牛植入前胚胎实时定量PCR参考基因的筛选

摘要

背景

植入前牛胚胎发育具有不同的生物学步骤，包括第一次分裂、激活胚胎基因组、致密化和囊胚形成，衍生出两种不同的细胞系，即内细胞团和滋养层细胞。这些过程由发育重要基因的差异表达调节，这些基因主要以与阶段和时间相关的方式表达，遵循常见的母体和/或胚胎表达模式[1]. 获得关于植入前发育期间基因表达生理时间表的知识对于更好地了解哺乳动物胚胎发育至关重要，有助于进一步完善哺乳动物的辅助生殖技术[2].

直到最近，大多数关于卵母细胞和胚胎生理学的研究都是基于显微镜观察，但普遍认为，仅仅评估胚胎形态并不能回答大多数问题[三]. 通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测量卵母细胞和植入前胚胎的差异mRNA水平，获得了对植入前发育的新见解[4-7]它取代了灵敏度较低、费力的方法，如Northern blot分析和RNase保护分析。然而，由于RT-PCR中不同的反应效率和动力学，扩增后的最终产物数量可能无法准确反映初始样品mRNA浓度[8].

与常用的常规RT-PCR程序相比，数据准确归一化的实时RT-PCR分析的变量要小得多。指数阶段的实时定量不受任何反应组分的影响，因为在平台阶段受到限制。虽然通过终点RT-PCR可以测量转录水平的微小差异，但需要进行大量优化和PCR后操作。必须对每个单独的样本进行这些优化，因为RNA的表达在各个样本之间可能会有很大的差异。因此，实时RT-PCR已被公认为准确、灵敏定量mRNA转录物的方法[9,10]. 许多研究已经发表，其中RNA定量已经在早期家畜胚胎中进行了评估。这种技术在很大的动态量化范围内具有速度、高通量和准确性的优点，特别适用于只有少量细胞可用的情况[11]. 几位作者[12-14]通过测定分析内和分析间的变化，证明了2步SYBR Green I实时RT-PCR反应的再现性。

然而，由于缺乏标准、分析设计的差异、协议、仪器和分析方法的多样性，应谨慎处理实时qRT-PCR结果，并且需要商定的标准和操作程序[15].

基因转录分析需要控制几个变量，例如起始物质的数量、酶的效率以及组织或细胞之间的整体转录活性差异。许多方法用于控制其中一些变量，例如根据总细胞数、输入材料的质量或RNA质量量进行标准化。当在提取RNA之前添加尖峰时，外源添加的mRNA或尖峰可用于标准化[16].

针对内部控制基因的标准化最常用，因为它可以控制所有变量。这些内部控制基因，也称为参考基因，通常被称为看家基因，假设这些基因在发育的所有阶段在某些组织中以恒定水平表达，并且不受实验治疗的影响。迄今为止，大多数标准化都是针对β-肌动蛋白等参考基因进行的(行动委员会)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPD公司)或18S rRNA然而，许多研究提供了确凿的证据，证明它们的转录水平在不同的发育阶段和不同的实验条件之间并不恒定[17-19]. 使用这些类型的表观控制对数据进行标准化可能会导致关于转录水平的错误结论。因此，候选参考基因的验证对于准确分析基因表达至关重要[20].

大多数实验只包括一个参考基因。范德索佩尔等. [21]证明了常规使用单个基因进行归一化会导致相对较大的误差，并验证了多个精心选择的参考基因的几何平均值是一个准确的归一化因子。

在本研究中，我们测定了8个常用参考基因在不同植入前阶段的mRNA表达水平，并基于多个控制基因计算了归一化因子，以更准确可靠地归一化牛植入前胚胎的基因表达数据。

结果

GeNorm分析

使用geNorm软件对不同胚胎阶段的基因表达稳定性进行了分析。根据M值对8个控制基因进行的排序在3次分析之间是等效的。GAPD公司,YWHAZ公司,SDHA公司和18S rRNA在3种分析中，每种分析都有4个最稳定的基因，只有基因的顺序不同。行动委员会在3种检测中，稳定度最低的基因为。结果列于表​表22。

表2

参考基因按每次分析的表达稳定性排序，从上到下递减。选择用于计算归一化因子的参考基因以粗体打印。

化验1	化验2	化验3	组合*
SDHA公司	SDHA公司	GAPD公司	GAPD公司
18S rRNA	GAPD公司	YWHAZ公司	YWHAZ公司
GAPD公司	18S rRNA	18S rRNA	18S rRNA
YWHAZ公司	YWHAZ公司	SDHA公司	SDHA公司
HPRT1型	组蛋白H2A	组蛋白H2A	组蛋白H2A
组蛋白H2A	HPRT1型	TBP（待定）	HPRT1型
TBP（待定）	TBP（待定）	HPRT1型	TBP（待定）
行动委员会	行动委员会	行动委员会	行动委员会

在单独的窗口中打开

*运行间变化修正后

为了确保这三种分析之间的可比性，我们比较了三种独立分析之间的Ct值和相对标准曲线的效率，这些相对标准曲线源自相同的cDNA集合，并根据qBase算法（Hellemans等.，准备中）[24]. 为了在3次分析中同时测定最稳定的参考基因，必须使用该组间变异的校正因子。联合分析的geNorm分析结果如图所示​图1A。1安培此联合分析中的基因排名与3个单独分析的排名一致。

在单独的窗口中打开

图1

（A-B）：geNorm程序分析的候选参考基因的基因表达稳定性（A）三次分析中控制基因的平均表达稳定性值（M），从最不稳定（左）到最稳定（右）绘制。（B） 归一化因子NF之间3次分析的成对变化分析_n个和NF_n+1个，以确定归一化的最佳控制基因数。更高的V_4/5和V_7/8这些值是由于包含了相对不稳定的基因，并且符合平均表达稳定性M。

为了确定应该使用多少参考基因，标准化因子（NF_n个)，基于n个最佳参考基因表达水平的几何平均值，根据Vandesompele，通过逐步加入一个额外的、不太稳定的参考基因来计算等. [21]. 图​图1B1B年显示了成对变化V_n个/V（V）_n+12个连续归一化因子NF之间_n个和NF_n+1。较大的变异意味着添加的基因具有显著影响，可能应包括在计算归一化因子中。在这种情况下，包含4^第个基因没有显著影响（低V_{第3页，共4页}值）。3个成员集有缝隙的,SDHA公司和YWHAZ公司是计算NF的最佳选择。

讨论

分析早期胚胎发育所必需的基因的表达模式，为评估胚胎的正常性和优化辅助生殖技术提供了有用的工具[25]. 通过实时qPCR测量不同的mRNA水平，通常可以获得对哺乳动物早期胚胎发育的新见解。这项技术彻底改变了mRNA的定量，但需要仔细的分析设计和反应优化，以最大限度地提高灵敏度、准确性和精密度[26].

在植入前发育过程中测量转录水平的问题被细胞数量和细胞大小在这一发育间隔期间不断变化的事实所困惑。在母子转换之前，mRNA主要来源于母体。一旦基因组被激活，细胞数量将影响可用的mRNA数量[三]. 为了进行个体发生分析，将胚胎作为单个单位进行比较，参考基因将校正胚胎之间的差异。

使用体外培养，另一个必须考虑的变量是样本中正常胚胎的比例。在分析过程中，不合格胚胎可能与合格胚胎混合[三]. 不合格胚胎的基因表达可能与合格胚胎的不同，并可能导致偏见[27-29]. 因此，在使用单个胚胎样本时，异常胚胎可能会影响参考基因的选择。因此，我们使用20组形态特征良好的混合胚胎，以尽量减少对单个胚胎质量的影响。

RNA的质量和数量对成功的基因表达分析至关重要。由于数量有限，不可能进行RNA分析，但针对小样本量优化的RNA提取方法、DNase处理和适当的控制方法会产生尽可能可靠的结果。

实时定量PCR成功应用的关键是防止扩增污染基因组DNA，从而导致对RNA含量的高估。但更重要的是，得出的数据不可靠，特别是对于低丰度的单外显子基因或基因组中含有反转录假基因的基因。DNAse治疗前后的负RT对照证明了DNAse治疗的必要性和有效性。

当使用SYBR green I等嵌入染料时，应注意引物二聚体的形成。熔融曲线分析和琼脂糖凝胶电泳证实，荧光信号专门来自所需的扩增子，而不是来自人工制品。

为了校正实时数据中细胞输入、RNA质量和样品间酶效率的差异，需要进行精确的标准化。在可重复提取高质量RNA的受控条件下，基因转录物数量理想地标准化为细胞数量[21]. 在牛植入前阶段，细胞数量和细胞大小不断变化。比较同一发育阶段的mRNA水平是可行的，但进行个体发生分析则更具问题，这对于理解基因表达的转变至关重要[三].

另一种标准化方法是使用输入材料的质量。然而，在我们的案例中，无法量化这些参数，因为只有最少量的RNA可用，并且整个植入前时期存在的RNA总量不是恒定的。因此，对总RNA进行归一化需要一种可靠的RNA定量方法，并且没有考虑到RT反应的可变性。也许反对将总RNA质量用于归一化的最有力论据是，它主要由rRNA分子组成，并不总是代表mRNA部分[21].

只有当细胞或起始物质的确切数量已知时，才能添加外源性添加的mRNA[16]. 峰值仅校正酶效率的差异，但不考虑输入样品的质量和数量。因此，峰值的使用并不是没有假设的。

现在普遍认为，转录水平应该归一化为一个恒定的内部控制基因。这些参考基因通常改编自文献，并用于各种实验条件。一个理想的参考基因应该在不同的实验条件和发育的各个阶段以恒定的水平表达。对几种常用参考基因的个体发育研究表明，它们的mRNA水平在植入前发育过程中并不稳定[19]. 如果使用的参考基因在样本之间波动，则随后的标准化将导致错误的结果[30]. 由于许多基因的生物学功能仍然未知，很难预测实验条件将如何影响推定参考基因的表达。因此，一种更安全的方法是使用几个方差较小的基因的几何平均表达。叶片式压缩机等. [21]假设具有相对稳定表达模式的基因对是合适的控制基因。YWHAZ公司,GAPD公司,SDHA公司和18S rRNA被发现是植入前胚胎样本中最好的内源性控制基因，其低M值是基因稳定性的标志。行动委员会是8个测试参考基因中得分最差的参考基因（图​（图1A）。1安培). 这是一个显著的结果，因为在一些关于胚胎基因表达分析的出版物中，行动委员会是唯一使用的参考基因。然而行动委员会与之前的报告一致，这些报告证明行动委员会在植入前胚胎发育过程中，预测行动委员会胚泡形成期间[31-33]. 在以前的研究中组蛋白H2A被确定为植入前胚胎发育期间最稳定的参考基因[8,19]，但这些作者只考虑了Ct值，没有对输入材料的数量进行校正。为了验证给定控制基因的假定稳定表达，需要事先了解使该基因正常化的可靠措施，以消除任何非特异性变异。为了解决这个循环问题，Vandesompele等. [21]开发了一种基因稳定性测量方法，以基于非标准化表达水平来确定控制基因的表达稳定性。通过使用这种方法，考虑了发育阶段RNA含量的变化[34]. 除了geNorm，文献中还描述了其他程序和策略，以选择最佳参考基因。最佳守护者[35]是一个基于成对相关性的Excel应用程序。Normfinder公司[13]是一种基于模型的方法，不仅可以估计候选归一化基因的总体变异，还可以估计样本集样本子组之间的变异。

基于最佳参考基因的几何平均值计算归一化因子（NF）。用于计算NF的基因数量是实际考虑和准确性之间的权衡。在这种情况下，使用3个最稳定的参考基因来计算归一化因子（NF_三). 图​图1B1B年证明包含4^第个参考基因对新计算的归一化因子NF没有显著贡献₄。

归根结底，我们选择的归一化集是GAPD公司,SDHA公司和YWHAZ公司。18S rRNA被排除在外，因为rRNA基因在用作参考基因时具有普遍的缺点。它们的转录是由RNA聚合酶I进行的，因此rRNA合成的调节独立于RNA聚合物II进行的mRNA合成[36]. 此外，与靶mRNA转录物相比，rRNA基因高度丰富，这种不平衡使得在实时qPCR分析中很难准确减去基线值[21].18S rRNA在本研究中进行了评估，因为它是一个常用的参考基因。

结论

总之，优化了从胚胎中提取无gDNA RNA的方法，并设计了一种参考基因分析方法，用于对从牛植入前胚胎样品中获得的实时PCR数据进行可靠的归一化。对8个不同参考基因的转录谱分析表明，使用单个参考基因是不可靠的，并且会导致错误的结论。相反GAPD公司,SDHA公司和YWHAZ公司应该使用。

方法

作者的贡献

KG完成了所有的实验程序，是原稿的主要作者。MVP参与了研究设计并提供了实时支持。AVS有助于IVF实验。合资公司在数据分析方面提供了专家意见。AVZ和LJP参与了项目的设计，帮助起草了手稿并监督了研究。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

工具书类