用核蛋白或磷蛋白开放阅读框替换禽肺转移病毒开放阅读框的嵌合重组人肺转移病毒体外生长和体内衰减的改善

构建和回收含有AMPV N或P ORF的重组HMPV。

基于HMPV CAN97-83（GenBank登录号）的HMPV反向遗传系统{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY297749”，“term_id”：“34420896”，“term_text”：“YY297799”}}AY297749号)已在前面描述(6). 与临床分离物相比，野生型重组HMPV只有四个核苷酸替换不同，这四个核苷酸替代在M-F基因间区域创建NheI限制位点作为标记（图。​（图1C）。1摄氏度). 在本研究中，我们使用了一种野生型衍生物，其中天然存在的SH基因被一种称为“稳定SH”的改良版本取代稳定的SH基因是通过修改SH ORF中的许多自然发生的a和T同源体片段而创建的，以便选定的a或T残基被C或G取代，而不改变氨基酸编码（未显示）。之所以这样做，是因为我们最近意识到，一些病毒制剂似乎含有在SH基因内这些通道中有一个或多个小插入的亚群，这可能是由于病毒聚合酶的口吃。这一现象正在研究中，并将在未来详细报道。携带稳定SH基因（rHMPV）的重组HMPV在体外以及仓鼠和AGM呼吸道中的复制效率与未经修饰的重组HMPV相同（未显示）。因此，与预期一样，带有稳定SH基因的重组HMPV具有野生型病毒的表型。在本研究中，它被用作亲本来创建N和P嵌合体（rHMPV-N_A类和rHMPV-P_A类).

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图1。

工程化N（A）、P（B）和M（C）基因的结构和侧翼序列以及构建HMPV/AMPV嵌合体的策略（D）。面板A和B中的N和P基因以及侧翼序列显示为顶部的HMPV构造和底部的HMPV/AMPV嵌合构造。面板A至C中的BbsI、BsmBI和BfuAI位点通过PCR适配器引入以促进组装；MluI位点（A组）是自然形成的，NheI位点（C组）之前已经引入。限制性网站为斜体并下划线；通过与各自的酶裂解产生的4-nt相容的内聚端以粗体斜体显示并下划线。基因开始（GS）和基因结束（GE）信号的序列被装箱。图D显示了N、P和M片段的组装，并显示了产生的重组体的基因组。HMPV基因以白色显示，AMPV基因则以黑色显示。合成SH基因是灰色的。

编码rHMPV-N的抗原组cDNA_A类和rHMPV-P_A类结构如图所示。​图1。1制备的PCR片段包含HMPV或AMPV N ORF（长度为1182个核苷酸[nt]），并包括N基因启动信号之前的天然上游MluI位点（HMPV nt 12）以及片段下游端新添加的BbsI或BsmBI位点（图。​（图1A）。1安培). 为了引入BbsI或BsmBI位点，将抗原组中对应于位置1242至1248的序列5′-AAAAAAA G-3′更改为包含BbsI位点（5′-aGTCTTC公司-3′[下划线更改]）或BsmBI站点（5′-GAGACG公司G【带下划线的变化】），使用带有这些变化的PCR引物。

设计包含HMPV或AMPV P ORF（882 nt）的PCR片段，使上游端包含BfuAI位点（对应于抗原组中位置1227至1232的序列，5′-TGATTA-3′，被更改为5′-ACCTGC公司【替换带下划线】）、HMPV N基因末端信号、N/P基因间区和P基因启动信号，而下游端被修改为包含另一个BfuAI位点（对应于抗原组中的位置2152至2157，5′-ATAAAA，被更改为5′-气相色谱A类GGT公司[替换部分下划线]；图。​图1B）。1B年). 设计了一个包含HMPV M ORF的PCR片段，使上游端包含一个BbsI位点（对应于抗原组中的位置2136至2141，即5′-TTAATT，被更改为5′-加A类通用汽车公司【替换带下划线】）、P基因末端、基因间区域和M基因启动信号，而下游端包含已经存在的NheI位点（图。​（图1C1摄氏度).

嵌合病毒的组装如图所示。​图1D。一维N片段下游端的BbsI或BsmBI位点的裂解将删除识别序列，并产生5′-TAAT悬挑，其设计与P片段上游端BfuAI裂解留下的3′-ATTA悬挑兼容（图。​（图1D）。一维). P片段下游端的BfuAI位点被设计为留下5′-GTAG悬挑，这可能与M ORF上游端BbsI解理留下的3′-CATC悬挑相兼容（图。​（图1D）。一维). 请注意，BbsI、BsmBI和BfuAI的裂解位点位于各自识别位点之外，并且没有序列特异性，因此可以根据需要设计悬挑。此外，这些具有所有取代的限制性内切酶识别位点通过用限制性内切酶消化而从DNA片段中去除，使基因的序列和核苷酸长度不受影响。在pBluescript中分别克隆N、P和M PCR片段，测序，然后用上述限制性内切酶消化去除。为了组装每个全长抗原基因组质粒，从完整的rHMPV-SHs抗原基因组cDNA中切除包含N、P和M基因的3-kb MluI-NheI片段，并使用该MluI-NheI窗口在四片段连接中接受N、P、M片段（图。​（图1D）。一维). 克隆了抗原组cDNA，并通过限制性内切酶消化和测序证实了其结构正确。

从转染的BSR T7/5细胞中回收HMPV/AMPV嵌合病毒。将6孔培养皿中的汇合BSR T7/5细胞转染5μg的单个抗原质粒、2μg的支持质粒pT7-N和pT7-P以及1μg的pT7-M2-1和pT7-2L。用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在不含胰蛋白酶或血清的OptiMEM中进行转染，并在32°C下保持过夜。1天后取出转染培养基，用不含胰蛋白酶或血清的格拉斯哥最小必需培养基替换。在第3天将胰蛋白酶添加到最终浓度为5μg/ml，并在第6天将细胞-介质混合物传到新鲜Vero细胞上。

通过对来自感染的Vero细胞的总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）来分析每个回收的病毒的基因组。扩增出两个区域：nt 1至2287，包含先导、N、P和M上游端；和nt 4656至7499，包含M2、SH、G和L的上游端。缺乏RT酶的平行反应混合物没有产生可检测的产物，表明模板是RNA，没有污染DNA。每个扩增产物都是从未经编码的材料中完整测序的，表明每个病毒都含有设计的序列，没有偶然突变。

在仓鼠中进行评估。

在轻度甲氧氟烷麻醉下，用含有10^5.7rHMPV、rHMPV-N的PFU_A类，rHMPV-P_A类或AMPV。感染后第3天和第5天，每组6只动物被处死，并采集肺部和鼻甲。通过在含有5μg/ml胰蛋白酶的甲基纤维素覆盖层下对Vero细胞上的组织匀浆进行斑块试验来测定病毒滴度。培养物在32°C下培养6天，用梯度纯化CAN97-83的兔抗血清进行免疫染色，观察斑块(6). 每组剩下的六只动物被用来测量免疫原性和保护效果。在感染前2天和感染后27天收集血清。如前所述，HMPV中和抗体的滴度通过Vero细胞的终点稀释中和试验测定(8). 感染后第28天，仓鼠接受10^5.7在轻度甲氧基氟烷麻醉下，0.1-ml接种物中的HMPV CAN97-83的PFU。3天后采集鼻甲和肺部，通过上述斑块试验测定每个组织匀浆中的病毒滴度。

N和P嵌合病毒的体外多周期生长。

为了评估嵌合病毒在体外生长的能力，将N和P嵌合病毒与其rHMPV和AMPV亲本同时感染Vero细胞的复制培养物，感染倍数（MOI）为0.01 PFU/细胞。每隔24小时采集、冷冻培养基上清液样品，并随后通过菌斑滴定进行平行分析（图。​（图2）。2). AMPV的最高滴度为10^7.3感染后第5天，每毫升PFU约为rHMPV峰值滴度的100倍。N和P嵌合病毒的生长效率高于rHMPV：rHMPV-P的复制_A类比rHMPV高25倍，几乎与AMPV一样高，而rHMPV-N的最高滴度_A类比rHMPV高11倍。

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图2。

rHMPV、rHMPV-N和rHMPV-P的多步生长动力学比较_A类和AMPV。Vero细胞以每细胞0.01 PFU的MOI感染。每隔24小时，取培养基样品（0.5 ml的2-ml覆盖物），并用等量的含有5μg/ml胰蛋白酶的新鲜培养基替换；在这种情况下，AMPV培养物也含有胰蛋白酶。样品通过Vero细胞上的斑块分析进行分析。每个时间点由两个孔表示，每个病毒滴定重复进行。显示了方法。检测限为每毫升5个PFU。

感染细胞中的病毒蛋白合成。

对病毒感染细胞中产生的病毒蛋白进行分析，以确认N和P嵌合体中AMPV N和P蛋白的表达，并评估基因表达的总体水平。用N和P嵌合病毒或其rHMPV和AMPV亲本以每个细胞1PFU的MOI感染Vero细胞。培养72小时后，制备细胞裂解物，并使用梯度纯化HMPV的多克隆血清进行Western blot分析(6).

在rHMPV样本中（图。​（图3，三HMPV特异性抗血清检测到的条带，我们之前在分析转染cDNA和病毒表达的蛋白质的基础上，用M₂基因缺失；此外，检测到另一条适合M蛋白大小的带(10). 在这个蛋白印迹中没有检测到HMPV糖蛋白，这可能是前面提到的高度变性条件的结果(10). HMPV特异性血清也与AMPV交叉反应（图。​（图3，三，通道4），检测约42、41和30 kDa的条带，这些条带的大小分别适合于N、P和M蛋白。AMPV N和P蛋白的迁移速度比HMPV蛋白慢，尽管它们的计算分子量几乎相同：在N的情况下差异很小，在P的情况下差异更大。在感染N和P嵌合病毒的细胞的样本中（图。​（图3，三通过电泳迁移率的差异，可以在适当的通道中区分与AMPV N和P蛋白相对应的条带，从而确认适当的病毒表达了正确的AMPV蛋白。

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图3。

用rHMPV（第1道）、rHMPV-N感染每个细胞1个PFU的输入MOI的Vero细胞中表达的病毒蛋白的Western blot分析_A类（车道2），rHMPV-P_A类（车道3），或AMPV（车道4）或模拟感染（车道5）。感染后72小时收集细胞，制备裂解物，并在还原和变性条件下使用10%凝胶（NuPAGE；Invitrogen）进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将Western blot转移到硝化纤维素后，将膜与纯化HMPV的兔超免疫血清孵育，然后与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体孵育。结合抗体通过化学发光显示。凝胶左侧显示了N、P、M和M2-1蛋白的位置。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在凝胶的右侧。

图中的Western blot分析。​图3三还粗略比较了嵌合病毒与rHMPV的基因表达水平。鉴于嵌合病毒，特别是rHMPV-P的体外生长效率更高，这一点尤其令人感兴趣_A类由于印迹中使用的血清是HMPV特异性的，由于抗原差异，它可能与AMPV蛋白的反应效率较低。尽管如此，只要每种病毒中的蛋白质来源相同，即HMPV或AMPV，就可以在不同病毒之间对给定蛋白质的表达水平进行比较。例如，可以比较rHMPV和rHMPV-N_A类关于P、M和M2-1蛋白，因为这些蛋白在每种病毒中都是HMPV特异性的。类似地，可以比较rHMPV和rHMPV-P_A类HMPV特异性N、M和M2-1蛋白。此外，rHMPV-N表达的AMPV N和P蛋白_A类和rHMPV-P_A类可以分别与AMPV表达的病毒进行比较，因为这些病毒都是AMPV特异性的。总的来说，各种病毒蛋白质的积累水平与各种病毒相似。这表明，N和P嵌合体在体外复制效率的提高并不是由于细胞内蛋白质积累测定的细胞内病毒基因表达的大幅增加。

N和P嵌合病毒在仓鼠中的复制、免疫原性和保护效力。

为了测定嵌合体在体内复制的能力，将18只仓鼠与rHMPV和AMPV并行地用N和P嵌合体病毒鼻内感染。接种后第3天和第5天，每组6只动物被处死，采集肺部和鼻甲并分析感染病毒。rHMPV复制到平均滴度为10^5.4和10^6.5第3天、第5天和第10天每克上呼吸道组织的PFU^3.7和10^1.7第3天和第5天的下呼吸道PFU（表​（表1）。1). 第3天，AMPV在鼻甲和肺部的复制水平与rHMPV基本相同，第5天，其在肺部的滴度也与rHMPV的滴度相当，而在鼻甲中，其滴度降低了3.1 log₁₀因此，有证据表明宿主范围受到限制，但仅在取样的两天中的一天，且仅在鼻甲中。与rHMPV和rHMPV-N相比，第3天N和P嵌合病毒在上呼吸道和下呼吸道的滴度降低了约100倍_A类比P嵌合体略微减少。第5天，只有P嵌合体显著降低（1.4 log₁₀)比rHMPV高，仅在鼻甲。

对于每个rHMPV-N中剩下的六只动物_A类，rHMPV-P_A类在第-2天（即免疫感染前2天）和第27天采集血清样本，并分析体外中和HMPV的能力（表​（表2）。2). N和P嵌合病毒诱导的HMPV-中和血清抗体的滴度与rHMPV诱导的滴度基本上没有区别。相反，尽管AMPV复制相对有效，但AMPV诱导的HMPV-中和血清抗体滴度大大低于rHMPV和N、P嵌合体诱导的抗体滴度：这可能反映了HMPV与AMPV之间的抗原差异。

在免疫后第28天，用HMPV CAN97-83对动物进行鼻内激发，3天后处死动物，采集肺部和鼻甲并检测感染病毒。先前用rHMPV或N或P嵌合体免疫的所有动物在上呼吸道和下呼吸道都能完全抵抗HMPV攻击病毒复制，而模拟感染对照组的攻击病毒平均峰值滴度为10^6.2每克鼻甲组织的PFU和10^2.8每克肺组织的PFU（表​（表2）。2). 与模拟免疫组相比，先前用AMPV免疫的动物中挑战性病毒复制的平均滴度在上呼吸道减少约50倍，在下呼吸道减少约10倍。这表明，AMPV感染对HMPV提供了适度的交叉保护，这与AMPV诱导的HMPV-中性血清抗体滴度的中等滴度相一致。

AGM呼吸道中N和P嵌合病毒的复制。

由于嵌合病毒在啮齿动物模型中具有复制能力和保护性，因此选择它们在AGM中进行进一步的临床前测试，AGM是HMPV高效复制的灵长类宿主(30). HMPV中和血清抗体阴性的AGM（≤1.5 log₂)（见表​表4）4)鼻内和气管内接种10⁶每个rHMPV站点的PFU，rHMPV-N_A类，和rHMPV-P_A类（表​（表3）。三). 为了分别监测上呼吸道和下呼吸道的病毒复制，在感染后的12天内每隔一段时间采集鼻咽拭子和气管灌洗液样本，然后对病毒滴度进行分析（表​（表3）。三). 每天对AGM进行临床症状监测，没有任何临床症状。

rHMPV连续几天重复（图。​（图4）4)平均峰值滴度为3.7±0.0 log₁₀上呼吸道每毫升PFU和5.4±0.2 log₁₀下呼吸道每毫升PFU（表​（表3）。三). 嵌合体复制到平均峰值滴度，轻微（rHMPV-N_A类)或显著（rHMPV-P为60倍_A类)与rHMPV相比，上呼吸道减少。在下呼吸道，这两种嵌合体的复制都显著减少：rHMPV-N的复制量为15倍_A类rHMPV-P为1000倍_A类此外，后一种病毒的下呼吸道脱落时间缩短（表​（表3三和图。​图44).

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图4。

AGM上下呼吸道rHMPV和AMPV嵌合体突变体复制动力学。每组4只动物（模拟感染对照组除外，该对照组由2只动物组成）通过鼻内和气管内联合途径接种，每部位接种1ml，含10⁶第0天指示病毒的PFU。在指定的日期采集鼻咽拭子（A）和气管灌洗液（B）标本，并通过菌斑试验定量病毒滴度。检测限为0.7 log₁₀PFU/毫升。

我们感谢马里兰大学的Siba Samal慷慨捐赠AMPV起始材料。我们感谢魁北克大学和拉瓦尔大学中心医院的盖伊·博伊文和疾病控制与预防中心的院长埃尔德曼、特蕾莎·佩雷特和拉里·安德森提供了CAN97-83的初始库存。我们还要感谢玛丽莎·圣克莱尔、兰迪·埃尔金斯、布拉德利·芬尼弗洛克和凡妮莎·戴维斯对灵长类动物研究的巨大贡献。