斑马鱼视网膜中微小染色体维持蛋白5的缺失导致细胞周期缺陷和凋亡

摘要

细胞周期中基因组的正确复制对生物体的生命至关重要。在真核生物中，每个复制源都“被授权”在每个细胞周期内通过依赖细胞周期的复制前复合体（preRC）的形成和破坏而激发一次(1–三). 该前RC的一个关键组成部分是六种结构相关蛋白的家族，即MCM2到-7，在所有真核生物中进化保守。MCM蛋白最初被鉴定为微小染色体维持所需的蛋白质酿酒酵母(4). MCM2至-7属于大型AAA+ATP酶家族的一个独特亚群(5)并共享约200个氨基酸的保守中心区域（MCM-box）。生物化学研究爪蟾已确立MCM2至-7作为复制许可因子的作用(6–8). 随后的研究表明，通过细胞周期依赖性蛋白激酶对MCM2至-7蛋白和前RC其他成分之间的功能性相互作用进行适当的协调，导致DNA合成在每个细胞周期开始一次(9,10). MCM2至-7蛋白似乎形成了异六聚体，并在DNA复制的起始和延伸中发挥重要作用(4,11,12). 此外，最近的证据支持MCM参与许多其他染色体事务，包括转录、染色质重塑和基因组稳定性(13). 然而，体内对多细胞生物中MCM蛋白功能的分析一直很少。在这里，我们报道了MCM家族蛋白中脊椎动物突变体的分离、定位克隆和深入表征。我们证明斑马鱼850米等位基因在微小染色体维持蛋白5基因和在晚期增殖组织中表现出发育缺陷，包括视网膜和大脑。我们专注于对视网膜发育的分析，因为它的细胞类型和增殖模式得到了很好的描述，并表明微小染色体维持蛋白5在发现视网膜干细胞和祖细胞的区域表达。此外，我们发现MCM5水平降低导致斑马鱼视网膜S期延长、细胞周期进展缺陷和强烈的凋亡激活。在顶盖和后脑中也观察到凋亡的激活，但在其他增殖组织中未观察到，这表明MCM5水平降低存在组织特异性反应。

材料和方法

鱼类维护和突变筛选。斑马鱼的维护和繁殖是在28.5°C的标准条件下进行的(14). 胚胎被分期并固定在所需的时间点[受精后小时或天（分别为hpf或dpf）]在PBS中的4%多聚甲醛中。为了避免黑色素的形成，胚胎在0.2 mM 1-苯基-2硫脲（Sigma）中孵化。微小染色体维持蛋白5^850米在我们实验室进行的乙基亚硝基脲诱变筛选中分离出(15).

现场杂交、免疫组织化学、软骨染色和细胞凋亡检测。整体安装就地如参考文献所述进行杂交。16地高辛或荧光素标记的反义RNA探针是使用RNA标记试剂（罗氏生化试剂）制备的。我们为以下基因制备了RNA探针：第个(17),路径5(18)和视紫红质（弗莱堡大学K.Durr的礼物）。为生成反义探针微小染色体维持蛋白5，N末端725-bp的片段微小染色体维持蛋白5该基因经PCR-扩增。按照参考文献所述进行免疫组织化学。15.抗Zn5(19)以1:1000稀释度使用抗BrdUrd（Becton Dickinson）和抗磷酸组蛋白H3（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）。用振捣器将全套染色胚胎切成15μm的切片。将未染色的3-dpf胚胎嵌入塑料（Technovit，Heraeus）中，切割成6μm的切片，并用亚甲基蓝溶液染色几分钟。对于S期分析，48-hpf胚胎在10 mM BrdUrd溶液（蛋水中含有15%二甲基亚砜）中在室温下孵育15分钟，立即固定在PBS中4%多聚甲醛中，并嵌入石蜡中。对厚度为6μm的横切面进行抗原热回收。使用生物素-亲和素-辣根过氧化物酶系统（Vectastain ABC-kit，Vector Laboratories）进行检测。使用Apoptag过氧化物酶进行TUNEL分析就地细胞凋亡检测试剂盒（Intergen）。将固定和渗透的胚胎在乙醇/乙酸混合物中培养15分钟，然后在平衡缓冲液中培养，然后在末端转移酶溶液中培养。地高辛标记的DNA片段用与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体检测。抗活性caspase-3免疫组织化学和MCM5蛋白检测在支持材料和方法，发布为支持信息在PNAS网站上。

的映射和克隆微小染色体维持蛋白5^850米。我们绘制了微小染色体维持蛋白5^850米使用批量聚集分析(20)来自F的混合DNA₂纯合子突变体和F₂来自微小染色体维持蛋白5^850米AB×印度地图十字。我们联系了微小染色体维持蛋白5^m850毫米单核苷酸序列多态性标记z11015和z59609之间的连锁群3。我们根据EST fa94d12和netrin基因的序列生成了额外的多态性标记。z59609用于识别来自Well-come Trust Sanger Center BAC指纹项目的细菌人工染色体（BAC）zC100E2(www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/WebFPC/zebrafish网站). BAC zC100E2的末端序列用于从Wellcome Trust Sanger斑马鱼基因组项目组合中鉴定contig z06s019176(www.ensembl.org/Danio_rerio). 这个微小染色体维持蛋白5序列在该contig中确定，并表示与EST相同的序列{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC044460”，“term_id”：“27882311”，“term_text”：“BC 044460“}}BC044460号。微小染色体维持蛋白5从7个dpf产生的cDNA中分离850米对突变体及其同胞胚胎进行了测序，揭示了来自微小染色体维持蛋白5^m850毫米突变胚胎。从个体基因组DNA中扩增出围绕外显子2的≈500-bp区域微小染色体维持蛋白5^850米突变体及其兄弟胚胎。对这些PCR产物进行测序后发现，突变胚胎第二外显子末端的剪接供体位点发生了T-C碱基变化。

RNA注射。要生成微小染色体维持蛋白5mRNA，全长微小染色体维持蛋白5从野生型胚胎的cDNA中进行PCR-扩增，并克隆到pCS2+载体（Clontech）中。使用mMessage mMachine试剂盒（Ambion）生成合成帽状mRNA，并将200 pg的mRNA注入单细胞期胚胎。吗啉注射程序见支持材料和方法。

DNA含量分析。从麻醉的48至50-hpf突变和野生型胚胎中解剖视网膜。在L15组织培养基（Sigma）中，在20单位/ml木瓜蛋白酶中室温培养1小时，然后使用火焰抛光玻璃吸管反复研磨，获得单细胞悬浮液。将细胞重新悬浮在pH 6.5的4 mM柠檬酸盐缓冲液中，缓冲液中含有0.1 mg/ml碘化丙啶（Sigma）、200μg/ml RNase和0.1%Triton X-100，并在4°C的黑暗中保存，直至分析。使用Becton Dickinson FACS-Calibur机器进行数据采集，并使用程序进行分析牢房任务。

结果

m850毫米突变胚胎显示视网膜细胞数量减少。我们隔离了850米基于酪氨酸羟化酶数量的严重减少，在影响儿茶酚胺能系统形成的突变基因筛查中的突变等位基因(第个)-突变胚胎中枢神经系统中的表达细胞。此外，850米与野生型胚胎相比，突变胚胎在dpf3期间出现形态缺陷，包括较小的视网膜和头部(图1A类和B类). 颌骨和鳃弓仍然较小，在突变胚胎中发育不正常（见图6，发表于支持信息在PNAS网站上）。相比之下，突变型和野生型胚胎的整体体型相似，包括体节和脊索在内的早期形成组织在发育的前4天基本正常。为了更好地理解850米突变体，我们将表型分析的重点放在视网膜上，因为它包含几个特征明确的细胞类型，其细胞增殖模式也得到了很好的描述(21). 斑马鱼的视网膜，就像脊椎动物的典型一样，由三个主要的细胞-身体层组成。最内层的神经节细胞层由神经节细胞组成，其突起形成视神经。无长突、双极和水平细胞位于中间的内核层，感光细胞位于最外层的感光层(图1C类). 在m850毫米突变体视网膜，在dpf3处，各层的相对位置似乎保留在中央视网膜中；然而，每层细胞的数量大大减少(图1D类).

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图1。

850米突变胚胎的视网膜细胞数量减少。活野生型(A类)以及850米突变体(B类)胚胎在3dpf。较小的头部和较小的眼睛是850米突变体。(C类和D类)在3 dpf下通过眼睛的横切面，用亚甲蓝染色。(C类)野生型视网膜在三个核层（GCL、INL和PR）和两个丛状层中显示出特征性分层。(D类)在850米突变的胚胎，视网膜层发生分层，尽管所有三个视网膜核层的细胞数量都严重减少。(E类和F类)用抗Zn5（α-Zn5）抗体染色的3-dpf胚胎的横切面显示野生型中存在视神经(E类)以及850米突变体(F类)胚胎，尽管强度降低。(G公司和H（H）)野生型胚胎视网膜横切面(G）显示酪氨酸羟化酶表达检测到的多巴胺能无长突细胞(第个)3 dpf。多巴胺能无长突细胞也可以在突变胚胎中检测到(H（H）). (我和J型)通过视紫红质表达检测到的3-dpf胚胎视网膜横切面显示出视杆感光细胞(罗德州。). 突变体中可以清楚地看到分化的杆状光感受器(我). (A类和B类)侧视图，左前，背向上；(C类–J型)横切面，背向上。（比例尺，100μm）黑色箭头表示视神经(F类)多巴胺能无长突细胞(H（H）)或感光细胞(J型). GCL，神经节细胞层；INL，内核层；PR，感光层。

阐明分化和细胞类型规格在850米突变视网膜，我们使用了三层视网膜中每一层的分化细胞类型标记。在斑马鱼中，Zn5单克隆抗体识别Ig超家族神经蛋白/DM-GRASP的表面粘附分子(22)并标记视网膜神经节细胞及其投射物。虽然强度降低，但在突变视网膜中可以清楚地看到视网膜神经节细胞的投影(图1E类和F类). 为了测试其他视网膜层细胞的分化是否受到影响，我们使用第个标记内核层无长突细胞多巴胺能亚群的表达(17)和视紫红质表达来标记光感受器。我们在突变视网膜中检测到这两种神经元类型，尽管它们的细胞数量严重减少(图1G公司–J型). 这些结果表明，在m850毫米与野生型胚胎相似的突变胚胎以及850米视网膜突变可能涉及细胞增殖或细胞存活。

这个850米突变扰乱斑马鱼微小染色体维持蛋白5基因。为了阐明850米突变后，我们通过位置克隆策略确定了受影响的基因。使用基于简单序列多态性标记的映射(23)和EST衍生标记，我们定义了0.45 cM的临界区间，两侧是标记z59609和EST fa94d12(图2A类). 利用z59609序列，我们从Wellcome Trust Sanger斑马鱼基因组序列数据库中分离出BAC zC110E2，其末端序列与contig z06s019176重叠(www.emsembl.org/Danio_rerio). 由该连接性序列产生的多态性标记在1786次减数分裂中没有重组事件，表明该突变非常接近。contig z06s019176包含两个ORF：一个ORF在蛋白质水平上与人类MCM5具有80%的同源性，另一个ORF:血红素加氧酶1(hmox1型)基因。在脊椎动物中，Hmox1将细胞血红素分解代谢为胆绿素、一氧化碳和游离铁(24)在斑马鱼中，表达于胚胎外卵黄合胞层、晶状体和少量血细胞（Thisse等。，2004年网址：www.zfin.org). 因为hmox1型在我们观察到最强突变表型的组织中不表达，包括视网膜和大脑，我们决定将重点放在微小染色体维持蛋白5基因用于我们的突变搜索。基因组测序微小染色体维持蛋白5来自突变胚胎的基因座在第二外显子末端高度保守的剪接供体位点中显示了T-C碱基的变化(图2C类). 使用突变体和野生型胚胎的mRNA进行RT-PCR显示微小染色体维持蛋白5缺失整个第二外显子的突变胚胎中的转录物(图2B类). 突变转录本包含一个框架移位和一个氨基酸74处的提前终止密码子，导致蛋白质缺少约90%的野生型序列，包括高度保守的MCM盒，因此可能是一个空等位基因(图2D类). 提供进一步证据微小染色体维持蛋白5基因在850米等位基因，我们通过微小染色体维持蛋白5将信使核糖核酸注射到突变胚胎中并进行表型复制850米吗啉敲除实验(图2E类–G公司; 图7和图8发布为支持信息在PNAS网站上）。综合起来，我们的结果表明850米是斑马鱼的非晶突变等位基因微小染色体维持蛋白5轨迹。因此，我们将引用850米突变为微小染色体维持蛋白5^850米从这里开始。

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图2。

斑马鱼微小染色体维持蛋白5基因在850米。(A类)连锁群3（LG 3）的遗传图和微小染色体维持蛋白5显示突变位置的位点。列出了一些最接近的简单序列多态性和SNP标记，它们与突变的遗传距离表示为总共1786个减数分裂中重组子的数量。(B类)使用外显子1和3的引物对野生型和突变RNA进行RT-PCR，发现突变转录物较短。M、 100 bp DNA阶梯。(C类)野生型、杂合子和突变胚胎第2外显子3′端基因组序列的色谱图。突变胚胎中的T-C碱基变化影响两个核心碱基中的第一个，在真核剪接供体位点中高度保守。(D类)跳过外显子2产生一个框架移位，在突变胚胎的氨基酸残基74处引入一个终止密码子。(E类–G公司)RNA拯救850米突变表型。根据眼睛和头部的大小以及多巴胺能无长突细胞的存在来判断突变表型第个全安装就地3 dpf杂交。所有图片均显示侧面视图，背面朝上。(E类)野生型视网膜。(F类)850米视网膜突变。(G公司)注射200 pg微小染色体维持蛋白5RNA进入850米突变胚胎挽救了突变表型(n个=第19页，共26页）。

尽管微小染色体维持蛋白5^850米很可能是一个空等位基因，母体提供的微小染色体维持蛋白5mRNA和MCM5蛋白可能部分替代微小染色体维持蛋白5在早期胚胎发育期间。通过产生针对MCM5蛋白的抗体，我们证明了母体来源的MCM5蛋白质的存在，其在斑马鱼胚胎中持续存在超过3dpf（见图9，发表于支持信息在PNAS网站上）。

微小染色体维持蛋白5表达与细胞增殖模式相关。了解有关的功能的更多信息微小染色体维持蛋白5在斑马鱼视网膜中，我们使用全量法分析了其在发育过程中的表达模式就地杂交。在≈28 hpf之前，斑马鱼视网膜由明显均匀的快速增殖的神经上皮细胞组成(25,26). 终末有丝分裂开始于≈28 hpf，并以两个10小时间隔的三次大爆发持续(27). 到这一时期结束时，大多数视网膜细胞的增殖速度已经减慢（58 hpf）；然而，它在睫状体边缘区（CMZ）持续存在，在那里视网膜干细胞得以维持，甚至在成年鱼中也是如此(28,29). 的模式微小染色体维持蛋白5斑马鱼视网膜中的表达与这种增殖模式密切相关。早些时候，微小染色体维持蛋白5在整个视网膜中普遍表达（数据未显示）。然而，38 hpf，微小染色体维持蛋白5在视网膜中发生分化但在包括CMZ的区域中维持的地方，表达已经开始减少(图3A类). 58 hpf，微小染色体维持蛋白5只有在CMZ中才能检测到表达(图3C类).

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图3。

在视网膜中，微小染色体维持蛋白5在含有分化细胞的区域表达下调，但在含有视网膜干细胞的区域保持不变。(A类–C类)野生型胚胎全移植后视网膜的横切面就地杂交微小染色体维持蛋白5. (A类)在38 hpf时，而微小染色体维持蛋白5视网膜中表达广泛，边缘区表达较强。48岁时(B类)和58(C类)hpf，强微小染色体维持蛋白5在睫状体边缘区（cmz）保持表达，但在视网膜的其他区域表达下调。(D类–F类)的表达式增殖细胞核抗原（蓝色）(E类)，标记非分泌性增殖细胞，与微小染色体维持蛋白5（红色）(D类)导致棕色染色(F类). (G公司)第5小时（蓝色），标记完全分化前的神经元，与微小染色体维持蛋白5（红色）。(H（H）)弹性体3（蓝色），标记完全分化的神经元，与微小染色体维持蛋白5（红色）。前部向上。

为了阐明其中的细胞类型微小染色体维持蛋白5我们比较了微小染色体维持蛋白5与增殖细胞核抗原(增殖细胞核抗原),路径5、和弹性体348 hpf时(图3D类–H（H）). 鉴于增殖细胞核抗原在非分泌性增殖细胞中表达，bHLH转录因子的表达路径5是斑马鱼视网膜神经发生的首批标志之一。第5小时在25hpf时首先在腹鼻视网膜的一小群细胞中表达，并且其表达以分化前的方式扩散(18). 48 hpf，第5小时在视网膜母细胞和可能的有丝分裂后神经元中表达，但在中央视网膜的分化细胞中不表达。相反，斑马鱼弹性3该基因编码与果蝇这是分化神经元的早期标志(30). 在脊椎动物视网膜中，弹性体3在神经节细胞和核内层的大多数无长突细胞中表达(31). 我们的分析表明微小染色体维持蛋白5和增殖细胞核抗原在相同的增殖细胞群中表达(图3F类).微小染色体维持蛋白5和弹性3以赞美的方式表达，几乎没有重叠，而5千立方厘米-和第5小时-表达域部分重叠(图3G公司和H（H）)，揭示了这一点微小染色体维持蛋白5CMZ区增殖性视网膜细胞中的表达保持不变，但在中央视网膜的分化细胞中表达下调。

中枢神经系统组织中细胞凋亡的激活微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎。 微小染色体维持蛋白5^m850毫米突变胚胎在5到10dpf之间死亡，头部和眼睛较小。为了测试这是否是由于缺乏细胞增殖或是否与程序性细胞死亡的激活有关，我们在微小染色体维持蛋白5^850米在母系衍生的MCM5水平显著降低后，48hpf的突变体。我们观察到视网膜、顶盖和后脑中细胞凋亡的强烈激活(图4). 这种激活在2 dpf时最为显著，并且持续超过3 dpf(图4和数据未显示）。使用抗活性caspase-3通过免疫组织化学方法检测到相同的凋亡模式（见图10，发表于支持信息在PNAS网站上）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是一种在细胞凋亡早期激活的关键蛋白酶，因此是细胞凋亡的敏感和特异性标记物(32). 总之，这些结果表明程序性细胞死亡的激活可能是导致微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎。有趣的是，视网膜和顶盖只是斑马鱼胚胎中2-3 dpf时的一些增殖组织。强大微小染色体维持蛋白5在前脑心室区、鳃弓和内胚层（Thisse等。，2004年网址：www.zfin.org; S.R.和W.D.，未发表数据），在2 dpf时未显示凋亡激活(图4A类和J型)或3 dpf（未显示数据）。这一结果表明，不同的增殖组织可能采用不同的细胞程序来应对MCM5水平的降低。

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图4。

细胞凋亡在中枢神经系统组织中被激活850米突变胚胎。(A类–J型)TUNEL法检测全山野生型和微小染色体维持蛋白5^850米2 dpf下的突变胚胎。(A类和B类)在突变胚胎中，视网膜、顶盖和后脑中的细胞凋亡被激活。(C类–H（H）)微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎显示视网膜中有更多凋亡细胞(C类和D类)，顶盖(E类和F类)和后脑(G公司和H（H）)但不在鳃弓和脑室区(我和J型)与野生型胚胎相比。(A类–D类)横向视图；(E类–H（H）)背视图；(我和J型)腹部视图。向前向左。（比例尺，100μm）ba，鳃弓；hb，后脑；t、 顶盖；心室区。

视网膜细胞周期进展性缺陷微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎。接下来我们研究了视网膜细胞对MCM5水平降低的反应。为了检测复制和细胞周期进展中的潜在缺陷，我们对丙碘染色的视网膜细胞进行了FACS分析，以测量每个细胞的DNA含量。在这个实验中，我们使用了48到50 hpf的胚胎，当母体衍生的MCM5蛋白水平微小染色体维持蛋白5^850米突变体已经显著减少，并且可以从形态学上区分突变体胚胎。典型的DNA含量分布如下所示微小染色体维持蛋白5^850米突变型和野生型细胞(图5A类). 在48 hpf时，野生型胚胎的大多数视网膜细胞处于G₁阶段。相反，视网膜微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎含有更多的细胞，其DNA含量>2C（1C=一个单倍体基因组当量）。为了评估含有4C DNA的细胞的位置，我们分析了24 hpf下野生型胚胎的视网膜细胞(图5A类). 我们推断G₂/在这些细胞中很容易检测到M峰，因为斑马鱼视网膜在此阶段迅速增殖。突变胚胎中第二个峰值的DNA含量与野生型24-hpf胚胎的DNA含量非常相似，这表明许多突变细胞可能已经完成了大部分DNA的复制。对四个独立实验的总结分析表明，野生型视网膜中>2C DNA含量的细胞比例<10%，而野生型视网膜的细胞比例>30%微小染色体维持蛋白5^850米变异视网膜(图5B类)证明S/G中的细胞₂/M相累积微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎，表明突变胚胎中的细胞周期进程被延迟或阻滞，许多细胞不退出细胞周期。

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图5。

视网膜中可检测到S期延长和细胞周期进展缺陷微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎。(A类)野生型（wt）48-50 hpf时分离视网膜细胞的DNA含量(左侧)以及微小染色体维持蛋白5^850米突变体(居中)胚胎和24 hpf的野生型胚胎，通过丙二碘标记细胞的定量FACS分析进行测量。24 hpf下快速增殖的视网膜细胞可以确定4C峰的位置(赖特). 相比之下，在48-50 hpf时，野生型胚胎的视网膜主要含有2C DNA含量的细胞（1C=一个单倍体基因组当量）。突变视网膜含有DNA含量>2C的细胞增加部分。(B类)柱状图总结了四个独立实验的结果。视网膜来自微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎的G细胞更少₁S、G期和更多细胞₂，或M相。误差条表示标准偏差。(C类,D类,F类、和G公司)通过石蜡包埋的野生型或突变胚胎眼睛的侧切面，分别用Br-dUrd或磷酸化组蛋白H3（pH3）抗体进行探测，以标记S期或M期细胞。在48 hpf时，在野生型视网膜中，中央区域的绝大多数细胞已经退出细胞周期。相反，微小染色体维持蛋白5^850米突变体视网膜的中央区域包含S或M期细胞，因此这些细胞要么延迟，要么停滞在S或M阶段（黑色箭头）。(E类和H（H）)表示结果的摘要图C类和D类和F类和G公司分别是。

调查视网膜细胞是否微小染色体维持蛋白5^850米我们利用S期或M期标记比较了野生型和突变型胚胎的视网膜。短时间培养BrdUrd，然后用抗BrdUrd抗体固定和检测，用于标记那些处于S期的细胞。组蛋白H3磷酸化形式的存在是晚期G的标志₂或M相(33). 在斑马鱼视网膜中，组织发生和细胞周期退出模式在空间和时间上都是定型的，遵循中心对边缘的进展模式(21). 因此，在野生型视网膜48 hpf时，视网膜中央区域的大多数细胞已经退出细胞周期，而处于S或M期的细胞是位于外围的细胞环。这些细胞可以通过BrdUrd掺入和磷酸化组蛋白H3的存在来检测(图5C类和D类). 相反，在微小染色体维持蛋白5^850米视网膜突变，中央区域的许多细胞仍显示BrdUrd掺入，并且具有抗磷酸组蛋白-H3免疫反应性，因此尚未退出细胞周期(图5F类和G公司).

讨论

三个中的突变体果蝇mcm和一个拟南芥基因的特征(34–37). 在果蝇mcm2突变体，影像盘和中枢神经系统中细胞的增殖受到抑制，胚胎和幼虫中枢神经系统的S期明显延长(34). 在磁盘保护异常中可以观察到类似的缺陷(数字功率放大器)，一个突变体果蝇mcm4基因，其作用仅限于有丝分裂复制，而不限于内复制(36). 致命突变果蝇mcm6影响有丝分裂周期和内循环，导致大脑和影像盘内细胞增殖严重缺陷(35). 在脊椎动物中，还没有报道MCM蛋白的小鼠突变。此外，尽管存在MCM复合物基因中的三个额外斑马鱼突变(立方米、和百万立方米7) (38)，其表型尚未分析。我们对微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎是脊椎动物MCM复合物突变的详细分析。

开始理解体内的函数微小染色体维持蛋白5在斑马鱼中，我们分析了其在视网膜中的表达模式。在人类细胞中，已经观察到进入G₀MCM复合体的丢失，促使人们认为复制许可系统的存在决定了细胞的增殖状态(39). 同样，我们发现微小染色体维持蛋白5表达与增殖细胞核抗原表达和细胞增殖模式。此外，我们比较了微小染色体维持蛋白5-早期表达模式(第5小时)和后期(elavl3型)神经发生的标志物。微小染色体维持蛋白5表达式与的表达式部分重叠第5小时但与弹性3，暗示着微小染色体维持蛋白5随着分化的进行，被迅速下调。有趣的是，在48 hpf时微小染色体维持蛋白5表达于视网膜边缘区，尽管BrdUrd和磷酸化组蛋白H3免疫反应表明周边存在循环细胞，代表将很快经历细胞周期退出和分化的细胞。许多鱼类和两栖动物的视网膜在一生中都在生长，新的视网膜细胞不断添加到CMZ。此外，这些动物的视网膜再生是通过CMZ中的视网膜干细胞实现的(40). 相反，视网膜内的其他区域主要由完全分化的细胞组成，没有进一步的增殖潜力。因此，我们对视网膜的表达分析表明微小染色体维持蛋白5表达可以提供敏感的标记物来定义具有进一步增殖能力的组织。微小染色体维持蛋白5在可以继续增殖的细胞中表达。然而，在即将分化的细胞中，它似乎在实际的细胞周期退出之前下调。

为了在细胞水平上检测MCM5降低的影响，我们通过FACS分析在48-50 hpf时检测DNA含量，此时母亲的MCM5水平显著降低。使用分离的视网膜细胞微小染色体维持蛋白5^850米突变体和野生型胚胎，我们观察到突变体视网膜中DNA含量>2C的细胞比例增加。这种增加可能表明进入S期的细胞数量增加或S期延长微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎。我们的数据支持后一种解释，因为我们观察到BrdUrd掺入阳性细胞在微小染色体维持蛋白5^850米这一阶段的突变胚胎（见图11，发表于支持信息在PNAS网站上）。S期延长很可能是由DNA复制缺陷引起的，因为MCM2到-7被认为对DNA复制过程中的起始和延伸都很重要。随着功能性MCM复合体水平的降低微小染色体维持蛋白5^850米突变体，可能会启动更少的复制叉，并且现有复制叉的延伸可能会减慢，可能导致通过S期的进展延迟。有趣的是，许多微小染色体维持蛋白5^850米突变细胞聚集在4C峰值附近，可能已经完成了大量DNA的复制，这让人想起了芽殖酵母的情况多芯片组件突变体，在S期表现出细胞周期阻滞，DNA含量几乎加倍(41,42).

在两者中拟南芥和果蝇属，MCM蛋白的无效突变是致命的，致命性主要归因于细胞增殖缺陷(34,35). 然而，在这些突变体中，是否涉及活性细胞死亡过程尚不清楚。我们的数据表明微小染色体维持蛋白5^850米突变胚胎，一些组织可能通过激活程序性细胞死亡对MCM5水平降低作出反应，而其他组织则没有。细胞凋亡的激活可能是复制缺陷的直接结果，复制缺陷可以激活负责协调细胞周期进展和细胞对DNA损伤的反应的S期检查点系统(43,44). 例如，通过扰动复制前复合物成分诱导重复制激活ATM/ATR依赖的检查点通路，从而导致细胞周期停滞和/或凋亡(45–47). 或者，MCM5可以独立于其复制功能在检查点系统中发挥作用。MCM蛋白的表达远远超过了支持正常水平DNA复制所需的水平(4). 最近，人类MCM7被证明与ATRIP直接相互作用，ATRIP是一种结合并激活ATR激酶的蛋白质。有趣的是，即使在DNA复制不受干扰的情况下，MCM7也能调节S期检查点反应(48). MCM5是否也能以类似方式调节S相检查点响应，还有待测试。

总之，我们的研究揭示了MCM5在脊椎动物发育过程中确保有效基因组复制和细胞周期进展方面的关键作用。此外，我们发现MCM5是一种敏感的标记物，可用于识别具有增殖能力的细胞。最后，我们的数据表明，在多细胞生物中，通过激活组织特异性凋亡程序来应对MCM5的减少，增加了复杂性。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：S.R.和W.D.设计的研究；S.R.、J.H.、S.E.和A.-K.E.进行了研究；S.R.和J.H.贡献了新的试剂/分析工具；S.R.和W.D.分析数据；S.R.和W.D.写了这篇论文。

利益冲突声明：未声明任何冲突。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：CMZ，睫状体边缘区；dpf，受精后天数；hpf，受精后小时数；MCM，微染色体维护。

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