突变线粒体解旋酶Twinkle导致小鼠线粒体DNA多重缺失和迟发性线粒体疾病

摘要

线粒体DNA（mtDNA）维持所必需的核编码蛋白的缺陷最近被证明是线粒体疾病的重要原因。该疾病组的特征是mtDNA的进行性丢失和/或多个mtDNA缺失的体细胞积累(1,2). 线粒体复制DNA聚合酶γ（POLG）缺陷导致广泛的神经疾病，如进行性外眼肌麻痹（PEO）、阿尔卑斯综合征、帕金森综合征和脊髓小脑共济失调(三–6). 此外，缺乏POLG校对活性的敲除小鼠积累了大量线粒体DNA突变，并出现了与衰老相关的症状，支持线粒体DNA突变在正常衰老中的作用(7).

我们报道了PEO中线粒体复制解旋酶Twinkle的显性突变，并伴有多个线粒体DNA缺失(8). 该病表现为肌病，常累及眼外肌、肢体和面部肌肉，有时伴有严重抑郁症(9,10).体外，Twinkle已被证明与线粒体单链DNA结合蛋白和POLG一起形成最小的线粒体DNA复制体(11). 我们最近证明了Twinkle对mtDNA的维持至关重要，因为缺乏Twinkler的人类细胞会迅速丢失其mtDNA，而Twinkel在mtDNA拷贝数控制中起着积极作用体内(12). Twinkle与噬菌体T7 gp4六聚合酶同源(8). PEO突变预计会定位在连接亚基和六聚体环的假定区域或附近。由于T7型解旋酶的dNTP结合发生在亚基界面，正确的亚基相互作用对解旋酶活性至关重要(13,14). 因此，Twinkle的显性突变既可以增强dNTP的分解，也可以影响mtDNA复制的过程(8).

目前尚无有效的mtDNA疾病治疗方法，由于缺乏能够进行干预和随访的疾病模型，治疗策略的发展受到阻碍。产生了线粒体功能障碍的小鼠模型(15–18)但他们的严重疾病病程与儿童疾病相似，目前还没有慢性迟发性疾病的模型。我们研究了转基因小鼠中显性Twinkle-PEO突变的后果。这些携带人类患者突变的小鼠由于线粒体DNA缺失的积累，呼吸链功能逐渐恶化，但没有过早衰老的迹象。它们代表了一种以前没有特征的成年发病进行性线粒体疾病的小鼠模型。

材料和方法

转基因小鼠的产生。这项工作得到了国家公共卫生研究所动物护理委员会的批准，所有实验都是按照处理实验动物的良好做法进行的。

我们设计了靶向结构，在小鼠Twinkle蛋白的氨基酸360处携带苏氨酸替代丙氨酸({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_722491”，“term_id”：“24962647”}}NP_722491号)（A360T，闪烁^{自动变速箱}或氨基酸353–365（dup353–365，Twinkle^复制). 野生型Twinkle超表达小鼠的产生^重量+)作为Twinkle表达可能的定量效应的控制，已在参考文献中描述。12如参考文献所述，将小鼠Twinkle cDNA和内含子4克隆到pHBApr-1-neo中。12第四内含子的加入使得全长Twinkle及其替代剪接变体Twinky得以表达。通过定点突变引入与人类p.A359T错义突变相对应的p.A360T氨基酸变化。为了产生dup353–365突变，引入沉默点突变1077C→G形成限制位点Pfl23II，用于插入带有寡核苷酸的39-bp重复序列。使用的引物序列可根据要求提供。最后的DNA构建物用BglII和NdeI线性化，并用于FVB/N小鼠受精卵母细胞的原核微注射。小鼠的基因分型和转基因表达水平测定如参考文献所述。12.

形态分析。组织样品在异戊烷/液氮中冷冻。对不同组织样本的冷冻切片同时进行细胞色素染色c（c）氧化酶（COX）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性。对于塑料包埋，肌肉样品在2.5%戊二醛中固定1.5小时，用1%四氧化锇处理，在乙醇中脱水，并包埋在环氧树脂中。用甲基蓝（0.5%wt/vol）和硼酸（1%wt/vol）对半薄（1μm）切片进行染色。对于透射电子显微镜（JEOL 1200EX电子显微镜），在网格上切割超薄（60–90 nm）切片，并用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。

南部斑点。小鼠线粒体DNA定量如参考文献所述。12.

长PCR。用小鼠mtDNA引物1953-1924和2473-2505（Expand Long Template PCR System，Roche）从50 ng总DNA中扩增出小鼠mtDNA，使用缓冲液2和PCR条件：92°C 10 s，68°C 12 min，30个周期。PCR产物直接或经凝胶纯化（凝胶提取试剂盒，Qiagen）克隆到TOPO-TA载体（Invitrogen），并用与小鼠mtDNA的np 15 815-15 834、315-334和16 024-16 005相对应的载体引物和寡核苷酸测序。

激光捕获显微切割。冷冻切片（12μm）进行COX/SDH活性染色、脱水和风干。使用AutoPix自动激光捕获显微镜（Arcturus）对单个骨骼肌纤维进行显微解剖。使用了直径为10μm的激光光斑，脉冲功率为80mW，脉冲宽度为1500μs。在CapSure帽（Arcturus）上捕获纤维部分，并在显微镜下切下含有纤维的转移膜部分。样品在20μl 10 mM Tris·HCl、pH 8.1/0.4 mg/ml蛋白酶K、65°C下消化3 h。使用Dynazyme聚合酶（Finnzymes）用小鼠mtDNA寡核苷酸2510–2529和15678–15659扩增缺失分子（95°C 60 s，56°C 60秒，72°C 60 s，35个周期）。

线粒体DNA点突变分析。从18月龄小鼠股四头肌中提取总DNA。两个Twinkle的体细胞线粒体DNA突变负荷^复制，一眨眼^重量+和两个对照小鼠通过PCR、克隆和测序进行测定，如参考文献所示。19具有细胞色素特异性引物b条小鼠mtDNA的基因（np 14 073-14 906）和非编码控制区（15 357-15 138）。从所有样本中分析了每个区域的31000多个核苷酸。

呼吸链酶活性测量。从12个月大的Twinkle的股四头肌、胫骨前肌、股二头肌和小腿三头肌中分离出线粒体^复制老鼠(n个=4）和年龄匹配的对照(n个= 5). 复合物I和III的呼吸链酶活性（NADH：细胞色素c（c）还原酶），复合物II和III（琥珀酸盐：细胞色素c（c）还原酶），复合物II（琥珀酸脱氢酶），复合体IV（细胞色素c（c）氧化酶）和柠檬酸合成酶的测定如参考文献所述。20线粒体耗氧量以丙酮酸+苹果酸、琥珀酸+鱼藤酮、抗坏血酸+TMPD、棕榈酰辅酶A和α-酮戊二酸为底物测定。

功能测试。自动笼形轮运行。将仓鼠大小的带数字磁性计数器的金属笼轮（直径14.5厘米）（BC 800 Sigma sport）放入47×26×14.5厘米的笼中，测量小鼠5周的自愿每日跑步距离、每日跑步时间、最大跑步速度和平均跑步速度(21). 三眨眼^复制小鼠，8个闪烁^{自动变速箱}对小鼠和10只大于12个月大的室友进行了测试。

握力.在研究开始时，使用握力分析仪（TSE Systems）测量每只小鼠的最大握力，并在5周的运动计划后，记录三次试验中最好的一次作为最大握力。

旋转法.Rotarod试验（Ugo Basile，生物研究仪器）以6 rpm的启动速度进行。如果鼠标停留在杆上10秒，旋转速度会加快。记录了摔倒的时间和连续三次尝试中的最佳成绩。八眨眼^复制老鼠，15眨眼^{自动变速箱}对小鼠和19只同窝小白鼠进行了Rotarod性能和握力测试。

统计分析。未付款t吨统计分析采用检验法，数据以平均值±标准差表示。

结果

一眨眼转基因小鼠的产生。我们在普遍存在的β-肌动蛋白启动子下，产生了9只转基因创始小鼠，表达突变小鼠Twinkle cDNA，该cDNA具有p.A360T改变或氨基酸353–365的框内重复。创始人被用来生产转基因小鼠系：两个Twinkle^重量+（A和B），四个闪烁^复制（C、D、E和F）和三个闪烁^{自动变速箱}（G、H和I）F1线。窝产儿的基因型分布遵循孟德尔比率。对品系A、C和G的F1小鼠进行繁殖以产生F₂转基因小鼠纯合子。F₁通过半定量Southern blot（数据未显示）测定，这些系有1到12个转基因拷贝。肌肉中的转基因表达水平在Twinkle系中较低^复制（E） 和Twinkle^{自动变速箱}（一） ，并被排除在进一步分析之外。其他突变株系的转基因表达水平是内源性Twinkle的0.2倍至3.4倍(图1)表明插入位点影响了β-actin启动子和转基因表达。总的来说，突变株系中转基因与本地等位基因表达的比率接近显性疾病患者的情况，即1:1。由于缺乏特异性抗体，转基因衍生表达无法在蛋白质水平上得到证实。

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图1。

三种转基因Twinkle在肌肉、心脏和大脑中的转基因表达水平^复制（C、D和F）和两个闪烁^{自动变速箱}（G、H）鼠标行。转基因表达水平与天然Twinkle基因的表达相关。

一眨眼转基因小鼠表现出迟发性线粒体肌病的特征性组织学特征。突变体Twinkle的过度表达不会影响小鼠的发育或寿命。在任何年龄段，转基因小鼠的体重与对照鼠没有显著差异。

肌肉表型。在出生后的第一年内，没有发现线粒体功能障碍的迹象。12个月大的Twinkle^复制小鼠表现出COX阴性（COX^–组织化学分析显示，<1%的肌纤维。早期COX^–纤维没有显示SDH活性增加（SDH⁺)表明呼吸链功能障碍，但线粒体没有增殖(图2b条). 十八个月大的Twinkle^复制小鼠表现出两种COX^–和COX^–SDH公司⁺纤维，表明COX缺乏先于线粒体增殖(图2d日). COX的百分比^–纤维随年龄逐渐增加：18-24个月龄的平均百分比为11.8±4.4%，而年龄匹配的对照组为0.03±0.01%（平均值±标准差，P（P）= 0.0008). 所有三个F₁一闪一闪^复制小鼠品系（C、D和F）的COX水平相似^–纤维。一闪一闪^{自动变速箱}小鼠表现出轻度肌肉表型，因为只有少量COX^–发现了纤维。作为Twinkle^重量+小鼠或非转基因同窝小鼠实际上没有COX^–即使在22个月大的时候(图2一和c（c）)，考克斯^–纤维不是正常老化过程或线粒体蛋白过度表达的结果就其本身而言，但这是转基因的结果。

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图2。

细胞色素c（c）肌肉和大脑的氧化酶活性以及骨骼肌的超微结构。12个月大对照股四头肌COX/SDH活性的双重染色(一)和Twinkle^复制鼠标(b条)18个月龄对照组的股四头肌(c（c）)和Twinkle^复制(d日)18个月龄对照小鼠小脑(e（电子）)和Twinkle^复制(（f）)18个月龄对照小鼠脉络丛(克)和Twinkle^复制(小时)小鼠和18个月龄对照组的灰毛壳(我)和Twinkle^复制(j个)小鼠（cc，胼胝体）。箭头指向转基因小鼠的受影响细胞。(k个和我)一只18个月大的双胞胎的股四头肌超薄切片的电子显微照片^复制鼠标。(k个)正常大小的线粒体由正常纤维中的箭头指示（nf），纤维中的线粒体增大，线粒体在肉瘤下积聚（sa）。在病变纤维（df）中，肌肉纤维被异常的大线粒体取代，线粒体内有内含物、外周嵴和空泡。(我)箭头所示为从病变纤维中发现的带有线粒体的自噬体。（比例尺：25μm，a–h; 100微米，我和j个; 1微米，k个; 200纳米，我.)

在电子显微镜中^复制小鼠肌肉，一些纤维增加了线粒体的数量和大小(图2k个). 在轻度受累的纤维中，线粒体增大，并且在茎鞘下区域线粒体数量增加，但仍具有可识别的嵴结构。然而，在严重受累的纤维中，肌原纤维结构被具有同心嵴的大线粒体所取代，类似于洋葱状结构和电子致密内含物。这些变化与患有Twinkle缺陷的PEO患者的肌肉中的变化相同，但没有发现典型的旁结晶内含物。线粒体在自噬体内频繁出现，表明线粒体降解(图2我).

衰老突变小鼠和对照小鼠的心肌组织中COX的水平大致相同^–SDH公司⁺纤维，类似于之前报道的衰老小鼠的纤维，表明我们的转基因对心肌没有实质性影响。

一只20个月龄双胞胎呼吸链酶的生化分析^复制F类₂小鼠肌肉中COX含量最高^–以抗坏血酸为底物的纤维表现出适度降低COX活性和COX依赖性耗氧量（分别为对照组平均值的50%和64%，与核编码复合物II相关）（参见支持信息，发布在PNAS网站上）。在20个月大的Twinkle中^复制F类₁然而，未检测到小鼠呼吸链酶活性或耗氧量的显著降低，这表明个别肌肉纤维的COX缺乏是局部的，不会损害肌肉的总呼吸能力。

不同神经元群COX缺乏。18个月大的Twinkle的冷冻脑切片^复制小鼠的小脑中约1%的Purkinje细胞是COX^–SDH公司⁺在C和F系中，神经元胞体和树突中COX缺乏和线粒体增生(图2（f）). 其他小脑细胞的COX活性正常。在大脑中，海马CA2区的大锥体神经元主要是COX^–SDH公司⁺以及灰质毛被的神经元，该区域是海马细胞发育的来源(图2j个). 一些COX^–SDH公司⁺还从嗅球、黑质和下丘脑中鉴定出神经元（数据未显示）。脉络丛中许多代谢活跃且富含线粒体的上皮分泌细胞也是COX^–SDH公司⁺(图2小时). 无COX^–SDH公司⁺神经元或其他脑细胞是从与年龄匹配的对照同窝或Twinkle中发现的^重量+老鼠(图2e、 克、和我). 考克斯^–这些区域可以反映β-actin的表达模式或受影响细胞对线粒体功能障碍的敏感性。小鼠大脑内生β-actin表达最高的区域是嗅球、运动皮层和脉络丛(22)其中第一和第三个显示出明显的COX^–我们的小鼠缺乏COX^–在运动皮层的锥体神经元中发现了神经元。

突变小鼠积累线粒体DNA缺失。我们在我们的Twinkle中搜索了多个mtDNA缺失^复制和通过长PCR和Southern杂交分析的对照小鼠，因为这些类型的突变在Twinkle PEO患者中积累。Twinkle脑线粒体DNA的扩增^复制小鼠产生了多个产物，对应于完整大小的线粒体DNA和具有多个大小缺失的分子(图3e（电子）). 只有16-kb的产物可以从对照脑中扩增出来。不同小鼠大脑mtDNA的类似缺失模式表明存在缺失热点。然而，从肌肉中只容易扩增出≈3 kb的单一产物，而从所有对照样品中扩增出野生型mtDNA的16-kb产物(图3e（电子）). DNA序列分析表明，该3-kb产物代表多个不同的缺失分子，其5′断点均在2707-3020之间，3′断点则在15376-15441之间(支持信息). 这些分子中只剩下12S rRNA、16S rRNA和线粒体DNA的非编码区(图4一). 在Southern杂交上看不到缺失(图3一和c（c）)，除了肌肉中的3-kb突变群体，在Twinkle的样本中可以看到^复制F类₁和F₂过度暴露放射自显影后的小鼠，估计约占肌肉mtDNA总量的5%(图3d日). 我们使用激光捕获显微切割技术从单个肌肉纤维中获取DNA，并能够将缺失分子与一些COX关联起来^–纤维而非任何COX⁺单纤维PCR检测纤维（数据未显示）。通过长PCR和过度暴露的Southern blot，衰老小鼠（突变或对照）的心脏DNA包含多个mtDNA缺失，但在突变小鼠心脏中没有过量mtDNA缺失（数据未显示）。Twinkle核18S rRNA基因mtDNA拷贝数的定量^复制小鼠组织显示大脑中线粒体DNA明显缺失（dup F对照值的46%₁小鼠和37%的dup F₂小鼠，P（P）两者均<0.0001；图3b条). 在Twinkle的肌肉和心脏中^复制小鼠的mtDNA水平与非转基因同窝小鼠相似。

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图3。

线粒体DNA分析和拷贝数测定。(一和c（c）)22个月龄对照组Twinkle肌肉和大脑DNA的南部印迹^重量+老鼠和Twinkle^复制F类₁老鼠和一只18个月大的Twinkle^复制F类₂用mtDNA和核18S rRNA基因探测小鼠。(b条)小鼠针对核18S rRNA基因的脑线粒体DNA拷贝数的定量。(d日)过度暴露的肌肉DNA Southern印迹c（c）从Twinkle发现的3-kb波段^重复箭头指向老鼠。(e（电子）)相同小鼠肌肉和大脑DNA的长PCR。细箭头表示全长mtDNA，粗箭头表示肌肉mtDNA最常见的缺失分子大小（≈3 kb）。

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图4。

眨眼鱼肌肉和大脑的线粒体DNA缺失^复制小鼠，通过长PCR、克隆和DNA测序确定。(一)以灰色显示删除片段的小鼠mtDNA示意图（参见支持信息详细信息）。只有D-loop、12S rRNA和16S rRNA通常被保留。(b条)小鼠和人类线粒体DNA区域包含5′缺失断点的示意图。黑色垂直线表示本研究中确定的5′缺失断点，下面的星号表示从不同缺失分子中发现相同5′断点的频率。指出了人类多重线粒体DNA缺失（16070）常见的5′缺失断点。

我们18个月大的Twinkle^复制小鼠肌肉样本中的体细胞mtDNA点突变量没有增加：细胞色素中每10 kb只有0.45个突变b条当每只小鼠分析大于33kb的克隆mtDNA序列时，对照区出现0.25个突变。

小鼠的身体性能不会受到影响。由于肌肉组织发生显著变化，我们研究了小鼠的肌肉力量和性能。旋转杆Rotarod的性能反映了维持复杂协调运动的能力；Twinkle的测试^重复和Twinkle^{自动变速箱}与同窝小鼠相比，小鼠没有统计学上的显著差异(支持信息). 同样，最大握力不受肌肉变化的影响，与对照组同窝同伴相似。事实证明，在自愿的车轮跑步练习中进行的长跑能够反映耐力。我们在Twinkle中没有发现明显的肌肉无力或运动能力受损的迹象^复制或Twinkle^{自动变速箱}小鼠，但转基因小鼠的每日跑步时间和距离高于对照组(P（P）= 0.05). 对照组每周每天的距离（平均值±标准差）为1.3±0.5 km，而窝藏Twinkle的小鼠每天的距离为2.6±0.6 km^{自动变速箱}突变，在Twinkle中为3.7±0.7 km^复制老鼠(支持信息).

讨论

我们在这里报道了一种成年发病线粒体疾病的小鼠模型。我们的转基因小鼠表达具有显性PEO突变的线粒体Twinkle解旋酶，忠实地复制了人类PEO疾病的关键组织学和分子发现。该模型形成了形态清晰的线粒体肌病，但对小鼠的健康影响较小，因此为评估治疗策略提供了很大的希望。

小鼠中表达的Twinkle突变对应于两个PEO患者突变，即dup352-364和A359T。亚基重复是迄今为止在Twinkle中描述的结构上最严重的突变。之所以选择A359T突变，是因为在噬菌体T7中，类似突变A257T是一种功能缺失突变，导致解旋酶dTTPase活性增强(23). dup352-364患者表现为常染色体显性PEO、全身肌肉无力、回避性人格特征和严重抑郁症，发病年龄为20至51岁(8,9). 人类患者中的错义突变A359T导致约50岁的晚发性PEO，伴有中度肌病，无中枢神经系统受累（M.Zeviani，个人沟通）。我们的闪烁^复制小鼠在12个月大时出现了线粒体肌病的第一个组织学症状，与人类疾病发病的相对年龄（与预期寿命相关）相似。根据形态学变化的日益严重程度判断，小鼠的肌病进展。COX的量^–患有dup352-364的PEO患者的肌纤维为2-11%(9)和《一闪而过》^复制小鼠约为12%。三个独立的Twinkle^复制转基因品系产生了相同的肌肉表型，表明肌肉变化是由突变的Twinkle引起的，而不是由转基因插入位点引起的。金彩星^{自动变速箱}与Twinkle相比，具有同源突变的小鼠表现出缓慢的COX缺乏进展^复制老鼠。小鼠的整体肌肉表型与PEO患者的发现非常相似。

PEO疾病的一个标志是患者有丝分裂后组织中多个大的mtDNA缺失的积累，突变的mtDNA在一些大脑区域达到总mtDNA的60%，在骨骼肌达到40%(1,24). 我们在相应的小鼠组织中观察到类似缺失的积累。缺失分子的数量随着年龄的增长而增加，并根据COX缺乏纤维的增加判断呼吸链功能障碍的进展。然而，小鼠中mtDNA的缺失量很低，类似于年轻PEO患者dup352-364突变的结果(9)POLG相关共济失调患者(4). 低突变mtDNA数量可能反映了小鼠的寿命较短：在人类中，mtDNA缺失仅在约20岁时在Southern blot中可见，而我们的小鼠在死亡时最多约2岁。有趣的是，突变mtDNA的低数量并不能反映COX缺陷肌肉纤维的数量，因为PEO患者和我们的小鼠中异常纤维的数量相似。我们的小鼠肌肉中的体细胞点突变负荷和线粒体DNA总拷贝数与对照组相似，因此，这些因素不会加剧COX缺乏症。COX缺乏似乎明显先于线粒体的积累，因为1岁的小鼠有一些完全的COX^–光纤，但SDH⁺首次在18个月大的小鼠中观察到纤维。

在我们的小鼠中，肌肉萎缩和线粒体功能障碍导致的功能性后果少得惊人。生化分析显示呼吸链酶复合物I、III和IV的正常活性轻度降低或较低。这些复合物包含线粒体DNA编码的亚单位，该发现有力地支持线粒体DNA缺陷和呼吸链缺陷的因果关系。对于dup352-364的PEO患者，也有类似的活动(9)，反映出肌肉匀浆中受影响纤维的比例较低。我们的小鼠的体能、运动能力和肌肉力量都很好。事实上，这些突变小鼠似乎比它们的野生型同胞更愿意运动。人们很容易推测，跑步冲动的增加可能是转基因的结果：这是大脑直接参与或自发行为以补偿肌肉萎缩的结果。然而，这些结论需要对大量具有不同遗传背景的小鼠进行进一步研究。然而，我们发现，小鼠肌肉能够耐受相当数量的功能失调纤维，直到其功能受损。这一表型与Twinkle的研究结果一致^复制患者，他们通常有相当大的主观运动不耐受性，但有轻微的客观肌肉无力(25).

为了研究缺失机制，我们详细描述了小鼠大脑和肌肉中mtDNA缺失断点的特征。金彩星^复制小鼠肌肉中含有突变mtDNA，其中大多数带有≈13-kb的非克隆mtDNA缺失。这些产物均仅由rRNA基因和D-loop区域组成，但在邻近位点有单独的5′和3′断点序列。这些断点要么不包含4–5 bp的直接重复序列，要么包含短的直接重复，这与II类缺失一致。这些3kb“最小mtDNA分子”与之前在对照人类心脏中发现的3.75kb“普通子升华子”极为相似(26). 大脑mtDNA也产生了从全长到≈3 kb的一系列扩增产物。这种缺失模式与人类患者的发现非常相似(24). 通过断点分析，我们确定了大脑和肌肉中类似的缺失热点，这表明这些位点构成了Twinkle小鼠的主要缺失热点。最重要的是，小鼠mtDNA的3′缺失断点bp 15180–15441与人类碱基对16070重叠，这是之前描述的PEO-Twinkle患者的断点热点(27)和共同的升华(26). 此外，最近的一项研究将PstI限制酶靶向小鼠骨骼肌线粒体，导致持续产生双链断裂。这些小鼠在bp 15368–15439处有3′PstI依赖性缺失断点(28)，与我们的断点重叠。人类和小鼠mtDNA中的热点区域位于tRNA之间^赞成和D-loop，包含线粒体DNA最具差异的一级序列(29). 很明显，导致特定位点出现断点的多重删除的一般机制并不是由于一级序列本身，而是由于其二级结构或功能位置。PstI小鼠强烈提示，双链断裂介导哺乳动物Ⅱ类线粒体DNA缺失的形成(28). 从现在和以前的数据中产生的有趣假设是，Twinkle的主要后果^复制缺陷是产生双链断裂，正如我们根据PEO-Twinkle患者的缺失断点分析所建议的那样(27). 此外，我们建议热点区域在双链断裂修复中具有特定的保守作用，或作为双链断裂自由5′端的重组位点。

最近发现POLG和Twinkle缺陷是广泛表型范围扩大到神经退行性疾病的基础(4,5). 因此，我们仔细观察了两种不同的Twinkle的中枢神经系统参与情况^复制鼠标线。我们确定了COX大神经元的种群^–SDH公司⁺在两个细胞系中：小脑浦肯野细胞、海马CA2锥体神经元和软骨诱导细胞。这些神经元中的COX缺乏可能是由于线粒体DNA缺失或缺失的线粒体DNA在选定细胞中积累所致。以前还没有在小鼠或人类中报告过COX缺乏的Purkinje细胞。在对具有dup352-364突变的PEO患者和线粒体DNA维持缺陷（如线粒体脊髓小脑共济失调和Alpers综合征）的尸检中发现了浦肯野细胞的缺失(4,6,24). 值得注意的是，COX^–SDH公司⁺我们小鼠的海马神经元与老年人和阿尔茨海默病患者的海马神经元非常相似(30,31). 在我们的小鼠中，神经元COX缺乏并没有直接遵循小鼠β-肌动蛋白的表达模式，这种缺乏可能表现在最容易出现线粒体DNA维持缺陷和线粒体功能障碍的神经元群体中。因此，我们的小鼠模型为理解神经元细胞类型特异性mtDNA维护提供了一个有希望的工具。

最近，线粒体DNA突变与过早衰老有关，因为发现POLG校对缺陷的小鼠在两个月大的时候已经有大量的体细胞线粒体DNA点突变，并且表现出与哺乳动物衰老相关的表型(7). 据报道，“突变小鼠”也有删除的线性线粒体DNA，其数量不会随时间增加。Twinkle是POLG在复制中的伙伴，值得注意的是，我们的缺失小鼠并没有过早衰老，尽管它们积累了线粒体DNA缺失，导致进行性呼吸链缺陷。我们的数据表明，过早衰老可能需要广泛的线粒体DNA突变，或者突变小鼠的表型是由于与线粒体DNA突变无关的POLG蛋白的特定功能所致。

金彩星^复制小鼠是复制特定患者突变表现的mtDNA疾病模型。以前的线粒体呼吸功能障碍小鼠模型包括线粒体DNA维持所需蛋白的基因敲除：腺嘌呤核苷酸转运体-1失活导致4-6个月大时的肌病和心肌肥大(15). Tfam的组织特异性敲除阐明了线粒体转录物丢失和特定细胞类型中严重呼吸链缺陷的后果(18). ΔmtDNA小鼠出生时大多数组织中存在高水平的单个mtDNA缺失(17)导致心脏、骨骼肌和肾脏的呼吸链缺陷，使其成为早期发病的多系统线粒体疾病的良好模型。ΔmtDNA小鼠在6个月大时因肾衰竭死亡。线粒体中表达PstI的小鼠在7个月大时发生线粒体肌病，但无法繁殖(28). 与所有之前的车型相比，Twinkle^复制小鼠在不影响寿命或繁殖的情况下专门模拟晚发性进行性线粒体疾病。

线粒体疾病的治疗试验非常具有挑战性，因为即使在大型中心也无法获得允许双盲测试设置的大型同质患者材料。我们的转基因Twinkle^复制小鼠模型可以在双盲的环境下，利用基因同源的大型研究材料，研究运动或不同治疗理念的长期和短期效果。它能够跟踪症状前疾病的进展和干预，以及旨在揭示晚发疾病发病机制的测试。这些缺失小鼠是研究线粒体DNA疾病的理想工具。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：H.T.、K.P.M.、A.J.、J.N.S.和A.S.设计的研究；H.T.、K.P.M.、S.W.、I.L.、E.Y.和A.P.进行了研究；H.T.、K.P.M.、S.W.、I.L.、J.N.S.、A.P.和A.S.分析数据；H.T.、A.J.、J.N.S.和A.S.撰写了这篇论文。

利益冲突声明：未声明任何冲突。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：COX，细胞色素c（c）氧化酶；进展性眼外肌麻痹；POLG、聚合酶γ；SDH，琥珀酸脱氢酶。

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