Ca组织²⁺豚鼠膀胱可兴奋平滑肌的释放单位

摘要

简介

肌肉收缩的激活需要胞浆钙瞬变。在平滑肌中，这可以由两种不同的机制启动，都涉及钙的释放²⁺来自内部存储的肌浆网（SR），被恰当地称为药物-机械耦合和兴奋-压缩耦合(Bozler，1969年;Somlyo和Somlyo1970年,1994;Somlyo等人，1971年;Bolton等人，1999年). 药物-机械耦合不需要表面膜去极化。在平滑肌中相对丰富的IP3受体是激动剂引发的级联事件的最终靶点，导致内源性钙²⁺释放(Somlyo等人，1988年). 相反，E-c耦合涉及介导Ca的电压依赖性L型钙通道（DHPRs）²⁺其活性导致钙²⁺通过ryanodine受体释放（RyRs；Xu等人，1994年)或SR钙释放通道。最近，去极化诱导的钙²⁺平滑肌在缺乏细胞外钙的情况下从内部储存物中释放(del Valle-Rodriguez等人，2003年). 后一种现象进一步增加了一种有趣的可能性，即电压依赖性Ca的某些成分²⁺平滑肌中的释放可能涉及两种释放通道IP3（通过G蛋白）和RyR的连续活动(del Valle-Rodriguez等人，2003年)以与钙无关的方式²⁺渗透。

平滑肌有多种功能类型，在IP3-和RyR-介导的储存物的相对比例、激活的详细机制以及SR的数量和细胞内定位方面差异很大(尼克松等人，1994年;Bolton等人，1999年). 尽管如此，预计Ca的排列有一定的共性²⁺-信号系统组件及其作用模式应存在。这篇文章的重点是需要DHPRs和RyRs活性的去极化依赖性钙释放的基础结构。在豚鼠膀胱中，DHPRs负责≈10的内向电流μA/厘米²(科克纳和伊森伯格，1985年,b条,1991,1994;Ganitkevich和Isenberg，1990年)和钙²⁺Ca产生的瞬态²⁺电流被钙放大²⁺通过外围RyR释放(Ganitkevich和Isenberg，1992年). 与其他平滑肌一样，自发和/或诱导的钙²⁺释放事件（火花）要么直接在外围位置观察到，要么通过其对钙的直接影响确定为外围事件²⁺-激活的K⁺通道(费伊，1995年;Nelson等人，1995年;Mironenau等人，1996年;Gordienko等人，1998年,2001;诸葛等，1998,2002;Bolton等人，1999年;Pérez等人，1999年;Jaggar等人，2000年;Herrera等人，2001年;Kirber等人，2001年;Ohi等人，2003年). 钙释放也可直接检测到肌下膜的位置(邦德等人，1984年). 已证明spark和RyR站点之间的关系(Herrera等人，2001年;Ohi等人，2003年).

火花位点的首选位置表明RyR聚集在集群中。通过电子显微镜，在几块平滑肌中检测到了靠近质膜的SR成分(Gabella 1971年,1972;Somlyo等人，1971年). 小簇“脚”将这些外围SR小泡连接到质膜(Somlyo等人，1971年;Devine等人，1972年;Somlyo和Franzini Armstrong，1985年). 通过与骨骼肌和心肌的比较，并根据火花位置，这些脚很可能代表RyRs。平滑肌也含有钙螯合素，其亚型与心脏类型相同或密切相关(Wutack等人，1987年). 平滑肌钙螯合素已通过免疫标记在小的外周和内部病灶中识别(Etter等人，1993年;Villa等人，1993年)并通过电子显微镜观察与质膜和承重足相关的外周小SR池(Somlyo和Franzini-Amstrong，1985年).

我们利用三维免疫荧光、冷冻断裂和薄片电镜分析了豚鼠膀胱平滑肌细胞中e-偶联相关蛋白的分布。结果表明，DHPRs、RyRs和钙螯合蛋白相互靠近，形成类似于横纹肌钙释放单位（CRU）的复合物（参见Sutko和Airey，1996年;弗兰齐尼·阿姆斯特朗和普罗塔西，1997年用于审查）。我们认为，这些配合物不仅是自发钙火花的场所，而且为DHPRs和RyRs之间的相互作用提供了结构基础，从而为e-偶联相关钙提供了结构依据²⁺释放。如前所示(Somlyo等人，1971年，请参阅Bolton等人，1999年)e-c偶联相关复合物位于平滑肌细胞膜的小泡结构域。然而，我们注意到，在大多数情况下，凹穴和SR-表面复合物并不直接相关。

这项工作并没有解决药物-机械耦合的问题，即使这种替代钙²⁺释放机制在豚鼠逼尿肌中有很好的表现。

材料和方法

豚鼠（约300g）因颈部脱位死亡，随后出血。

结果

膀胱DHPR的Western blotting检测

这个β-亚单位是DHPR的组成部分(Leung等人，1988年). 在骨骼肌中β-亚单位与通道形成一起针对CRUα1个亚单位(Neuhuber等人，1998年;Gerster等人，1999年)在激励-压缩耦合中非常重要(Gregg等人，1996年). 要么是β2或β平滑肌中通常存在3种亚型(Hohaus等人，2000年;Reimer等人，2000年). 绵羊6多克隆抗体用于检测L型钙²⁺渠道与α1和β-家兔骨骼肌的亚单位(图1,车道1;Pragnell等人，1991年;Arikkath等人，2003年). 通过对两个豚鼠膀胱的全部匀浆以及可溶性和粗膜组分进行Western blotting，检测膀胱平滑肌中抗体的反应性。抗体在粗膜部分检测到一个显著的70-kDa带(图1,车道2–5)这是在纯化膜部分中检测到的唯一条带(车道5). 该分子量适用于β2亚基，尽管略高于骨骼~60 kDa带。抗体不能识别α平滑肌L型通道的1亚单位。鉴于到目前为止主要的钙²⁺豚鼠膀胱内的通道为L型(Schneider等人，1991年)，由反β-亚单位抗体有望可靠地检测这些通道的位置。

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图1

兔骨骼肌膜制剂的蛋白质印迹(1)以及从豚鼠膀胱膜的粗制品中提取的几个组分(2–5). 免疫标记中使用的羊6抗DHPR（L型钙通道）血清识别兔SR中～100和60 kDa的两条带(Pragnell等人，1991年;Arikkath等人，2003年)，对应于α1和β-平滑肌粗膜中约70 kDa的亚单位和带，约为β2亚单位。针对兔骨骼肌制剂制备的绵羊粗抗血清与兔抗羊二级抗体结合后，对兔膜上的高分子量成分产生非特异性反应(车道1). 其他非特异性带（例如车道4，这可能是次级所拾取抗体的轻链，在纯化的膜部分中不存在，车道5). (车道1)兔骨骼肌膜组分；(车道2)豚鼠膀胱匀浆；(3号车道) 14,000 ×克颗粒；(4号车道) 30,000 ×克颗粒；和(5号车道)最终膜分数。

兔部分在第1道高分子量下的非特异性反应是由于使用了针对富含DHPR的兔骨骼肌制剂制备的粗羊抗血清，以及兔骨骼肌膜上的兔抗羊二级抗体。在豚鼠制剂中未观察到这种非特异性反应。图图例中描述了其他非特定带。

免疫荧光

利用三维图像复原技术定位荧光标记的二级抗体在分离的平滑肌细胞中的位置。图2图中显示了血管内皮素的位置，血管内皮素是致密斑块粘连部位的标记，收缩物质将张力传递到肌膜(North等人，1993年). 重建图像(左边)显示荧光像素，它们像珍珠串一样沿着条纹分布，与细胞长轴呈浅角度，由非荧光间隔隔开。XZ部分(正确的)从虚线所示的位置获得，显示的是仅在细胞外围的vinculin荧光像素，形成一个包围细胞细胞质的环。Na人⁺/钙²⁺交换器；钙螯合素；ryanodine受体；和β-L型钙的亚基²⁺通道都位于质膜或非常靠近质膜的小的离散点上（未显示）。因此，尽管SR分布在细胞内部及其外围，但钙螯合素和ryanodine受体主要分布在这些平滑肌细胞中细胞外围的离散位置。

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图2

豚鼠膀胱中单个酶解游离平滑肌细胞的荧光图像，用抗长春花碱抗体进行免疫标记。对这些图像进行了去卷积和阈值化；没有执行其他图像处理步骤。左边的两张图片是xy公司细胞被一分为二的投影（沿着xy公司平面），以防止前后表面重叠。右边的图片是x赫兹相同细胞的投影，但旋转90°后x个轴线；图像深度为336nm年和是从虚线指示的位置获取的。图像显示，vinculin清楚地位于细胞表面，并以纵向条纹分布。比例尺为5μ米。

双免疫标记用于确定位于细胞表面的外围蛋白之间的空间关系。由于致密体和小窝占据了表面膜的不同区域(Gabella，1971年)，vinculin作为致密体结构域的阳性标记和小窝结构域的阴性标记。图3A类显示了钙螯合素的双重标记(绿色)和文丘林(红色). 这两种蛋白质都被布置成沿长螺距纵向螺旋排列的串珠，但这两种蛋白的串珠位于不同的膜条上。因此，在叠加图像中，绝大多数绿色钙螯合素像素与红色管状素像素分开(正确的). 统计评估表明，这两种蛋白质的重合概率大大低于随机分布的预期概率(第页<0.001，见表1). 也就是说，这两种蛋白质的分布不是随机的，并且是相互排斥的，这表明含有钙螯合素的SR囊泡与质膜的小窝结构域相对应，这排除了含有长春花蛋白的致密体。

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图3

双免疫荧光图像比较了vinculin、钙螯合素、ryanodine受体、L型钙通道的分布(β-亚单位）和钠⁺/钙²⁺豚鼠膀胱单个游离细胞中的交换器。如中所示图2，显示该单元格的一半。对于每个图像对，一个图像被伪红色，另一个被伪绿色。在重叠图像中，如果两幅图像的三维坐标相同，则体素为白色；否则，体素将保持绿色或红色。由于强度信息无法转换为给定体素中的蛋白质副本数，因此强度信息已从数据中删除。高于阈值的体素为绿色或红色，重叠体素为纯白色。(A类)钙螯合素(绿色)和文丘林(红色)位于占据膜的单独纵向条纹的病灶处。(B类和C类)固钙素的病灶(绿色)和赖氨酸受体(红色)和钙通道焦点(绿色，由标记β-亚单位）和ryanodine受体(红色)占据相同的膜条并显示出相当大的重叠。(D类)与jSR组件不同，Na⁺/钙²⁺交换器(绿色)分布在整个细胞表面，不排除在管状蛋白中(红色)包含条纹，尽管它与vinculin不重叠。请参见表1了解定量细节。条形=5μ米。

表1

各种蛋白质的免疫标记重叠分析

带标签的对	观察到的重叠	由于偶然性，预期重叠*	观察到的重叠概率是偶然的
DHPR与RyR	61.3 ± 11.7 (4)	18.4	第页< 0.001
RyR与DHPR	59.3 ± 9.4	17.8
含RyR的碳酸氢钠	49.4 ± 9.2 (4)	18.4	第页< 0.001
RyR与钙螯合素	43.0 ± 8.6	16
长春花素与钙螯合素	9.5 (1)	33.6	第页< 0.001
钙螯合蛋白	7.5	26.6
含Na的Vinculin+/钙2+交换器	0.5 (1)†	1.2	第页< 0.001
纳+/钙2+含vinculin的交换器	15.6	32.4

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^*根据二项式分布预测计算重叠。观察到的重叠是包含第一个列出的分子且也包含第二个分子的体素百分比（平均值±SE）。括号中的数字是被检查的细胞数量；每个细胞提供大量数据（每个采集的体素一个，总计数千个）。

^†这些分子的一致体素染色百分比彼此不同，因为膜中标记有维酮的体素数量多于标记有钠的体素⁺/钙²⁺交换器。

钙螯合素、RyRs和DHPR相对于彼此的位置如所示图3，B类和C类.两种钙螯合素(图3B类,绿色)和钙²⁺通道(图3C类,绿色)与RyR共同定位(图3，B类和C类,红色). 重合体素的数量（如所示白色)非常显著，远大于随机分布的预测值（参见表1). 这表明位于外周的SR囊泡含有钙螯合素和赖氨酸受体，并且它们与含有DHPR的质膜斑块非常接近。粗略计数表明，在每个细胞表面上，对这三种蛋白质呈阳性的离散位点的数量在100到200之间。

通过比较，Na的分布⁺/钙²⁺交换剂分子与上述三种组分的交换剂分子明显不同。Na阳性病灶⁺/钙²⁺交换器数量少、体积小，并且随机分布在整个电池上(图3D类、交换器、，绿色; 文丘林，红色). 在纵向线条中没有对齐的趋势，也没有排除在标记有vinculin的条纹之外。然而，即使vinculin和交换器存在于相同的膜、目视检查和统计分析的一般区域内(表1)表明vinculin和交换器没有共定位。结论是，交换器被排除在黏附斑块（含维孔菌素）的位置之外，但分布在含有小凹条的条纹内部和之间，因此其位置与RyR-DHPR通道簇的位置不同。

电子显微镜

薄截面

平滑肌细胞的横截面显示了两个结构不同的区域，它们沿着细胞外围相互交替(图4A类). 在一个区域，质膜与周围致密体相连，与肌原纤维相连。这些对应于免疫标记所见的vinculin阳性位点，其特征是密集的质膜下基质。在第二区域，质膜下区域没有可见的亚表面细胞骨架成分，但有许多小泡从表面膜内陷(图4A类，协议双方箭头，一些小窝被标记为星号。另请参阅加贝拉，1971年,1972;Somlyo等人，1971年;Devine等人，1972年). 小泡和管状SR小泡位于小泡结构域内的细胞外围，不属于致密体结构域(图4A类,小箭头). 一般来说，这些外围SR轮廓比小窝的频率低，但由于体积较大且形状更复杂，它们所占细胞体积的百分比（2.8%）约等于小窝的百分比（2.7%）。除外周SR外，膀胱平滑肌还含有较少出现的内部SR成分，占细胞体积的1.3%，因此在这方面类似于其他相平滑肌(尼克松等人，1994年).

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图4

豚鼠膀胱横切面平滑肌细胞的电子显微镜显示两个结构不同的区域，它们沿着细胞外围相互交替。(A类)箭头之间是与小窝相关的膜段（小窝域）(星号)和外周SR池(箭头). 在这些节段之间是质膜与周围致密体相关的区域，而周围致密体又与肌原纤维相连。(B类–H（H）)小窝域内外周SR剖面的详细信息。所示的外周SR小泡具有致密的内容物，并且通过大密度连接到表面膜，即足部(箭头). 交叉点面积较小，包含2–3英尺。SR小泡通过足部与小窝密切相关的情况很少见(F类,箭头). 条形=100 nm。

一些外周SR小泡与表面膜形成连接（外周耦合），因此称为连接SR（jSR）(图4，B类–H（H）). jSR囊泡根据三种结构特征进行鉴定。小泡通过一个宽度恒定的窄连接间隙紧贴在表面膜上；相对较大的密度（英尺）位于接合间隙内(图4，B类–H（H）,箭头); 囊泡腔被电子密度高的物质占据。请注意，尽管这些jSR剖面位于小窝域内，但它们直接与表面膜形成连接，而不是与小窝形成连接。通常，紧邻caveolae的SR剖面(上囊泡在里面图4G公司)不要支撑脚，也不要通过脚与caveolae产生特定的联系，因此它们不是连接的。中显示了一个可能的异常图4F类，其中与单个小窝相关的一个SR囊泡似乎只有一只脚。

大多数jSR囊泡都很小，交界间隙只有两英尺(图4，C类–H（H）). 三英尺或更多英尺(图4B类)很少见到。接合间隙外未检测到脚。平均脚数为2.3±0.8/小泡轮廓（平均值±1 SD，n个=33个小泡），双脚之间的平均中心距为27.2±3.9nm。小脚承重SR小泡与表面膜之间的平均紧密接触面积可以通过以下考虑进行估算。平均而言，交叉处的线条为2.3英尺。假设脚按正交排列，如骨骼肌中的脚/连接点总数将为（2.3）²。与此安排的微小偏差不会显著改变数字。假设双脚之间的平均中心距为27.2nm，双脚所占的平均面积为3913nm².

冻裂

上述两种类型的膜域（有小窝和无小窝）在冷冻断裂复制品中可以清楚地识别，小窝的开口以小圆圈的形式可见(图5A类). 小泡分布在具有条纹形状的膜域中，条纹的方向可以是纵向的，也可以是与细胞纵轴略微成角的，并且占据总表面积的～50%。泡状结构域之间由光滑膜的纵向条纹隔开，没有内陷，这与致密体的位置相对应。

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图5

平滑肌细胞质膜的冷冻断裂复制品，图像中细胞的纵轴为～45°。(A类)小窝的开口，可见为小圆圈，局限于纵向的膜条（其中两条为箭头)由无内陷的膜区隔开，作为致密体附着部位。(B类)不同大小的膜内颗粒经常出现在小凹区，而在光滑的膜区较少出现。小群的大颗粒位于小窝结构域内的特定膜斑中。补丁用半圆表示，并以更高的放大倍数显示图6.条=1μm和0.5μ米。

不同大小的膜内颗粒在小窝附近更常见，而在光滑的膜域中较少出现(图5B类). 小窝结构域（而非平滑结构域）也包含小簇大的膜内颗粒，这些颗粒位于特殊的膜斑内。中的半圆图5，A类和B类，标记这些簇的位置并给出其频率的近似指示。在使用的放大倍数下，簇不太明显图5：详细信息如所示图6，它显示了一组小簇（介于箭头). 每个星团都是由间距很近的大尺寸粒子组成的。靠近团簇的膜被尺寸更可变、距离更可变的粒子占据。我们测量了（见方法）小团簇内所有粒子的表观直径和高度，并将这两个参数与包含小凹条纹的等尺寸膜附近区域中所有粒子的参数进行了比较。每一组测量都涉及一对紧邻的膜贴片（带或不带簇），从而确保铂厚度沉积和阴影角度相等。簇中所有粒子的平均宽度和高度分别为9.6±0.2 nm和9.3±0.2 nm（平均值±1 SE，来自15个膜片的168个粒子），而表面其他区域的粒子的相同参数分别为7.3±0.1和6.7±0.2 nm（来自15个膜片的199个粒子）。集群粒子和普通粒子的宽度和高度平均值之间的差异非常显著（学生t吨-测试，第页< 0.0001).

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图6

带有大颗粒（介于箭头). 每个斑块内都有一个同质粒子群，具有相同的特征，即大直径和细长阴影。同一斑块中几乎没有直径较小的颗粒。相比之下，周围膜中的颗粒大小和高度变化很大。在贴片内，粒子具有随机排列和可变间距。

大颗粒在特定区域内的分布没有显示出有序的迹象。粒子之间的间距是可变的，并且看不到可识别的几何体。在某些区域中，粒子相当紧密地聚集在一起(图6，A类和E类)，在其他人中更分散。由大颗粒簇占据的膜贴片的表面积（如方法部分所示测量）为4310±213 nm².每个贴片内大颗粒的平均数量为6.9±2.1（平均值±SD，来自四个膀胱的60个冻破贴片）。小窝膜中没有任何颗粒，如骨骼肌（未显示；杜尔亨蒂和弗兰齐尼·阿姆斯特朗，1975年).

讨论

豚鼠膀胱平滑肌细胞的免疫标记和电子显微镜为存在具有Ca三个重要成分的外周定位复合物提供了补充证据²⁺循环：L型钙²⁺启动e-c耦合的通道DHPR；负责Ca的RyR²⁺从SR中释放；和钙螯合素，增加管腔钙的总SR储存容量²⁺免疫荧光表明RyRs和Ca²⁺在0.1×0.1×0.35的体素范围内与钙螯合素共定位的通道μ米^三以及含有这些成分的位点位于或靠近细胞外围。电子显微镜图像证实了jSR囊泡的存在，其中含有足部和致密物质（可能是钙螯合素），这些物质确实存在于表面膜上，并与之形成外围耦合。由于脚的大小及其在纤维周围的位置与免疫标记确定的RyR阳性病灶相对应，因此将其识别为RyR。IP3受体的细胞质域肯定比RyR的小，尽管它们具有相同的四叶三叶草外观(Katayama等人，1996年). 在此基础上，可以排除带有IP3受体的足部识别。

基于以下考虑，我们进一步提出，聚集在位于小窝条的小膜片内的大膜内颗粒是L型通道（DHPRs），并且这些通道与RyRs紧密相关。首先，粒子团位于小凹条纹中β-免疫标记检测亚单位阳性病灶。钙免疫标记的比较²⁺通道和另一种质膜蛋白，Na⁺/钙²⁺交换器，证实了该技术在小凹域中检测前者而非后者的优先聚类的能力。其次，这些颗粒类似于骨骼肌和心肌中被识别为L型通道或DHPRs的颗粒(Block等人，1988年;Takekura等人，1994年;Sun等人，1995年;Protasi等人，1998年;Tijskens等人，2003年)根据它们的大小和在膜斑内聚集的趋势，其他蛋白质至少部分被排除在膜斑之外。第三，粒子团占据的斑块的大致大小非常接近被脚覆盖的SR膜表面的大小，这些SR膜表面与表面膜密切相关，因此形成了RyR-和Ca叠加的基础²⁺-免疫标记图像中的通道阳性体素。最近的出版物(Ohi等人，2003年)与本报告的不同之处在于，它发现了RyR的聚类，但未能检测到RyR和DHPR在具有可比起源的豚鼠平滑肌中的位置之间的对应性。差异的原因尚不清楚。BKCa通道被内部钙释放激活，表明接近RyRs(Benham和Bolton，1986年;Klöckner和Isenberg，1992年;Jaggar等人，1998年;Pérez等人，1999年;诸葛等，1998,1999,2002). 上述簇内和/或簇附近的一些粒子可能代表这些通道。

钙形成的络合物²⁺平滑肌中的通道、RyR和钙螯合素在结构上与横纹肌（骨骼肌和心脏肌）兴奋-收缩耦合中的CRU中发现的相同(麦克伦南和王，1971年;梅斯纳，1975年;Campbell等人，1980年;卡拉和琼斯，1983年;Jorgensen等人，1983年;Block等人，1988年;Takekura等人，1994年;卡尔等人，1995年;弗兰齐尼·阿姆斯特朗和基什，1995年;Sun等人，1995年;Scriven等人，2000年). 如果表面膜贴片中的颗粒是L型通道，那么Ca²⁺平滑肌CRU的通道/RyR比率为～2:1，因此与横纹肌CRU的相似(Block等人，1988年;Sun等人，1995年).

这些发现提出的一个直接问题是，经结构鉴定的平滑肌超分子复合物是否在e-偶联中具有功能活性，即是否为功能性CRU。这得到了两项研究结果的支持。首先，该平滑肌中e-c偶联蛋白复合物的外围位置与火花位点的外围位置一致（见引言）。其次，这种复合物的相对高频率（200–400个/细胞）与相对较大的内部钙一致²⁺e-c耦合期间释放。横纹肌（心脏和骨骼肌）的CRU包含更多RyR，而此处显示的是平滑肌的RyR（与Franzini-Amstrong等人，1999年)但火花的大小与横纹肌中观察到的火花大小相当。这种明显的差异可以用以下事实来解释：即使有更多的通道参与横纹肌的放电产生，但只有少数可用通道（1-5）参与(Wang等人，2004年).

膀胱平滑肌细胞的功能研究表明Ca²⁺通过L型通道的电流是Ca的主要途径²⁺流入，流入(Schneider等人，1991年)然后是Ca²⁺从SR释放，增益约为20倍(科克纳和伊森伯格1985b;Ganitkevich和Isenberg，1991年;Ganitkevich和Isenberg，1992年;Isenberg等人，1992年). 导致可检测到火花的活性释放部位在休息肌肉中很少(Herrera等人，2001年)，但在去极化过程中可激活高达200–400个/细胞（这些数据），这可能是由于从一个初始释放点扩散到其他释放点所致(Bolton和Gordienko，1998年;Ohi等人，2003年).

钙²⁺豚鼠膀胱平滑肌中的通道相关颗粒在小膜片内的排列没有明显的顺序。它们与骨骼CRU中二氢吡啶受体（L型通道）排列的比较(Block等人，1988年;Takekura等人，1994年;Nakai等人，1998年)和心脏病(卡尔等人，1995年;Sun等人，1995年;Protasi等人，1998年;Scriven等人，2000年)肌肉显示出与后者更为相似的结构。在心肌中，DHPRs的位置和分布是与RyR间接相互作用的理想方式，可能通过钙²⁺-活化钙²⁺释放(Herrmann-Frank等人，1991年). 事实上，SR-Ca的电压依赖性²⁺平滑肌中的释放类似于ICa通过DHPR的电压依赖性(Ganitkevich和Isenberg，1991年). 在这方面，它类似于心肌细胞，与骨骼肌纤维的S型依赖性不同(莫拉德和克莱曼，1987年). 平滑肌的DHPRs和RyR与心脏的关系比与骨骼类型的关系更密切(Ertel等人，2000年). 平滑肌中的RyRs为2型（心脏型）或3型(Herrmann-Frank等人，1991年;Xu等人，1994年;Jiang等人，2003).

Ca之间的密切空间关系²⁺这些发现中描述的通道和RyR簇是观察到的相互作用和Ca的基础²⁺在细胞外周释放，可能以类似于缺乏心肌细胞的方式T型小管(Junker等人，1994年;Kockskämper等人，2001年). 考虑到钙螯合素和IP3受体在某些平滑肌中的共定位(Villa等人，1993年)，后一个释放通道也可能位于这里描述的单元附近，并且可以提供由del Valle-Rodriguez等人（2003年）.

RyRs与表面膜的接近性具有重要的功能效应：它们的活性与L型钙的活性协同作用²⁺细胞质膜下[Ca大量增加的通道²⁺]进而通过BKCa通道产生自发瞬态外向电流（STOC(Benham和Bolton，1986年;科克纳和伊森伯格，1992年;Jaggar等人，1998年;诸葛等，1998,1999,2002;Pérez等人，1999年)钙诱导松弛的明显悖论(费伊，1995年;Jaggar等人，1998年). 小个体钙“火花”和STOC之间的关系，以及RyRs和BKCa通道的附近位置表明，大多数（但可能不是全部）RyR簇与BKCa渠道足够接近，可以通过钙释放来激活它们(诸葛等，1999,2002;Kirber等人，2001年,Ohi等人，2003年).

在这项研究中，RyRs在除外周定位簇以外的其他位点的位置没有通过电子显微镜或免疫标记检测到，但这不能完全排除。少量分散通道（参见Lesh等人，1998年)电子显微镜无法观察到。所用抗体可识别哺乳动物RyR2，也可识别两栖类β-RyR，相当于RyR3。尚不清楚它是否在平滑肌中识别RyR2、RyR3或两者，以及它是否可能错过不同种类的内部定位RyR。此外，即使被抗体识别，分散在膜中的少量通道也可能无法产生足够的信号。然而，火花（见引言）和BKCa通道激活（见下文）的功能证据都支持该肌肉中活跃RyR的主要肌下位置。

致谢

参考文献