非综合征性唇腭裂候选基因的医学序列分析

摘要

简介

介绍

非综合征性或孤立性唇腭裂（CL/P）在广泛的地理分布中发生，平均出生率为1/700[1]. CL/P是由多个相互作用的基因座和额外的环境协变量决定的复杂性状。最近的研究表明，3到14个相互作用的基因座为CL/P的遗传效应提供了一个很好的模型[2].

研究从动物模型和表达模式中选择的CL/P候选基因是一种常见的策略[三]. 为了确定与CL/P相关的基因，研究人员使用关联和连锁方法来评估遗传贡献。为了通过连锁或连锁不平衡策略检测极微小的基因对CL/P的影响，样本量需要很大，并且需要有一个共同的关联变异体（对于连锁不平衡）或大量的单基因座贡献（对于连锁）。我们使用直接测序作为另一种方法来研究CL/P的候选基因，希望能够确定对该疾病有轻微影响的基因。直接测序的结果MSX1系列[4,5]表明该基因的点突变是约2%CL/P病例的基础。我们报告了另外20个裂缝候选基因的测序结果。对于七个具有潜在致病性编码突变的基因，我们也进行了连锁不平衡研究。对于MSX1系列铃木等报道的P147Q突变[5]，我们调查了另外1098例唇裂病例。

结果

对爱荷华州和菲律宾唇裂人群中的20个基因中的149个外显子（代表DNA测序的77527个核苷酸），包括外显子-内含子边界和未翻译区域进行了突变筛查。表2总结了观察到的变异和假定突变的数量。在发现的256个变体中，9个基因中的16个错义突变似乎具有潜在的病因学重要性。所有16个错义突变都是在一个唇腭裂病例中观察到的，除了喷雾器2D20A和TBX10（待定）分别在2例和3例患者中发现R354Q突变。在186个匹配的对照组中没有发现(表3). 除了喷雾器2和英语2突变。两者喷雾器2突变位点以及三个英语2突变位点来自爪蟾对人类(图1; 完整数据可在http://genetics.uiowa.edu/publication/html). 这个2月2日和待定10R354Q突变位点在可供研究的其他物种直系同源序列中不保守。围绕2月2日A657H突变位点可能是钙结合EGF样结构域，存在于大量膜结合和细胞外蛋白中。此外喷雾器2K68N突变位点位于萌芽结构域并抑制Ras/有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联，这是一条对各种受体酪氨酸激酶激活启动的发育过程至关重要的途径。

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图1

GLI2 S1213Y和SPRY2 D20A可用基因同源序列的蛋白质比较

GLI2 S1213Y（A）和SPRY2 D20A（B）：绿色条表示每个场地的保护程度。红色的氨基酸表示突变位点。所有突变比较都可以作为补充材料在http://genetics.uiowa.edu/publications.html.

表2

通过直接序列发现的变量摘要

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表3

本研究中发现的潜在突变

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PolyPhen预测所有突变都是良性的(http://www.bork.embl-heidelberg.de/PolyPhen公司/)除了2月2日M597I和喷雾器2“可能具有破坏性”的D20A英语2S1213Y“可能具有破坏性”(表3). 然而，除了LHX8型E221A，英语2R426Q和英语2S1213Y突变，所有错义突变似乎都可能通过创建或灭活外显子剪接增强子序列来破坏剪接（完整信息可在http://genetics.uiowa.edu/publications.html/). 本研究中发现的突变似乎都没有破坏可能的外显子剪接沉默序列。

这个SATB2标准在1064个CEPH对照组中也未发现T190A突变。我们还测试了LHX8型E221A，滑雪A388V，喷雾器2D20A，和待定10在200个匹配人群的对照组中没有发现1064个CEPH对照组的R354Q突变。我们找到了LHX8型17个样本中E221A突变滑雪九个样本中的A388V突变存储260个样本中的D20A突变，以及TBX10（待定）六个样本中的R354Q突变。（我们的网站上提供了完整的列表：http://genetics.uiowa.edu/publications.html).

这个MSX1系列在1671名对照组中未发现P147Q突变，但在菲律宾1468例唇裂病例中的两个菲律宾唇裂家系中发现了P147Q变异，表明其频率为0.14%。第一个家族没有分叉的家族史，变异体与未受影响的母亲分离。第二个家庭有四个患有裂缝。该变体是在两个表亲身上发现的，从未受影响的祖母到她未受影响的儿子和九个兄弟的女儿都有。先证者的一个堂兄受到感染，但不携带变异。最后一个受累的是一个曾被切除的第三代堂兄弟，也有一个裂缝，但不携带变体(图2).

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图2

分离MSX1 P147Q突变的菲律宾家系系谱

PP（脯氨酸-脯氨酸）表示野生型基因型。PQ（脯氨酸-谷氨酰胺）表示携带突变个体的基因型。

这个LHX8型和SATB2标准突变最初见于菲律宾的单个病例。对于SATB2标准T190A，该变异体是由未受感染的母亲传播的。这个LHX8型E221A突变也由未受影响的母亲传播，存在于一名受影响者和一名未受影响者中，但在八个兄弟姐妹的两个未受影响兄弟姐妹中不存在(图3). 这两个突变位点在人类和小鼠之间都是保守的（参见附录http://genetics.uiowa.edu/publications.html/). 这个滑雪在爱荷华州的一例病例中发现A388V突变。该突变是由母亲传播的，突变位点在人类、鱼类和青蛙物种之间是保守的。来自爱荷华州的两起案件喷雾器2D20A突变。其中一人有可用的父母DNA样本，并将突变从未受影响的母亲中分离出来。来自爱荷华州的三名腭裂患者展示了TBX10（待定）R354Q突变。在有父母样本的两个病例中，一个从母亲那里获得突变的等位基因，另一个从父亲那里获得（都未受影响）。

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图3

LHX8 E221A突变的菲律宾先证者家系

突变的分离模式与该疾病的简单孟德尔模型不一致。

EE（谷氨酸-谷氨酸）表示野生型基因型。EA（谷氨酸-丙氨酸）表示携带突变的个体的基因型。

进行了另外两项有趣的观察。爱荷华州一例以孤立性唇裂伴腭裂为表现的病例，没有唇裂家族史或DiGeorge综合征的任何特征，该病例被发现为先天性唇腭裂的纯合子TBX1（待定）基因（189个核苷酸进入内含子8）。186个匹配的对照组中没有这种变体。我们检测了该病例是否存在泛素融合降解基因的两个拷贝（UFD1L），使用DiGeorge或22q综合征的测定[6]，结果正常。父母的样本无法用于进一步研究该病例，也没有足够的DNA可用于通过Southern blot分析确认可能的缺失。一个单一的罕见纯合子变异体的发现表明该区域可能存在微缺失或节段性等位基因。我们在先证者和母亲样本上检测了四个微卫星标记（D22S420、D22S1685、D22S683和D22S445）。母亲的D22S420和D22S683标记与先证者有不同的基因型，但这一发现并不排除母亲的节段性等位基因，因为这两个标记之间的间隔包含TBX1，为32 cM（未显示数据）。

第二个观察涉及四个菲律宾病例，在最后一个病例中出现了错义突变滑雪氨基酸（P728L）。在186个匹配的对照组中未发现这种突变。有一个病例似乎是从头开始的滑雪P728L突变。本病例表现为孤立的右侧唇腭裂和裂口家族史阳性。父母双方都没有这种变异，在检测了20个多态性标记后，证实了他们与该病例的生物学关系。在其他三例患者中，有一例有积极的破裂家族史。对于这个病例，我们测试了15个同胞后代中的父母、祖父母和三个兄弟姐妹。其中一名接受测试的兄弟姐妹患有右侧唇腭裂并伴有小头畸形。这个滑雪P728L变异体从未受影响的祖父分离到未受影响父亲。在测试的三个兄弟姐妹中，两个未受影响的兄弟姐妹有变异，但受影响的姐妹没有。根据这个家庭，我们得出结论滑雪P728L变异体可能不是一种病因突变，并将其包含在表2.

对这些基因进行了连锁不平衡研究GLI2、JAG2、MSX2、SATB2、滑雪、SPRY2、，和TBX10（待定）在其中观察到了可能的病因学错义突变（完整信息可在http://genetics.uiowa.edu/publications.html/;的结果福克斯1之前在Marazita等人[7]). 在受影响或未受影响的个体中，未检测到任何单核苷酸多态性表明偏离Hardy-Weinberg平衡的证据（数据未显示）。利用FBAT的HBAT功能进行单倍型分析(http://www.biostat.harvard.edu/~fbat/fbat.htm)证明了两者之间的边界关联MSX2系列两个菲律宾语(第页=0.001）和爱荷华州(第页=0.008）人口，介于2月2日和菲律宾人(第页=0.004），以及两者之间SATB2标准(第页=0.03）和TBX10（待定）(第页=0.04）和爱荷华州人口。然而，当我们将MSX2系列菲律宾和爱荷华州人群的单倍型数据，关联性较弱(第页= 0.09). 我们还观察到CL/P和snp2（rs2843159）在滑雪(第页=0.000004）。CL/P和滑雪在菲律宾人中，单倍型分析也表明(第页= 0.0002). 此外，同样滑雪snp2标记仅在拉丁美洲先天性畸形协作研究（ECLAMC）中的南美裂开人群中显示与唇裂相关(第页= 0.004).

讨论

候选基因中的点突变福克斯1、GLI2、MSX2、滑雪、SATB2、，和喷雾器2在孤立性唇腭裂病例中，总的出现率高达6%，丰富了双侧唇腭裂患者和阳性家族史患者。本研究中发现的突变在其他哺乳动物中是保守的，可能破坏外显子剪接增强子序列，并且在400到2000条控制染色体中没有发现。这个2月2日根据PolyPhen的预测，M597I和A657H突变虽然可能破坏外显子剪接增强子序列并可能损坏JAG2蛋白，但在其他物种中并不保守，可能是罕见的多态位点。

测试大量的对照样本被证明是区分罕见多态性和病因突变的有用方法。这个LHX8型E221A，SATB2标准T190A，滑雪A388V，存储2D20A，和TBX10（待定）最初在大约200个匹配的对照中未观察到R354Q变体。此数量的控件通常用于假设，如果不存在变体，则很可能是因果关系，尽管模型已表明大量控件有助于消除罕见变体[8]. 然而，当我们在1064个扩展控件中测试这些变体时，我们发现LHX8型17个个体的E221A变异体滑雪9例A388V突变喷雾器260个个体中的D20A突变，以及TBX10（待定）R354Q，6人。虽然未受影响的对照组中氨基酸的变化并不排除它们在CL/P中的作用，但这确实使它们在额外的功能分析中处于较低的优先级组，并且使它们很难在任何应用的遗传咨询环境中使用，因为它们最多可能是，具有低外显率贡献等位基因的修饰物。

一些变体，如滑雪A388V突变，保守到爪蟾和罗非鱼但在对照组中发现，这表明单靠物种保护可能不足以证明特定变异体的致病作用。

我们的研究说明了将人群中罕见的突变定义为因果突变的困难。只有当我们将我们的筛查范围扩大到一个更大的对照组时，才发现研究病例中发现的许多错义突变，该对照组由来自世界各地的种族多样性群体的样本组成。此外，没有任何突变与受影响的亲本分离。外显率不完全可能是导致突变的原因，其他导致断裂的基因如MSX1系列[9]和FGFR1号机组[10]突变。我们之所以发现这些突变，可能是因为我们检测的病例更有可能表现出更强的遗传贡献（家族史阳性和双侧唇腭裂的病例）。突变，如MSX1系列P147Q和其他似乎显示不完全外显率的疾病与由SCN5A型[11],IRF6型[12]，或挪威克朗2.5[13].

这个MSX1系列在菲律宾的两例唇裂患者中发现了P147Q突变，但在1600多个对照组中均未发现。这种特异性突变似乎是约0.15%明显孤立CL/P病例的基础。如前所述，这种变异导致可变表达和外显率降低，这使得在准确测量遗传咨询风险之前，有必要对其表型结果进行前瞻性研究[5].

突变破坏真正的外显子剪接增强子的严格证明需要序列自主促进剪接，而这种增强在突变体中是不存在的。得分矩阵法的优点[14]它允许直接测试对单个假定增强子位点的预测影响，而不必通过测试一个外显子上的多个随机突变和/或缺失来表征外显子剪接增强子。表S2中的所有15个突变似乎使四种富含丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白质中的至少一种失活和/或产生预测的外显子剪接增强子。然而，序列中高得分基序的存在并不一定能确定该序列在其自然背景下是外显子剪接增强子。

在TBX1，我们在爱荷华州的一例唇裂病例中发现了一种罕见的纯合型内含子变体，这可能表明唇裂是由隐性功能性内含子突变引起的TBX1，或直接测序无法显示的微缺失。本案例没有涉及22q删除UFD1L公司基因。在400名受试者中的任何其他人中检测到这种罕见的纯合子而没有这种变异，这表明这些个体在这个基因座和基因上可能具有相同的血统。这种变体本身，或其他处于连锁不平衡状态的变体TBX1，可能是一个低形态等位基因，其联合存在导致基因表达或功能发生足够的变化，从而触发表型。因此，调控区的其他等位基因待定1应优先进行识别。

我们小组以前的工作已经筛选FGFR1、IRF6、MSX1、TGFA、，和TGFB3型用于唇裂病例的突变。点突变MSX1系列似乎约占所有CL/P病例的2%[4].FGFR1号机组点突变似乎也与CL/P有关。此外，FGFR1号机组功能丧失突变可导致卡尔曼综合征的形式，在出生和儿童期模仿孤立的CL/P。中的突变IRF6，导致裂、范德沃德综合征和腘翼状胬肉综合征[12]虽然在保守区发现了罕见的非编码变异体，但与本研究在同一组唇裂病例中未发现。然而，IRF6型与CL/P密切相关，可能是裂缝的遗传修饰物[15,16]. 以前用于TGFA、，在个别病例中发现了保守非编码片段中的5个变异，但在278名对照组中未发现[17]. 在目前的研究中，我们在单个个体中发现了另外九个非编码罕见变异，但我们没有发现最初报道的五个罕见变异或任何可能是病因的编码突变。如果这些变异体是致病突变，他们不仅可以解释孤立的口面部裂和TGFA公司变体[18]，但也有连锁研究表明2p13中存在裂缝易感性位点TGFA公司基因座[7]. 对于TGFB3，我们之前报道了一例腭裂错义突变（K130R），这是350名对照组中唯一未发现的病例[19]. 我们在TGFB3型在我们当前的研究人群中。

功能缺失突变英语2与垂体异常和前脑无裂畸形样特征有关[20]. 在本报告中，三个家系分离英语2临床信息完整的功能丧失突变表现为口面部裂和多指畸形。我们发现了四个错义突变英语2在高度保守的氨基酸中。其中一例还表现为多指畸形(表3).

我们对发现潜在致病错义突变的基因进行了连锁不平衡研究。我们发现一个标记（rs2843159）和一个单倍型在滑雪在菲律宾人口中。这种关联也在一个来自南美洲的独立人口数据集中发现。这个滑雪基因座1p36.3以前被认为是高加索人的唇裂易感性基因座[21,22].滑雪出现唇裂的空小鼠[22]当包括唇部受累的病例时，我们发现这种关联性似乎更强。

腭裂与腭裂表型和SATB2标准与细胞遗传学证据一致。缺失和平衡易位表明2q32-q33上存在一个位点，其单倍体不足导致孤立性腭裂。基因突变分析SATB2标准（位于2q32-q33）在70例无关的单纯腭裂患者中没有发现任何编码区变异[23]. 然而，对13个基因组扫描的裂痕进行的荟萃分析表明，2q32-q35是一个裂痕易感性位点[7]. 我们研究了184例唇腭裂病例，发现其中一个错义突变SATB2标准（T190A），这在大约1200名对照组中未见。根据我们研究的连锁不平衡和突变分析结果，我们认为外部存在调节因素SATB2标准编码区可能与裂痕有关。

总之，从表达、动物和人类数据中选择的20个候选基因中，有6个基因的点突变可能导致约5%的孤立裂缝，更有可能是表型更严重和/或家族史阳性的裂缝。Etiologic variants in regulatory elements of滑雪，JAG2，和MSX2系列也可能导致孤立的裂缝。ESEfinder的预测(http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/)和PolyPhen关于本研究中发现的错义突变的功能，以及外显子剪接增强和蛋白质损伤，都很难解释。

这些研究中的一个主要挑战是患有先天性唇裂的先证者的近亲经常缺乏唇裂表型，以及罕见的错义突变。在某些情况下，这些变异可能不是病因，但在其他情况下，裂口外显率降低可能是裂口常见的一种积极因素[9,10]以及其他先天性炉膛疾病等先天性缺陷。类似地，这些突变可能只是表型的修饰物。

由微缺失或等位体引起的病例也可能导致裂开。这项研究说明了测试更多对照品以确定罕见多态性变体和优先进行罕见点突变功能研究的有效性。考虑到其他最新数据FGFR1、IRF6、，和MSX1系列在分离的CL/P中，人们可以开始考虑对一组高概率候选基因进行测序，以用于遗传咨询指示。尽管任何特定突变的外显率甚至病因学问题尚未解决，但这方面的进展现在是可以测量的。

材料和方法

收集了两组CL/P病例，其中91例来自菲律宾，93例来自美国爱荷华州，用于搜索20个候选基因的突变(表1). 我们从现有病例中选择了更严重的病例，测序样本中增加了双侧唇腭裂病例，这些病例有积极的唇腭裂家族史（39/91例来自菲律宾，16/93例来自爱荷华州）。两个病例后来被发现有相关特征，一个是Stickler综合征，最初没有家族史，另一个是多指畸形。在微笑国际行动的赞助下，对菲律宾的案例进行了研究[24]. 患者由委员会认证的临床遗传学家（JCM或同事；见确认书）在菲律宾四个地点之一（Cavite、Kalibo、Cebu和Negros）进行观察和检查。爱荷华州的病例是通过爱荷华出生缺陷登记处收集的[25]. 在获取血样之前，所有参与者均已签署同意书。根据公布的方案提取DNA。

表1

候选基因研究

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对于20个候选基因中的每一个，所有外显子以及5′和3′非翻译区域都在两个方向上进行了测序。我们的网站上提供了引物序列和PCR条件(http://genetics.uiowa.edu/publications.html). 底漆福克斯1、GLI2、MSX2、OSR2、，和TGFBR1型是从文献中获得的[20,26–29]. 使用4μl Applied Biosystems Big Dye Terminator测序试剂、1μl 5μM测序引物、1μl DMSO、4μl 2.5×Buffer和2.5 ng/100碱基对DNA模板，在20μl反应中进行循环测序。在96°C下进行30 s的变性步骤后，将反应在96℃下进行10 s、50℃下进行5 s和60℃下进行4 min的40个循环的循环排序。使用标准协议执行清理。将样品重新悬浮在40至100μl ddH中₂O、 然后将2.5μl注入Applied Biosystems 3700测序仪。Applied Biosystems序列软件（版本2.1.2）用于车道跟踪和首次通过基地呼叫。色谱图被传输到Unix工作站，底座用PHRED（版本0.961028）调用，用PHRAP（版本0.960731）组装，用POLYPHRED（版本0.970312）扫描，结果用CONSED（版本4.0）查看[30]. 当结果表明可能存在新的变异时，对病例样本、其他可用的家族成员和人群控制进行重新测序。使用相同的方法对这些数据进行分析。

对于任何编码变体，我们对186个人群匹配的对照组进行了直接测序。对照人群按上述方法收集病例，包括病例收集地点相同的成年人中无CL/P或其他公认出生缺陷的个体。如果在一个或多个对照组中发现变异，则认为是多态性。为了扩大检测的对照组数量，我们开发了针对LHX8型E221A中，SATB2标准T190A，滑雪A388V，喷雾器2D20A，和TBX10（待定）R354Q突变。我们在CEPH多样性细胞系小组中对其进行了测试[31]它由1064份来自培养的淋巴母细胞系的DNA样本组成，这些细胞系来自51个不同人群的个体。

我们还开发了一种用于MSX1系列最近在三个越南唇裂家庭中报告的P147Q错义突变[5]. 除了1064 CEPH Diversity Cell Line Panel控件外，我们还测试了MSX1系列在另外607名菲律宾对照组和1468名菲律宾唇裂患者中进行P147Q检测。

对于9个具有潜在病因学错义突变的基因，我们使用智人FOXE1、GLI2、LHX8、JAG2、MSX2、SATB2、SKI、SPRY2、，和TBX10，作为参考序列。我们与现有物种进行了蛋白质序列比较。我们还使用在线提供的ESEfinder软件预测外显子剪接增强子的存在[14]似乎普遍存在，并且可能存在于大多数外显子（如果不是所有外显子）中[32,33]. 我们筛选了Wang等人鉴定的141个外显子剪接沉默十倍体[34]检查这些基因是否会受到我们发现的错义突变的影响。最后，我们使用PolyPhen软件（也可在线获得）预测氨基酸取代对人类蛋白质结构和功能的影响[35–37].

为每个群体选择两个弱连锁不平衡的单核苷酸多态性，对例中有错义突变的基因进行连锁不平衡研究，而对照组没有。选择了四个单核苷酸多态性英语2基于国际HapMap项目的基因连锁不平衡模式（数据未显示）。等位基因的频率可以在补充材料中找到(http://genetics.uiowa.edu/publications.html). 基于TaqMan的分析[38]在Applied Biosystems 7900 HT序列检测系统（Applied Biosystems，Foster City，California，United States）上进行。对于中的一个标记滑雪（rs2843159），我们使用了先前报道的动态聚合酶链反应分析[39]. 这些连锁不平衡研究由来自菲律宾的296个完整的三联体（母亲/父亲/受影响的孩子）和来自爱荷华州的205个三联体组成。这些样本是按照上文所述通过测序调查的病例和对照获得的。基于家庭的关联测试（FBAT）[40–42]程序用于此分析。考虑到进行的试验次数，使用Bonferroni校正计算显著性数字[43]. 通过Bonferroni校正，单个标记分析的α值为0.0003（0.05/192比较），单倍型分析的α为0.0001（0.05/384比较）。连锁不平衡研究福克斯1之前在Marazita等人[7].

第三组来自南美洲的434个病例/母亲对的分裂人群样本集用于复制任何显著关联。这些人口样本来自ECLAMC，这是一项基于医院的出生缺陷登记研究，包括阿根廷、玻利维亚、巴西、智利、厄瓜多尔、巴拉圭、乌拉圭和委内瑞拉的地点。之前已经详细描述了该研究人群[44,45]. 为了分析ECLAMC样本，Weinberg的似然比检验（LRT）[46]是在假设父系等位基因的分布与母系等位基因的分布相同的情况下应用的。

支持信息

致谢

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脚注

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