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基因发育。2005年12月15日；19(24): 2979–2990.
数字对象标识：10.1101/gad.1384005
预防性维修识别码：PMC1315402型
PMID：16357216

由前miRNA为燃料的人类、独立于ATP的RISC组装机

埃利萨维特·马尼亚塔基和齐西莫斯·穆拉托斯1
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补充资料

摘要

RNA干扰（RNAi）由RNA诱导沉默复合物（RISC）介导，该复合物由微RNA（miRNAs）或短干扰RNA（siRNAs。在人类中，RISC的催化引擎是由精氨酸二（Ago2）蛋白和miRNA（miRNP）或siRNA（siRNP）形成的核糖核蛋白。Dicer核酸酶分别从前miRNA和双链RNA（dsRNA）产生成熟的miRNA和siRNA，并与Ago2结合。在这里，我们研究了人类RISC的组装，方法是将前miRNA呈现到包含Ago2、Dicer和TRBP的免疫纯化复合物中。成熟的miRNAs是以非依赖ATP的方式产生的，并以RISC的典型模式指导同源RNA靶的特异性切割。这种从头形成的RISC活性与Dicer分离。该系统充分再现了RISC加载过程的不对称性，但无法从siRNA双工体高效组装RISC。我们的发现表明，在人类中，Ago2和Dicer在遇到前miRNA之前会形成miRNA负载复合物（miRLC），miRLC被分解，miRNP被释放。

关键词：miRNA、miRNP、Dicer、Argonaute、siRNA、RNAi

MicroRNAs（miRNAs）是～22-核苷酸（nt）调节性RNAs(Lee等人，1993年；Reinhart等人，2000年；Lagos-Quintana等人，2001年；Lau等人，2001年；Lee和Ambros 2001；Mouralatos等人，2002年；Nelson等人，2003年；安布罗斯2004；巴特尔2004). 动物miRNA最初由RNA聚合酶II转录为被称为pri-miRNA的较长转录物(Lee等人2004年a)并在细胞核中由核糖核酸酶III核酸酶Drosha处理(Lee等人，2003年)与含有两个双链RNA-binding结构域（dsRBD）的蛋白Pasha结合成～70-nt前miRNAs（Lee等人。2002,2003；Denli等人，2004年；Gregory等人，2004年；Han等人，2004年；Landthaler等人，2004年). 前miRNAs采用干环结构，包含5′-磷酸和2-nt 3′-悬垂(Lee等人，2003年)，并输出到细胞质(Lee等人，2002年；Yi等人，2003年；Bohnsack等人，2004年；Lund等人，2004年；曾和卡伦2004)其中Dicer核酸酶从前miRNA的茎中切除成熟的miRNA(Grishok等人，2001年；Hutwagner等人，2001年；Ketting等人，2001年；骑士和低音2001). 成熟的单链miRNAs与其他蛋白质组装成RNA诱导沉默复合物（RISC）或miRNP(Hammond等人，2001年；Hutvagner和Zamore 2002；Martinez等人，2002年；Mouralatos等人，2002年；Murchison和Hannon 2004). 精氨酸（Ago）蛋白是直接与miRNAs结合并形成RISC和miRNPs核心蛋白的～95-kDa蛋白(Hammond等人，2001年；Hutvagner和Zamore 2002；Martinez等人，2002年；Mouralatos等人，2002年；Meister和Tuschl 2004；Murchison和Hannon 2004). 多种Ago Paralog通常存在于许多生物体中(Carmell等人，2002年). 双链RNA（dsRNA）的切分加工(Bernstein等人，2001年；Zhang等人，2004年)产生短干扰RNA（siRNAs）（siRNA双链），是包含5′-磷酸盐和2-nt 3′-悬链的～22-nt dsRNA片段(Hamilton和Baulcombe 1999；Elbashir等人，2001年). 与miRNAs一样，单链siRNAs直接与Ago蛋白结合并组装成RISC(Martinez等人，2002年；Schwarz等人，2002年).

如果miRNA或siRNA的5′末端与其RNA目标相吻合，并且如果碱基连接包括核苷酸10和11（从miRNA或siRNA的5’-磷酸中测量），则miRNA和siRNA通过碱基连接与其RNA目标进行作用，并直接靶RNA内切核裂解(Elbashir等人，2001年). 这是RNA干扰（RNAi）中靶RNA降解的机制(Fire等人，1998年；Elbashir等人，2001年). Ago2（以前称为eIF2C2）是一种内切酶，以miRNA或siRNA依赖的方式切割RNA靶(Liu等人，2004年；Meister等人，2004年；Rand等人，2004年；Song等人，2004年；Rivas等人，2005年).

RISC和miRNP的组装在小RNA介导的RNA沉默途径中至关重要。siRNA双工体RISC组装的生物化学研究主要集中在黑腹果蝇苍蝇含有两种功能不同的Dicer蛋白（Dcr-1和Dcr-2）。Dcr-1负责miRNA的产生，是苍蝇发育所必需的一种基本蛋白质，而Dcr-2则是siRNA产生所必需的，但缺乏Dcr-2的苍蝇发育正常(Lee等人2004b). 添加siRNA双链果蝇属胚胎或卵巢裂解物触发RISC的有序组装(Pham等人，2004年; Tomari等人。2004年a,b条). siRNA双链体最初与一种称为RISC负载复合物（RLC）的蛋白质复合物结合，该复合物包含Dcr-2和R2D2、一种dsRBD蛋白质，以及可能的其他蛋白质(Pham等人，2004年; Tomari等人。2004年a,b条；Tomari和Zamore 2005). RLC检测到siRNA双链的热力学不对称性，R2D2结合siRNA末端，显示出更强的dsRNA结合，而Dcr-2结合双链的相反末端(Tomari等人，2004b). 这种定向确保了来自siRNA双链“较松”端（与Dcr-2结合的端）的siRNA将作为siRNA引导链并入RISC，而另一（乘客）链则被排除在RISC之外(Tomari等人，2004b). 这种热力学不对称性也指导了哺乳动物的RISC负载，并适用于来自siRNA双工体的siRNA和来自前miRNA的miRNA(Khvorova等人，2003年；Schwarz等人，2003年).果蝇属Ago2稍后加入RLC/siRNA双链(Pham等人，2004年；Tomari等人，2004b)siRNA双链的解链需要ATP(Nykanen等人，2001年；Tomari等人，2004b；Tomari和Zamore 2005)和Ago2(Okamura等人，2004年)并且似乎与Ago2与单链siRNA的负载同时发生(Tomari等人，2004年b；Tomari和Zamore 2005). 最后一只苍蝇RISC由siRNA双链组装而成，被称为“holo-RISC”，沉淀物为80S复合体，含有单链siRNA，与Ago2、RLC蛋白Dcr-2、R2D2和其他蛋白质结合，可能与核糖体结合(Pham等人，2004年). 在苍蝇中，miRNA前体的加工除了需要Dcr-2外，还需要一种最近鉴定的dsRBD蛋白，称为loquacious（loqs），是R2D2的一种类似物(Forstemann等人，2005年；Jiang等人，2005年；Saito等人，2005年). 多嘴的人类同源物TRBP与Dicer和Ago2结合，但对TRBP在miRNA加工或功能中的作用有不同的解释(Chendrimada等人，2005年；Haase等人，2005年).

RISC是如何从人类的前miRNAs中组装而成的，尚未得到确凿的证明。在这里，我们描述了一种人类RISC组装途径，其中前miRNA是miRNA的来源。这条前miRNA-加燃料的人类RISC装配线在事件顺序、能量需求和最终RISC产品方面与之前报道的siRNAs的飞行RISC组装不同。

结果

Ago2相关Dicer将miR-30a前体加工成成熟miRNA

我们产生了人胚胎肾293（293）细胞系，该细胞系在四环素诱导型启动子的控制下稳定表达含有N-末端Flag标签的小鼠Ago2。与Flag-Ago2相关的主要RNA不是miRNA，而是蛋氨酸的线粒体tRNA（mt-tRNA）遇见) (马尼亚塔基和穆拉托斯2005). 类似地，我们发现在N末端或C末端携带myc表位标签的Ago2也主要与mt-tRNA相关遇见在293个细胞中表达(马尼亚塔基和穆拉托斯2005). 这与内源性人类或小鼠Ago2相反，后者主要与成熟miRNAs相关(Mouralatos等人，2002年). 我们假设过表达的表位标记的Ago2在成熟miRNAs生成之前的一步被“阻止”，并且我们试图研究表位标记Ago2形成的复合物的功能特性。

我们在四环素诱导后，从表达Flag-Ago2的293细胞和亲本293细胞中，使用与抗Flag抗体结合的琼脂糖珠进行免疫沉淀。我们分析了4%-12%NuPAGE上的免疫沉淀物，并通过银染色观察了蛋白质。如所示图1A，在～95kDa和～200kDa处有两条显著带，在～90kDa时有一条不太显著带，这在Flag-Ago2细胞系的免疫沉淀物中特别可见。还发现了其他不太显著的条带，但这些条带在其他实验中并不一致。相反，在Flag-Ago2细胞系的免疫沉淀物中总是发现～95-kDa和～200-kDa.条带。这些蛋白质最可能的候选物是Flag-Ago2（～95 kDa）、Dicer（～200 kDa(Hammond等人，2001年; Tahbaz等人。2001,2004；Doi等人，2003年；Liu等人，2004年). 据报道，人类TRBP也与Dicer有关(Chendrimada等人，2005年；Haase等人，2005年). 为了在我们的实验条件下确认所有这些蛋白与Ago2的关联，我们使用这些蛋白的抗体进行了Western blot，发现Dicer、HSP90和TRBP在293细胞系中与Flag-Ago2共沉淀(图1B).

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免疫纯化Flag-Ago2含有Dicer并显示前miRNA处理活性。(A类)在四环素诱导型启动子的控制下，用Flag-Ago2稳定转染293细胞。用来自非诱导（-）和四环素诱导（+）293细胞的抗Flag抗体进行免疫沉淀（IP），免疫沉淀在4%-12%NuPAGE上溶解并用银染色。(B)免疫沉淀物来自A类用所示抗体进行Western blot分析。(C)免疫沉淀物来自A类与合成前miR-30a孵育（序列如图2A)含有放射性标记的5′-磷酸盐，反应产物在15%UREA-PAGE上进行分析，并通过放射自显影术进行可视化。

Dicer的存在促使我们研究免疫纯化Ago2复合物是否能够处理前miRNA。我们将来自Flag-Ago2或亲本细胞系的免疫沉淀物与5′末端标记的合成前miR-30a RNA孵育图2A)经过Drosha处理后，模拟了天然产物，含有2-nt 3′-悬垂物和放射性标记的5′-磷酸盐。如所示图1C，一个主要的24-nt产品（和一个次要的23-nt产品，更好地显示在图2)从63-nt底物有效加工，表明Ago2-相关Dicer能够从miR-30a前体中正确加工miR-30a-5p。

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免疫纯化的myc-Ago2（野生型和催化不活跃型）处理前miR-30a和人工PML RNA(A、 左面板）加工反应中使用的前miR-30a的一级和二级结构。显示了加工后生成的5′末端标记成熟miR-30a-5p。红色星号表示放射性标记的5′-磷酸盐。(赖特面板）用来自用myc标记的野生型Ago2（myc-Ago2-WT）、用催化失活的Ago2突变体（myc-Ago2-D69A）或用myc-hnRNPQ3（阴性对照）转染的293T细胞的抗myc抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀与5′-末端放射性标记的合成前miR-30a孵育。反应产物在15%UREA-PAGE上进行分析，并通过放射自显影术进行可视化。(B、 左面板）加工反应中使用的人工PML RNA（PML-GL3）的一级和二级结构。(赖特面板）与5′-末端放射性标记PML-GL3的加工反应。

miR-30a-5p的产生不依赖于Ago2的催化活性

为了证明免疫纯化Ago2对miR-30a前体的处理不依赖于其催化活性，我们测试了一个在RNA靶裂解中不活跃的Ago2突变体。我们用人类野生型myc-Ago2（myc-Ago2-WT）和消除靶RNA切割的点突变（myc-Ago2-D669A）转染293T细胞(Liu等人，2004年). myc-hnRNP-Q3构建物，表达RNA结合蛋白(Mourelatos等人，2001年)，用作阴性对照。我们用抗myc偶联琼脂糖珠进行免疫沉淀，并用5′末端标记的前miR-30a孵育这些珠。如所示图2Amyc-Ago2-WT和myc-Ago2-D669A，而不是myc-hnRNP-Q3，将前miR-30a加工成miR-30a-5p，表明免疫沉淀物的前miRNA加工活性取决于Ago2的存在，而不取决于其酶活性。

为Ago2相关Dicer设计的前miRNA-like RNA底物

接下来，我们测试了myc-Ago2免疫沉淀物是否显示了Dicer预期的底物识别和加工特性。我们设计了一种前miRNA-like RNA（PML-GL3），该RNA保持前miR-30a的结构特征，但不保留成熟的miRNA序列。在PML-GL3中，24-nt miR-30a-5p序列的第一个21 nt被GL3序列取代（源自萤火虫荧光素酶），miR-30a-3p序列被一个与GL3碱基配对的序列取代，保留了错配以及3′端的2-nt悬垂（参见图2B). 我们测试了myc-Ago2免疫沉淀物是否可以处理PML-GL3。如所示图2Bmyc-Ago2-WT和myc-Ago2-D669A免疫沉淀物将5′末端标记的PML-GL3加工成成熟的GL3-24“miRNA”，其效率与miR-30前处理相当。这些结果表明，免疫纯化的Dicer/myc-Ago2复合物在识别前miRNA的结构特征后产生成熟的miRNA。

与前miRNAs预孵育的myc-Ago2免疫沉淀物对同源RNA靶点的特异性切割

接下来，我们询问由结合Ago2的Dicer产生的成熟miRNA是否可以在Ago2上进行功能加载。为了验证这一点，我们制定了一个两步实验方案，包括miRNA前处理反应和靶RNA切割反应(图3A). 对于第一个反应，将myc-Ago2珠与冷的5′-磷酸化前miRNA孵育，然后洗涤以去除剩余底物以及任何与珠未结合的产物。在第二个反应中，洗涤后的珠子与5′末端标记的同源RNA靶标孵育。我们推断，如果在第一步中产生的miRNA功能性地加载到Ago2上，那么Ago2-miRNA核糖核蛋白将能够从引导miRNA的中间切割同源RNA靶。

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从免疫纯化的myc-Ago2和合成的前miRNA组装功能性RISC(A类)用前miRNA测试RISC负载的两步实验方案示意图(B)用冷的5′-磷酸化前miR-30a进行RISC负荷试验。(B、 顶部面板）使用的两种RNA（miR-30a前体和miR-30a的同源靶点）的序列和加工miR-30b前体产生的成熟miRNA（miR-30a-5p）的序列。红色星号表示RNA靶的放射性标记的5′-磷酸；闪电显示了mir-30a-5介导的靶RNA切割的位置。(底部面板）含有免疫纯化myc-Ago2（野生型（WT）或催化失活突变型D669A（669））的琼脂糖珠首先在未标记的前miR-30a（通道4,5)或在没有车道的情况下2,3). 然后将珠子洗涤并与5′-末端标记的miR-30a-Target一起孵育。第一条通道（-）显示输入目标RNA(C)用冷的5′-磷酸化PML-GL3进行RISC负荷试验。(顶部面板）使用的RNA序列和PML-GL3加工产生的成熟GL3-24序列。(底部面板）含有myc-Ago2、野生型（WT）或D669A突变型（669）的琼脂糖珠首先与未标记的PML-GL3孵育。然后清洗珠子并与5′末端标记的GL3-Target（lanes）孵育2,3)或带有5′末端标记的miR-30a-Target（车道5)作为目标识别特异性控制。车道1和4（-），显示输入目标RNA。RNA通过17.5%UREA-PAGE分析并通过放射自显影术显示。

作为加工底物，我们使用了未标记的5′-磷酸化合成前miR-30a，而切割底物是一种5′-末端标记的33-nt RNA（miR-30a-Target），与miR-30a-5p互补（参见图3B). 我们用这个实验装置测试了myc-Ago2-WT和myc-Ago2-D669A免疫沉淀物。当加工反应中省略前miR-30a时，没有靶RNA切割(图3B，通道2,3），表明在我们的实验装置中，对miR-30a-靶缺乏实质性内源性切割活性。这很可能是由于与这些分析中使用的myc-Ago2结合的内源性miR-30a-5p的量可以忽略不计。然而，当将前miR-30a添加到处理反应中时，miR-30a-Target被myc-Ago2-WT裂解(图3B，通道4），但不是由催化失活的myc-Ago2-D669A突变(图3B，车道5）。当使用PML-GL3代替前miR-30a时，myc-Ago2-WT免疫沉淀物（但同样不是myc-Ago2-D669A）有效地切割了与GL3-24“miRNA”互补的RNA靶点(图3C，车道2,3）。然而，当myc-Ago2-WT与PML-GL3孵育时，它无法切割miR-30a-Target(图3C，车道5）。

这些实验证明了同源RNA的特异性裂解，这是RISC预期的模式，即在成熟miR-30a-5p和GL3-24 miRNA的中间。靶RNA裂解依赖于Ago2的催化活性。因此，我们可以得出结论，当Ago2相关Dicer的小RNA加工产物加载到Ago2上时，这些RNA靶点被真实的RISC切割。

人工RISC上加工产品的非对称加载

然后，我们通过免疫纯化的myc-Ago2复合物检测RISC组装是否再现了RISC中miRNAs的不对称负载。pre-let-7a-3被选为处理底物，因为其作为RISC体内miRNA供体的不对称性：在人类和苍蝇中，检测到大量let-7a，但没有检测到let-7a⋆合伙人(Schwarz等人，2003年)尽管重组Dicer同样产生let-7a和let-7a⋆来自pre-let-7a-3(Zhang等人，2004年). 我们准备了5′末端标记的pre-let-7a-3(图4A，泳道1）或用pCp标记的3′端(图4A，通道3），并用myc-Ago2免疫沉淀培养它们。let-7a的等值金额(图4A，车道2）和let-7a⋆(图4A，巷4），证实Ago2相关的Dicer对称劈开pre-let-7a-3。确定两个小RNA中的哪一个（let-7a或let-7a⋆)组装成功能性RISC后，我们设计了两个目标RNA，分别与两个小RNA互补(图4B)并在上述两步实验系统中使用冷pre-let-7a对其进行了裂解反应测试。let-7a-Target标记为3′末端，let-7a标记为⋆-靶点标记为5′末端。如所示图4C，let-7a-靶被myc-Ago2免疫沉淀物与冷pre-let-7a-3预孵育切割(图4C，顶部面板，通道3）。然而，与前let-7a-3预孵育的myc-Ago2珠无法裂解let-7a⋆-目标(图4C，底部面板，通道3）。这些结果表明myc-Ago2免疫沉淀物能够针对其miRNA选择miRNA⋆合作伙伴，因此包含一台RISC加载机器，它再现了RISC加载过程的不对称性。

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RISC上miRNA前体加工产物的不对称加载。(A类)let-7a-3前处理测定。5′-末端标记pre-let7a-3（车道1)或3′末端标记pre-let-7a-3（车道三)用myc-Ago2微球孵育，在15%UREA-PAGE上分析反应产物；产生的miRNAs（通道2,4)显示。(B)pre-let-7a-3及其加工产品（let-7a和let-7a）的序列⋆)和相应的RNA靶点（let-7a-Target和let-7a⋆-目标）。let-7a的放射性标记5′-磷酸盐⋆-let-7a-Target的Target和pCp（3′-end）以红色显示(C)使用let7a-3前体进行RISC负载分析。(顶部面板）3′末端标记let-7a-Target（车道内未反应1)用模拟预孵myc-Ago2珠（lane2)和与预培养的前let7a-3（泳道三). (底部面板）5′-末端标记let-7a⋆-目标（车道内未反应1)用模拟myc-Ago2珠（lane2)以及与pre-let7a-3（lane）预孵育的myc-Ago2珠三).

在RISC上加载miRNA的机器没有有效地使用相应的siRNA双工

汉农实验室此前曾报道，myc-Ago2免疫沉淀物能够从单链siRNA组装RISC，但不能从siRNA双工体组装(Liu等人，2004年). 我们比较了siRNA和前miRNA在RISC组装中的能力，以此为基础设计PML-GL3加工的24 nt产物的siRNA。我们向myc-Ago2-WT免疫沉淀物中添加PML-GL3（含有5′-磷酸盐）、单链GL3-24 RNA（含有5’-磷酸盐）或GL3 siRNA双链（含有5'-磷酸盐和2-nt 3′-悬链，反义链与GL3-靶点互补）（参见图5A). 我们准备了两组反应：一组不添加ATP/GTP，另一组添加1 mM ATP和0.2 mM GTP。如所示图5A当加入免疫纯化的myc-Ago2-WT时，即使反应中存在过量的ATP/GTP，添加GL3-siRNA双链也无法生成功能性RISC(图5A，通道4,5），而添加单链GL3-24 RNA能够生成功能性Ago2-GL3-24核糖核蛋白，该核糖核蛋白质能够切割互补RNA靶点（GL3-target）(图5A，车道6、7）。这些结果与Hannon实验室的研究结果一致，该实验室显示含有5′-磷酸的单链RNA，但不含siRNA双链，可以从免疫纯化的myc-Ago2复合物中加载到RISC上(Liu等人，2004年).

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免疫纯化的myc-Ago2复合物可以从前miRNA生成RISC，但不能从相应的siRNA双链生成，无论ATP含量如何。(A、 左面板）免疫纯化myc-Ago2-WT用于RISC组装的合成RNA；所有RNA均含有5′-磷酸盐。绿色显示的序列与GL3靶RNA互补(赖特面板）将含有免疫纯化野生型myc-Ago2的琼脂糖珠与不存在PML-GL3 RNA的冷RNA孵育（lane2)或存在1 mM ATP和0.2 mM GTP（车道三); 或带有GL3 siRNA双链，无（通道4)或带有（车道5)ATP/GTP；或带有单链GL3-24 RNA，没有（lane6)或带有（车道7)ATP/GTP。然后清洗珠子并与5′末端放射性标记的GL3-靶RNA孵育。第一条通道显示未反应的GL3-目标RNA。RNA分析如下A类. (B)含有免疫纯化的野生型myc-Ago2复合物的琼脂糖珠通过大量洗涤而耗尽ATP。这些珠子用于RISC加载和与冷的、5′-磷酸化的和凝胶纯化的前miR030a或PML-GL3的同源靶裂解反应2,6)或存在（车道3,7)含有2mM ATP和0.4mM GTP。5′末端标记的RNA靶点（通道1,5显示未反应的靶点）也进行了凝胶纯化。一种合成的5′端标记的18nt RNA寡聚物4用作尺码标记。RNA通过17.5%UREA-PAGE分析并通过放射自显影术显示。

前miRNAs对人RISC的组装与ATP无关

用于上述实验的免疫沉淀物含有非常少量的ATP（～4 nM），如基于发光的ATP测量所确定。此外，所使用的缓冲液不包含ATP、其他核苷酸或其他假定的能量来源（如NADH），这表明免疫纯化的Ago2/Decer复合物对前miRNA的处理和Ago2的负载可能是ATP非依赖性的。

为了更彻底地解决这种可能性，我们用葡萄糖和己糖激酶处理myc-Ago2-WT免疫沉淀物，以水解任何残留的ATP。我们测量了这些反应中的ATP浓度，其小于50 pM。我们还观察到，清洗珠子足以将ATP浓度降低到可忽略的数量（小于50 pM.）。我们用ATP和T4多核苷酸激酶进行5′-磷酸化后，凝胶纯化了前miR-30a和PML-GL3 RNA。5′末端标记的miR-30a-Target和GL3-RNA-Target也进行了凝胶纯化。如所示图5B当miR-30a前体（第2通道）或PML-GL3（第6通道）与myc-Ago2-WT免疫沉淀物一起使用时，从RISC组装反应中清除ATP对随后的靶RNA裂解反应没有任何影响。添加2 mM ATP和0.4 mM GTP(图5B组装反应中的通道3、7）没有增强靶RNA的切割。这些结果表明，前miRNAs的RISC组装不需要ATP。

ATP不影响靶裂解反应

为了研究在靶裂解反应中添加ATP如何影响其速率，我们用冷PML-GL3（400 nM）培养myc-Ago2免疫沉淀物（含～200 nM Ago2 icer复合物，通过银染色评估）以允许RISC组装。清洗珠子，将其平均分为两个试管，并在不存在或存在1 mM ATP和0.2 mM GTP的情况下用放射性标记的GL3-Target（10 nM）培养。在不同的时间点从反应中去除等量等分样品（如所示图6)反应产物通过变性电泳进行分析、定量并随时间绘制。如所示图6，在没有或存在ATP/GTP的情况下，靶细胞以相同的速率进行裂解。由于Ago2/Decer复合物超过了目标，这些结果表明，形成的RISC作为一种单一的周转酶发挥作用。

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ATP不影响靶细胞分裂的速率。(顶部)RISC由myc-Ago2免疫沉淀物和冷PML-GL3组装而成（如图3)并在不存在或存在1 mM ATP/0.2 mM GTP的情况下，与5′末端标记的GL3-靶RNA（10 nM）孵育。(底部)在指定的时间采集样品，用磷成像仪定量产品形成，并绘制反应时间曲线。利用Kaleidiagraph软件进行速率拟合。

RISC活性与Dicer的分离

Ago2上miRNA的负载如何影响其与Dicer的关联？为了解决这个问题，用表达myc-Ago2-WT和V5-Dicer（Dicer含有N末端V5表位标签）的质粒对293T细胞进行双重转染，制备裂解物并使用抗V5或抗myc单克隆抗体进行免疫沉淀实验；免疫沉淀物的银染色如补充图1所示。Western blots显示，myc-Ago2存在于V5-Dicer免疫沉淀中，而V5-Dice存在于myc-Ago2免疫沉淀中（我们未发表的数据）。然后对V5-D较冷的免疫沉淀物进行改良版RISC负荷试验，如图所示图7A：在与冷的前miRNA进行处理反应后，将上清液从珠子中分离出来，并将每个部分与5′-末端标记的靶RNA孵育。如果上清液中观察到RISC活性（即靶RNA裂解），这表明前miRNA处理和miRNA加载到Ago2后，Ago2-miRNA核糖核蛋白从V5-Dicer中释放出来（它仍然通过与抗V5抗体的相互作用与小球相连）。我们首先使用前miR-30a作为底物，如图7Amir-30a-Target未被珠子显著劈开（第2道），但大部分被上清液劈开（3道）。为了排除这是孵育伪影的可能性，我们建立了一个包含V5-Dicer免疫沉淀但不包含前miR-30a的反应。然后将来自该模拟加工反应的上清液与前miR-30a一起孵育，然后测试miR-30a靶向切割。未观察到解理(图7A，通道4），表明V5-Dicer/Ago2复合物与V5琼脂糖珠的结合在反应期间是稳定的。

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RISC活性与Dicer分离。用表达V5-Dicer和myc-Ago2的质粒对293T细胞进行双重转染。用抗V5或抗myc抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物用于改良的RISC负载分析，其中，在前miRNA处理反应后，首先分离珠子和上清液，然后测试同源靶RNA的切割。(A、 左面板）分析示意图。(赖特面板）V5-Dicer免疫沉淀物用于改良的RISC负荷试验，带有冷的5′-磷酸化前miR-30a。5′末端标记的mir-30a-Target（车道内未反应1)与珠子一起孵化（莱恩2)或者用上清液（lane三)在处理反应后，以及与模拟上清液一起，从V5-Dicer免疫沉淀物中提取，其中没有向处理步骤中添加底物，但在靶裂解反应之前向上清液中添加了前miR30a（lane4). (B)在改进的RISC负荷试验中，使用冷的5′-磷酸化PML-GL3作为处理底物和V5-Dicer免疫沉淀物。5′末端标记的PML-GL3-Target（车道内未反应1)与珠子一起孵化（莱恩2)或者用上清液（lane三)从加工反应以及模拟上清液中，从V5-Dicer免疫沉淀物中获得，其中没有向加工步骤中添加底物，但在靶裂解反应之前，冷的5′-磷酸化PML-GL3（PML；lane4)，5′-磷酸化GL3 siRNA双链（si；lane5)，或5′-磷酸化GL3-24（as；泳道6)已添加。(C、 左面板）分析示意图。(赖特面板）myc-Ago2免疫沉淀用于改良的RISC加载方案，以冷的5′-磷酸化PML-GL3作为处理底物。5′末端标记的PML-GL3-Target与珠子（lane）一起孵育1)或者用上清液（lane2)来自加工反应。

然后使用PML-GL3作为miRNA前体底物来测试与V5-Dicer免疫沉淀物的RISC负载反应(图7B)，并且在上清液中发现对GL3-靶的裂解活性(图7B，车道3）。然而，珠子保持了解理活性(图7B，泳道2），表明仍与Dicer相关的miRNA负载的Ago2是活性的。我们还从模拟处理反应（即未与PML-GL3孵育的V5-Dicer免疫沉淀物）制备上清液。用冷PML-GL3培养模拟上清液(图7B，通道4），带有GL3 siRNA双链(图7B，通道5），或带有GL3-24 RNA(图7B，通道6）未导致GL3-靶RNA断裂。最后，为了证实我们的分离珠上清液的程序不会导致上清液被珠污染，我们将改良的RISC负载试验应用于双转染细胞的myc-Ago2免疫沉淀物(图7C). 在这种情况下，所有靶RNA切割活性都应该保留在珠子上，因为myc-Ago2通过与抗myc抗体的结合与琼脂糖树脂相连。如所示图7C，靶标RNA切割活性仍然存在于珠子（第1道）中，上清液（第2道）中未发现活性，表明上清液未被珠子污染。我们得出结论，将V5-Dicer免疫沉淀物与前miRNAs结合后，上清液中检测到的RISC活性是由于从Dicer中分离出的miRNA-loaded Ago2所致。

讨论

上述实验表明，人类RISC上的miRNA加载途径与苍蝇RISC上所描述的siRNA加载途径不同。在D.黑腹果蝇，siRNA双链首先与Dcr-2/R2D2异二聚体结合，导致Ago2的补充和ATP依赖性的单链siRNA在holo-RISCs中的掺入，其仍保留Dcr-2/R2D2(Pham等人，2004年；Tomari等人，2004b；Tomari和Zamore 2005). 在我们的人类免疫净化系统中，Dicer在与加工底物或产品接触之前就已经与Ago2相关。预成型的含Ago2/Decer的复合物可以从前miRNA组装RISC，但即使添加了ATP/GTP，也不能从siRNA双工体组装RISC。此外，在我们的人类系统中，最终的RISC产品可以从Dicer中释放出来。

我们赞成一种模型，其中人类RISC组装是通过人类RLC中的前miRNA处理启动的，我们称之为人类miRNA加载复合物（miRLC）(图8). miRLC含有尚未加载miRNAs的Ago2。一旦miRNA与Ago2结合，它基本上是不可逆的，并且结合的miRNA不能与其他miRNA或siRNA交换(Martinez和Tuschl 2004; 我们未发表的观察结果）。虽然已经发现一些内源性miRNAs与293T细胞中引入的表位标记的Ago2相关(Liu等人，2004年)，大多数外源性Ago2缺乏miRNAs(马尼亚塔基和穆拉托斯2005)如图所示，正在进行miRLC。

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前miRNAs人类RISC组装的工作模型。

除Ago2外，人类miRLC的其他核心成分是Dicer和TRBP（另请参阅图1; 补充图1、2）。然而，人类miRLC中可能存在其他蛋白质(图8; 其他系数显示为“X”）。我们发现（mt）-tRNA遇见HSP90与人Ago2过表达有关。Dicer和Ago2直接相互作用(Tahbaz等人，2004年)，稳定Ago2需要HSP90(Tahbaz等人，2001年). HSP90和（mt）-tRNA的作用遇见如果有，RISC组件中未知。HSP90和（mt）-tRNA遇见而不是Dicer，可以通过大量洗涤从Ago2免疫沉淀物中去除，这些免疫沉淀物质能够处理前miRNA并组装功能性RISC（我们尚未发表的数据），表明HSP90和（mt）-tRNA遇见对于RISC组件可能是不必要的。可能是HSP90或（mt）-tRNA遇见在人体miRLC的体内形成或调节中发挥作用，或者它们可能具有与RISC组装或功能无关的其他功能。

Dicer对前miRNA的加工导致形成一种瞬态的“miRNA双链”中间产物，其结构特征与siRNA双链非常相似(巴特尔2004；Tomari和Zamore 2005). miRNA双链的解开产生成熟的单链miRNA，最终与Ago2结合，导致活性RISC的形成。miRNA双链的解链是如何进行的？前miRNA加工和miRNA双链解链可能与单链miRNA加载到Ago2同时发生。另一种可能性是，Dicer处理后释放出单链miRNA，并被Ago2捕获。同样可以想象的是，在放卷和Ago2加载之前，miRNA双链从Dicer释放出来，并被Dicer或miRLC的其他成分重新捕获。然而，简单的双工释放和再捕获机制不足以解释前miRNAs组装RISC的效率，因为在miRLC中添加siRNA双工并不导致有效的RISC形成。这一发现还表明，人类通过siRNA双链组装RISC的途径可能不同于通过前miRNA组装RISC。事实上，观察到siRNA双链可以在Dicer-null小鼠胚胎干细胞中产生有效的RNAi反应(Kanellopoulou等人，2005年)认为哺乳动物Dicer不需要在体内从siRNA双工体进行RISC组装。此外，在Dicer-null斑马鱼胚胎中，以siRNA双链形式传递miRNA可以恢复miRNA功能(Giraldez等人，2005年)Dicer也是siRNA双工体体外RISC组装必不可少的(Martinez等人，2002年).

很可能，人类miRLC只有在适当的前体RNA分子（前miRNAs或dsRNAs）发生活性的伴随“切割”时才能组装RISC。dsRNA是miRLC的次优底物；前miRNAs的处理效率更高（我们未发表的结果）。然而，将切粒与解卷结合起来可以解释我们的发现，人类RISC由前miRNAs组装不需要ATP。在Dicer加工过程中，每一个前miRNA分子的两个磷酸二酯键的水解可能会提供解开miRNA双链所需的能量。或者，RISC组装期间诱导的构象变化可能足以“解舒”miRNA双链（例如，通过加速双链的热熔化），而无需NTP水解。这种解旋可能是由Ago2/Decer复合物或miRLC中存在的另一种未知分子介导的。在苍蝇中，Dcr-1不需要ATP来处理前miRNAs(Jiang等人，2005年). 在我们的体外系统中，Dicer作为一种多重翻转酶的功能可能需要ATP；需要进一步的工作来解决这些问题。

在某些情况下，包括前miR-30a，miRNA双链都会累积为成熟的miRNA(Lagos-Quintana等人，2001年；Mouralatos等人，2002年；Zeng等人，2002年). 然而，在大多数情况下，只有一条单链miRNA被装载到RISC/miRNP中并在细胞中积累，而双链的相反链，即miR⋆，已被销毁(巴特尔2004；Tomari和Zamore 2005). Pre-let-7a-3是这种不对称的一个例子，因为只有let-7a，而不是let-7a⋆在单元格中检测到。人类miRLC在体外再现了不对称RISC负载。在苍蝇中，siRNA双链的不对称性由R2D2（一种含有dsRBD的蛋白质）感测，R2D2将Dicer招募到RISC(Tomari等人，2004b). 如何检测前miRNAs的不对称性尚不清楚。

将miRNA加载到Ago2后，人类miRLC的命运是什么？在苍蝇中，RLC被纳入全息RISC(Pham等人，2004年；Tomari和Zamore 2005). 一部分人类miRLC也可能并入RISC/miRNP。然而，我们的发现(图7)支持另一种模式，即Dicer可以在将miRNAs加载到Ago2后离开(图8). 该模型得到了几个额外观察结果的支持。Ago2-siRNA核糖核蛋白在靶RNA切割中无需其他蛋白即可发挥作用(Rivas等人，2005年). 与miRNA结合的内源性人或小鼠Ago2可能与其他蛋白质组装成miRNP(Mouralatos等人，2002年)，但miRNP不包含Dicer（我们未发布的结果）。miRNPs的Ago2具有催化活性，可以切割与其结合的miRNAs互补的靶点(Hutvagner和Zamore 2002；Kiriakidou等人，2005年). 由siRNA双工体（siRNP）组装而成的亲和纯化人RISC大小较小，约为～90-160 kDa，不含Dicer，也对靶RNA裂解有活性(Martinez等人，2002年). 相反，表位标记的过表达Ago2大多缺乏miRNAs(马尼亚塔基和穆拉托斯2005)并与Dicer合作。如图所示，该复合物完全能够从前miRNAs中组装功能性RISC。然而，从哺乳动物提取物中体外组装RISC的效率很低(Martinez等人，2002年). 对这些观察结果最直接的解释是，由于大多数内源性Ago2已经装载了miRNA并形成了无Dicer-free功能miRNP，因此只有有限量的miRNA-free Ago2与Dicer结合进入miRLC。

通过我们的RISC加载协议在体外组装的miRNP以不受ATP影响的速率切割靶点。同样，ATP不会影响由细菌表达的重组人Ago2和ss siRNA形成的RISC的靶切割率(Rivas等人，2005年). 在果蝇属提取物中，ATP也不影响单循环反应条件下的速率；然而，ATP通过促进目标发布来提高多重营业额(Haley和Zamore 2004年). ATP在我们的系统中不刺激裂解反应的发现表明RISC形成了一种单一的转换酶的功能。然而，还需要进一步的工作来解决靶RNA裂解后产物是如何释放的，并调查产物释放是否需要其他因素。

材料和方法

质粒和合成RNA

Maniataki和Mouralatos中描述了Flag-Ago2细胞系(2005). Liu等人描述了myc-Ago2结构(2004)和V5-Dicer构造在Han等人(2004). 使用的RNA序列（pre-miR30a、PML-GL3、GL3-24、GL3 siRNA双链、miR-30a-Target、GL3-Target、pre-let-7a-3、let-7a-Target和let-7a⋆-目标）如图所示​图2，2,​,3,三,​,4,4、和​和5。5所有RNA均由Dharmacon合成。

组织培养、转染、免疫沉淀、Western blot、Northern blot、RNA的5′端标记、5′-磷酸化、用pCp标记RNA的3′端、RNA的凝胶纯化

这些操作如前所述进行(Mouralatos等人，2002年；Nelson等人，2004年；Kiriakidou等人，2005年；马尼亚塔基和穆拉托斯2005；Maniataki等人，2005年). 对于前let-7a-3的3′端标记，用pCp和T4 RNA连接酶标记合成的前let-7a-3，并进行凝胶纯化，然后用碱性磷酸酶处理以去除连接的pCp的3′-磷酸盐并产生游离的3′-OH。然后用T4多核苷酸激酶和冷ATP对标记的RNA进行5′-磷酸化。

ATP消耗和ATP浓度测量

如Nykanen等人(2001). 使用从Sigma（FL-AA）购买的ATP生物发光检测试剂盒测量ATP浓度。

加工和切割分析

在10.5μL的总体积中进行处理反应，其中包括0.5μL的Rnasin、6μL的1×MIB缓冲液（pH 7.4下的40 mM醋酸钾、2 mM氯化镁）2，1 mM DTT）（参见Kiriakidou等人，2005年)2μL来自珠子/免疫沉淀物，2μL用于0.25μM的制剂32P标记（5′-末端标记）底物或2μM冷、5′-磷酸化底物的制备；或文本中另有说明。孵育时间为90-120 min。在裂解反应之前，短暂旋转处理反应，分离上清液，并用1×MIB的200μL洗涤珠子两次。将10μL的裂解反应混合物添加到洗涤的珠子中（在改进的分析中，也添加到上清液中），该混合物由0.5μL的Rnasin、9μL的1×MIB和0.5μL 0.25μM的32P-标记的靶RNA（或如文中所述）。孵育时间为90-120分钟。在含有ATP/GTP的反应中（例如。，图6)使用了1 mM ATP和0.2 mM GTP，或如文中所述。产品形成的量化(图6)如Haley和Zamore所述，使用PhosphorImager完成，并使用Kaleidrograph软件（Synergy）安装速率(2004)和Rivas等人(2005).

补充材料

补充研究数据：

致谢

我们感谢G.Hannon为myc-Ago2构建物；向N.Kim提供V5-Dicer构造；针对K.Saigo和W.Filipowicz的抗Dicer抗体；针对R.Shiekhattar和A.Gatignol的抗TRBP抗体；用于质粒制备的S.Lambrinaki；向T.Nilsen、M.Kiriakidou、P.Nelson、S.Lambrinaki和X.Liu征求对手稿的意见；以及P.Zamore和Mouralatos实验室的成员进行有益的讨论。这项工作得到了NIH拨款R01-GM0720777、MRDDRC核心（P30-HD026979）、NCICCC核心（P30-1016520）以及McCabe基金会对Z.M的支持。

注意事项

补充材料可在http://www.genesdev.org。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1384005。

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文章来自基因与发育由提供冷泉港实验室出版社