进行免疫印迹(上部)下半部分用抗myc抗体免疫印迹检测myc-mβTrCP(下部). (B类)磷酸化Gli3片段与βTrCP之间的相互作用。GST、GST-Gli3PR或其突变体首先用指示的激酶磷酸化，然后用于下拉³⁵S标记的myc-mβTrCP或myc-mαTrCPΔWD蛋白，通过放射自显影术检测。

Gli3 C末端区域存在多个PKA、GSK3和CK1位点，这增加了Gli3蛋白可能包含多个βTrCP结合位点的可能性。为了测试这一点，我们检测了PKA位点Gli3突变体在细胞中结合βTrCP的能力。突变Gli3中第一个或第三个PKA位点（Gli3P1和Gli3P3）显著降低其与βTrCP相互作用的能力(图4一，第12和14车道）。令人惊讶的是，与Gli3P1-6阴性对照组相比，第二或第四PKA位点突变的Gli3蛋白与βTrCP的结合极其微弱(图4一比较第13和15条通道与第18条通道），而第五或第六个PKA位点的突变，两者都缺乏相邻的GSK3和CK1磷酸化位点，对其与βTrCP的结合几乎没有影响(图4一，16–17车道）。我们还检测了一些CK1或GSK3位点Gli3突变体的βTrCP结合。特定的Gli-binding小珠拉下的βTrCP数量与Gli3中突变的磷酸化位点数量成比例相关(图4一，9–10号车道，未显示数据）。总之，这些数据表明Gli3具有一个以上的βTrCP结合位点，前四个PKA位点中的每一个都有助于βTrCP的结合。

为了确定βTrCP是否直接结合Gli3蛋白，我们检测了磷酸化GST-Gli3PR融合蛋白的能力(图2一)降低βTrCP蛋白在体外Myc-mβTrCP仅被单独由CK1或所有三种激酶磷酸化的GST-Gli3PR下调，而不是单独由PKA或GSK3下调(图4B类，通道5-8），表明βTrCP仅结合磷酸化融合蛋白。值得注意的是，CK1磷酸化在体外不是很具体(图2C类（第3和第4通道，数据未显示），这解释了为什么仅由CK1磷酸化的GST-Gli3PR可以降低βTrCP。βTrCP和融合蛋白之间的相互作用必须发生在βTrCP的Gli3PR序列和WD40重复序列之间，因为GST单独不能沉淀βTrCP(图4B类βTrCP中WD40重复序列的删除取消了结合(图4B类，车道4）。然后我们使用磷酸化位点突变融合蛋白来测试结合特异性。尽管初级CK1和GSK3位点的突变并没有消除与βTrCP的结合，这很可能是因为CK1对次级CK1和/或GSK3位点的磷酸化在体外，PKA位点突变体GST-Gli3PR-P1–4未能结合βTrCP(图4B类，将通道9与通道10和11进行比较），表明βTrCP结合需要PKA位点。总之，我们的结果表明，βTrCP与磷酸化的Gli3直接相互作用。

蛋白酶体在Gli3加工中的作用。βTrCP和Gli3蛋白之间的磷酸化依赖性直接相互作用支持了Gli3加工由蛋白酶体介导的假设。如果是这样，Gli3将是多泛素化的，蛋白酶体活性的抑制将阻碍Gli3的加工。事实上，虽然仅用FSK处理转染的HEK293细胞可诱导Gli3处理，但用FSK和MG115（一种特异性蛋白酶体抑制剂）处理相同的转染细胞可阻断Gli3的处理(图5一，比较车道5和车道4）。

在单独的窗口中打开

图5。

蛋白酶体依赖的Gli3处理。(一)免疫印迹显示，用蛋白酶体抑制剂MG115处理转染的HEK293细胞可阻断Gli3处理。(B类)Gli3是多泛素化的。用上述印迹所示的表达结构转染HEK293细胞。变性后，用抗Gli3或抗myc抗体对细胞的蛋白裂解物进行免疫沉淀，然后用免疫印迹法进行免疫印迹，如下图所示。

为了确定Gli3是否是多泛素化的，选择了Gli3–1-1048，一种在1048残基之后截短的结构体，以便于分离和检测多泛素形式的Gli3，因为它的尺寸较小，但仍能有效处理（图8，发表于支持信息在PNAS网站上）。将HEK293细胞与myc-Ub（myc-tagged ubiquitin）、Gli3-1-1048和PKA*（一种组成活性PKA）共同转染(34)构造，或将三个构造中的两个组合作为控件。共免疫沉淀法检测Gli3蛋白的泛素化。如所示图5B类只有当Gli3-1-1048和myc-Ub同时表达时，myc抗体才沉淀出几个缓慢迁移的蛋白质物种，而当myc-Ub单独表达时，则没有沉淀出，这表明这些是Gli3蛋白的泛素化形式。在没有PKA*的情况下也检测到了泛素化形式的Gli3–1-1048，尽管它们的水平低于存在PKA*时的水平(图5B类，将通道5与通道6进行比较），表明内源性PKA活性足以诱导一定水平的泛素化。这一发现与我们的观察一致，即Gli3蛋白可以在没有PKA刺激的情况下进行加工(图1一，车道2）。同样，抗Gli3抗体也能沉淀泛素化形式的Gli3蛋白，尽管效率较低(图5B类可能是因为抗体的亲和力低于myc抗体。综上所述，这些数据表明Gli3在转染细胞中确实是多泛素化的。

讨论

我们之前已经证明，PKA刺激可导致Gli3的过度磷酸化，如凝胶流动性降低所测(24). 像飞翔中的词(9,10)我们目前的研究表明，这种过度磷酸化主要是由于PKA引发的邻近PKA位点的GSK3和CK1位点（初级位点）的磷酸化，以及随后通过初级GSK3与CK1位点磷酸化引发的次级GSK3及CK1位点的磷酸化。原则上，PKA、CK1和GSK3可以磷酸化Gli3PR区域中多达19个丝氨酸残基：四个PKA位点、三个初级GSK3位点、四个初级CK1位点以及八个次级GSK3和CK1位点(图2一). 次级CK1和GSK3位点很可能在细胞中被磷酸化，因为初级CK1位点或GSK3部位的突变显著减少了过度磷酸化的Gli3物种(图2B类).

与PKA位点一样，Gli3蛋白中的主要GSK3和CK1位点也是Gli3加工所必需的。任何一组PKA位点、初级GSK3或CK1位点的突变也会抑制βTrCP促进Gli3加工的能力，这表明磷酸化是βTrCP作用的先决条件。事实上，在这里我们证明βTrCP直接结合细胞中磷酸化的Gli3蛋白和在体外，表明βTrCP直接作用于Gli3，而不是另一种未鉴定的因子。此外，由于PKA、CK1和GSK3位点在Gli3和Ci之间是保守的，因此Slimb很可能也直接作用于Ci。

βTrCP识别序列是根据其与许多其他底物的相互作用而定义的。早期研究确定了DSpGX₂Sp作为βTrCP的结合基序(14–20)但最近的两项研究表明，βTrCP可以结合广泛的序列。它能够绑定DSpGX₄Cdc25A的Sp基序(21)在两个磷丝氨酸之间有五个残基。也有人建议它结合Wee1蛋白中的EEGFGSp和DSpAFQE序列，其中E残基被认为模拟DSpGXXSp基序中的两个磷酸丝氨酸之一(35). 因此，βTrCP结合共识序列似乎比最初认为的更为多样，这使得βTrCP能够靶向更广泛的蛋白质。

对Gli3PR氨基酸序列的检查表明，没有已知的βTrCP结合的一致序列。这一发现提出了Gli3中哪些序列基序与βTrCP结合的问题。我们使用Gli3突变体进行的蛋白质-蛋白质结合分析表明，细胞内βTrCP结合需要PKA、初级CK1或GSK3位点的磷酸化(图4)，但结果并不一定表明这些磷酸化位点实际上与βTrCP直接接触。事实上，Gli3中PKA位点和初级CK1位点之间的距离只有两个残基，PKA位点与初级GSK3位点之间有三个残基。其中两个是已知βTrCP结合基序中从未发现的基本R残基。两个磷酸丝氨酸之间如此短的间隔区使得前四个PKA位点和初级GSK3和CK1位点都不太可能与βTrCP直接结合。为了支持这一观点，我们发现所有四个主要CK1或GSK3位点的突变并不影响磷酸化GST-Gli3PR融合蛋白结合βTrCP的能力在体外而PKA位点的突变确实消除了βTrCP结合(图4B类). 如果PKA位点和次级而非初级CK1和/或GSK3位点是实际参与βTrCP结合的位点，则可以解释这些结果。PKA位点和次级GSK3和/或CK1位点相隔5或6个残基(图2一)因此类似于Cdc25A中的βTrCP结合基序。两者之间的差异在体外和体内磷酸化是指CK1可以磷酸化Gli3中的非质控丝氨酸残基在体外例如次级CK1位点，甚至可能是次级GSK3位点，当初级CK1和GSK3突变时，而细胞内的PKA、CK1和GSK3活性受到很好的调节，因此PKA位点的磷酸化启动了初级GSK3和CK1位点的启动，从而启动了次级GSK2和CK1部位。因此，初级CK1和GSK3位点的突变会阻止次级CK1和GSK3位点磷酸化，从而阻止Gli3与βTrCP结合。有八个次级CK1和GSK3位点，包括Gli3中紧邻第二、第三和第四个PKA位点的位点(图2一). 这些S残基一旦磷酸化，就会带负电，并可能模拟βTrCP结合基序中的D残基：DSpGX_2-4Sp.这可能很难测试，因为突变改变的次级CK1和GSK3位点可能会干扰PKA对Gli3的磷酸化，因为八个位点中有三个位于PKA共识序列内。我们的在体外和体内结合分析支持磷酸化PKA位点和次级CK1和/或GSK3位点直接参与βTrCP结合的观点。对PKA位点Gli3突变体的分析也显示Gli3PR区域存在多个βTrCP结合位点。这种冗余序列安排可能会增加Gli3蛋白处理的稳健性，而Gli3蛋白质处理是正常胚胎发育的关键事件。

尽管绝大多数βTrCP底物在其多泛素化后会完全降解，但至少有一个例外。NF-κ(28–33). Gli3/Ci处理的几个特征让人想起NF-κBp105处理。首先，与NF-κBp105一样，Ci和Gli3都是以特定位点的方式处理的。其次，Gli3和NF-κB105在细胞中都是多泛素化的，Gli3/Ci和NF-kb B105的处理依赖于蛋白酶体的活性(图5) (4,23). 第三，与Gli3/Ci和NF-κB105的C末端片段被蛋白酶体降解的想法一致，在蛋白质加工后从未检测到它们。第四，NF-κB和Gli3/Ci的加工都需要其C末端的磷酸化，磷酸化的Gli3和NF-κBp105蛋白都可以通过βTrCP结合(图4) (36). Gli3和NF-κBp105磷酸化之间的唯一区别是，前者在多个位点被至少三种激酶磷酸化，而后者在较少的位点仅被IκB激酶磷酸化(36). 这些观察结果有力地表明，与NF-κB加工一样，Gli3加工是由蛋白酶体介导的。然而，不能排除Gli3被位点特异性蛋白酶切割的可能性，因为蛋白酶体可能在切割后简单地降解多泛素化的Gli3 C末端区域。如果这被证明是真的，那么人们会预测删除切割位点会抑制加工，因为切割位点周围的氨基酸序列通常对蛋白质的正确切割至关重要。与这一预测相反，我们发现其切割位点被删除的Gli3突变体仍然得到有效处理（数据未显示）。据报道，Ci155也有类似的观察结果(37). 综上所述，这些观察结果支持了Gli3加工直接受蛋白酶体影响的假设，尽管还需要进一步的研究来最终证明这一点。

材料和方法

DNA构建。参考文献中描述了人Gli3（hGli3）及其PKA位点突变体的表达结构。24，但这些突变体被重命名为Gli3P，后跟一个站点编号。基于PCR-的突变用于将hGli3中的丝氨酸残基在第一个、第二个、第三个和所有四个推测的CK1磷酸化位点（残基852、868、880和910）以及第一个、两个和所有三个推测的GSK3磷酸化位点（残基861、873和903）转变为丙氨酸，指定为Gli3C1、Gli3C1-2、Gli3G1-3、Gli3A-4、Gli3N2、，分别为Gli3N2-3和Gli3N2-4。Gli3–1-1048（1–1048 aa）结构体是通过限制性酶切和PCR策略相结合生成的。Gex2T-Gli3PR（839–920 aa）、Gex2T-Gli3PR-P1–4（前四个PKA位点突变）、Gex2T-Gli4PR-C1–4和Gex2T-Gli3PR-N2–4通过PCR产生，并插入pGex2T载体（Amersham Pharmacia）的BamHI和EcoRI位点。通过RT-PCR将myc标记的人类泛素结构myc-Ub克隆到pRK表达载体中。Myc-mβTrCP、hβTrCP和PKA*（组成活性PKA）(34)参考文献中描述了这些结构。13和18Myc-mβTrCPΔWD是通过从BglII位点缺失到mβTrCR的终止密码子而产生的。

细胞培养、转染和分析。细胞培养、转染、药物治疗、免疫沉淀和免疫印迹分析主要按照参考文献所述进行。24为了确定蛋白酶体依赖性Gli3处理，用FSK（40μM）和MG115（50μM）处理细胞6 h。用于检测泛素化Gli3蛋白的细胞首先在带有100μl变性缓冲液（1%SDS/50 mM Tris，pH 7.5/0.5 mM EDTA/1 mM DTT）的六孔板中进行裂解。在100°C下培养5分钟后，用裂解缓冲液将裂解产物稀释10倍，然后进行联合免疫沉淀和免疫印迹分析。利用亲和性Sepharose微球结合含有Gli-binding位点的双链寡核苷酸，实现βTrCP与磷酸化Gli3蛋白的共沉淀(38). 如参考文献所述，制备亲和性Gli-binding Sepharose微球。39由以下寡核苷酸序列组成：A1 Gli-binding位点、5′-TGG GCG AAG ACC ACC CAC AAT GA（sense）和5′-ACC ATC ATT GTG GGT GGT CTT CG（antisense）；B1 Gli结合位点、5′-GAT CCG TGG ACC ACC CAA GAC GAA ATT（有义）和5′-GAT CAA TTT CGT CTT GGG TGG TCC ACG（反义）；非特异性Gli-binding位点，5′-GAT CAC AGA TAC ATC TCT CAG ACT GC（义）和5′-GTA CGC AGT CTG AGA GAT GTA TCT GT（反义）。βTrCP的RNAi主要按照参考文献所述进行。27.

体外试验磷酸化和结合分析。将亲和纯化的GST-Gli3PR及其突变体与PKA催化亚单位（Sigma）在30°C下在ATP存在下孵育30分钟。在洗去PKA和ATP后，将融合蛋白与CK1和GSK3（NEB，Beverly，MA-³²P] ATP在30°C下保持30分钟。通过放射自显影术检测磷酸化蛋白。对于结合分析，≈5μg新制GST融合蛋白在谷胱甘肽珠上磷酸化，并与[³⁵S] 使用TNT系统（Promega）在150μl含有0.1%Triton X-100的裂解缓冲液中制备的蛋氨酸标记的myc-mβTrCP或myc-mαTrCPΔWD，在4°C下旋转1h。谷胱甘肽珠用裂解缓冲液广泛洗涤后，用SDS/PAGE分离蛋白质。结合βTrCP通过荧光造影和放射自显影检测。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：B.W.设计的研究；B.W.和Y.L.进行了研究；B.W.分析数据；B.W.写了这篇论文。

利益冲突声明：未声明冲突。

缩写：Hh，刺猬；词，肘中断；PKA、cAMP依赖性蛋白激酶；CK1，酪蛋白激酶1；糖原合成酶激酶3；RNA干扰；siRNA，小干扰RNA；myc-Ub，myc-标记泛素；FSK，forskolin公司。

工具书类