结节性硬化综合征（TSC）是一种常染色体显性遗传病，可导致肾脏、大脑、心脏、眼睛和皮肤中良性肿瘤错构瘤的形成。这些缓慢增殖的生长物无组织但有分化，通常含有巨细胞，导致肾脏并发症和神经异常，如自闭症、精神发育迟缓和癫痫（综述见参考文献。1). 遗传研究表明TSC是由基因突变引起的TSC1类或TSC2系统分别编码蛋白质产物hamartin（≈130 kDa）和tubin（≈200 kDa(2,三). 据报道，哈马丁和块茎蛋白相互作用体内作为一种复合物，它们对细胞生长（细胞质量/大小增加）和增殖（细胞数量增加；参考文献。4和5). 怎么TSC1类和TSC2系统在分子水平上的功能尚不清楚。
在黑腹果蝇,dTSC1和dTSC2共同调节细胞生长和增殖，遗传上位性分析将tuberin-hamartin复合物置于果蝇属磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和dAkt/蛋白激酶B（PKB），但在dS6K上游(6,7). 最近，据报道Akt可磷酸化块茎蛋白体内哺乳动物细胞内的Ser-939和Thr-1462(8). 此外，具有这些Akt磷酸化位点突变为丙氨酸的块茎突变体在胰岛素刺激下显著抑制核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）的激活(8)表明在哺乳动物细胞内，tuberin-hamartin复合物作用于Akt下游和S6K1上游。这些数据与以下观察结果一致，即S6K1活性在淋巴管平滑肌瘤病患者的病灶内异常增加TSC2系统突变(9)和内部TSC1类-小鼠胚胎成纤维细胞无细胞系(10)而PI3K和Akt的基础活性保持不变。
S6K1激活通过PI3K依赖和mTOR依赖的信号机制实现（参考文献。11和12，参见参考文献中的审查。13). mTOR（也称为FRAP/RAFT/RAPT）是S6K1的一个关键调节因子，用特异性抑制剂雷帕霉素处理细胞可迅速完全灭活S6K1（见参考文献综述）。14). mTOR属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶的一个家族，被提议用于感知营养（例如，氨基酸；参考文献。15)和能量（如ATP）充足性(16). mTOR参与蛋白质翻译、细胞周期进展和细胞增殖的调节(14,17). 4E-结合蛋白1（4E-BP1）的调节也依赖于mTOR，其中雷帕霉素处理细胞时发生的低磷酸化4E-BPl与eIF4E结合，并阻止eIF4E形成驱动cap依赖性翻译所需的起始复合物（参见参考文献中的综述）。14). 类似于S6K1，4E-BP1的磷酸化通过PI3K和mTOR依赖性信号传导机制受到影响（参见参考文献中的综述）。13).
这里，我们展示了TSC1类和TSC2系统基因产物hamartin和tubin抑制mTOR介导的4E-BP1和S6K1输入。重要的是，来自TSC患者的TSC2突变体在抑制4E-BP1磷酸化方面存在缺陷，这突出了这项工作的生理意义。这些研究扩展了目前对TSC的理解，并将mTOR及其下游成分确定为筛选用于治疗TSC患者的药物的可能靶点。
材料和方法
cDNA结构。
人类TSC1类和TSC2系统cDNA由D.J.Kwiatkowski（马萨诸塞州波士顿哈佛大学）提供，并亚克隆到pRK7中，以便用N末端标记（MDYDDDDK）融合表达hamartin或tubin。如所述，生成N-末端血凝素（HA）标记（HA）-S6K1载体(18). pACTAG2/3HA-4E-BP1是N.Sonenberg（加拿大蒙特利尔麦吉尔大学）赠送的礼物。使用QuikChange（Stratagene）进行定点突变，以在TSC2内产生突变。
细胞培养、转染和提取物制备。
人类胚胎肾293E（HEK293E）和人类U20S骨肉瘤细胞按所述进行培养和维持(18,19). 磷酸钙瞬时转染HEK293E细胞(18)U20S细胞和Fugene6。转染后（40小时），按所述方法收集细胞(19). 使用绿色荧光蛋白表达载体进行的转染显示约25-30%的细胞被转染。在适用的情况下，将细胞无血清培养18小时。为了分析不溶性颗粒，用裂解缓冲液（10 mM KPO）清洗颗粒两次4/1 mM乙二胺四乙酸钠/10 mM氯化镁2/50 mMβ-甘油磷酸盐/5 mM EGTA/0.5%Nonide P-40/0.1%Brij 35/1 mM原钒酸钠/40 mg/ml苯甲基磺酰氟脲/10μg/ml亮氨酸蛋白酶/5μg胃蛋白酶抑制素，pH 7.2），然后在样品缓冲液中煮沸20分钟。对于氨基酸提取/再添加，将细胞洗涤一次，并用D-PBS（含有1 mg/ml D-葡萄糖的PBS；GIBCO/BRL）孵育1小时。将培养基替换为D-PBS pH 7.2（1 mg/ml D-葡萄糖），补充有从MEM（Eagle最小必需培养基）氨基酸溶液（GIBCO/BRL）稀释的5倍氨基酸混合物细胞溶解前1h。
蛋白质磷酸化和结合分析。
按说明进行蛋白质印迹(19). 抗Flag单克隆小鼠M2抗体购自伊士曼柯达。抗HA抗体是M.Chou（费城宾夕法尼亚大学）赠送的礼物。从Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）获得抗4E-BP1、-tubin、-Akt和-eIF4E抗体。如前所述生成有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）抗体(20). 亲和层析纯化eIF4E7GTP-Sepharose按说明执行(19).
免疫沉淀和免疫复合物激酶分析。
用与蛋白A-Sepharose（Amersham Pharmacia）结合的抗HA抗体从提取物中免疫沉淀HA标记的Akt和S6K1 3 h。洗涤免疫沉淀并测定S6K1激酶活性在体外如前所述，通过使用重组GST-S6(21). 合并的量化32使用IMAGEQUANT软件在Bio-Rad荧光成像仪上测定P标记。
结果
Hamartin和Tuberin的共表达抑制4E-BP1的胰岛素刺激磷酸化，导致eIF4E功能抑制。
考虑到S6K1活性在含有失活突变的细胞中是高的TSC1类或TSC2系统基因(9,10)我们检测了另一个PI3K和mTOR依赖信号的下游靶点4E-BP1是否受到hamartin和tubin的影响。转染hamartin、tubin和4E-BPl的HEK293E细胞缺乏血清，然后用胰岛素刺激。胰岛素刺激这些细胞可特异性激活PI3K通路（如Akt的Thr-308磷酸化所观察到的，见图。一个)而不是MAPK途径。福尔波12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）是一种蛋白激酶C的激活剂，能强烈激活MAPK通路，用作对照。分析Nonidet P-40可溶和不可溶部分中的hamartin和tubin（图。B顶部和中部结果表明，当与块茎蛋白共表达时，细胞裂解液中的hamartin含量更高。较高水平的hamartin's可能反映了块茎蛋白从不溶性膜组分伴随hamartin进入胞浆的能力(22). 正如预期的那样，在胰岛素刺激下，块茎蛋白在Akt磷酸化位点Thr-1462被磷酸化（图。B底部).
哈马丁和块茎蛋白抑制PI3K依赖的4E-BP1磷酸化。将共表达标记hamartin（Ham）和tubin（Tub）的HEK293E细胞与标记HA-的4E-BP1进行血清饥饿处理，并用20 nM雷帕霉素（rap）预处理30分钟，然后用胰岛素（100 nM）或PMA（100 ng/ml）刺激30分钟。(一个)测定Akt的水平和Thr-308磷酸化以及MAPK亚型（p44和p42）的水平和磷酸化。(B类)从细胞裂解物（Sol）和不溶性部分（Non-Sol）中获取火腿蛋白和块茎蛋白水平，如材料和方法使用抗Flag抗体。使用块茎蛋白Thr-1462磷酸特异性抗体分析了Thr-1452块茎蛋白磷酸化。(C类)如图所示，外源性4E-BP1的磷酸化通过抗HA抗体和4E-BP1-Thr-37和/或46、Ser-65和Thr-70的磷酸特异性抗体进行测定。4E-BP1的α-、β-和γ-物种被相应地标记。(D类)细胞提取物在m7GTP-Sepharose，如中所述材料和方法测定了经铜纯化的eIF4E和外源4E-BP1的水平。
通过SDS/PAGE可以分辨出三种磷酸化的4E-BP1，其中α-亚型的磷酸化程度最低，γ-亚型磷酸化程度最高。如雷帕霉素所观察到的，哈马丁和结核菌素共表达阻断了胰岛素刺激的4E-BP1在Thr-36和/或Thr-45、Ser-65和Thr-70的磷酸化（图。C类). 为了检测4E-BP1与eIF4E的关联，首先使用m7GTP类似物（耦合到Sepharose珠）。m7在大多数哺乳动物mRNAs的5′端发现了GTP帽部，eIF4E与之相互作用以驱动帽相关翻译（参见参考文献。14). 绑定到eIF4E/m的HA-taged 4E-BP1的级别7比较了GTP复合物（图。D类). 雷帕霉素治疗或hamartin和tubin的共表达抑制了胰岛素诱导eIF4E释放4E-BP1的能力，表明tubin-hamartin复合物抑制eIF4E功能，因此可能抑制cap依赖性翻译。
Hamartin和Tuberin抑制增殖U20S细胞中4E-BP1和S6K1的信号传导，TSC患者的Tuberin突变体（K599M）在抑制4E-BPl磷酸化方面存在缺陷。
为了排除细胞特异性或激动剂特异性效应，我们检测了在血清中过度表达hamartin和tubin的U2OS细胞中的4E-BP1磷酸化。hamartin和tubin的共表达对抑制4E-BP1磷酸化和S6K活性有显著作用（图。 一个和B类分别），表明块茎蛋白-哈马rtin复合物影响调节4E-BP1和S6K1的上游信号传导成分。
火腿草素和块茎素抑制增殖细胞内4E-BP1磷酸化和S6K1活性。U20S细胞过度表达4E-BP1(一个)或S6K1(B类)如图所示，在血清中生长含有或不含有hamartin（火腿）和块茎蛋白（Tub）的小鼠，并用20nM雷帕霉素（Rap）处理30分钟。Hamartin、tubin和MAPK亚型（作为负荷控制）蛋白质水平显示。相应地标记4E-BP1的α、β和γ物种。S6K1激酶检测按照材料和方法显示了S6K1的总电平。成立32对GST-S6中的P标记进行评估，并提供凝胶的放射自显影。比率32将纳入GST-S6的P标签与空载体（pRK7）进行标准化。所提供的数据代表了至少三个实验。(C类)HEK293E细胞过度表达4E-BP1（含或不含hamartin（Ham）、tubin（Tub）和tubin K599M突变体[Tub（K599M）]，如有指示，则对其进行血清饥饿处理，然后用100 nM胰岛素刺激30分钟（如有指示）。如图所示，分析了Hamartin和tubin的表达以及4E-BP1的磷酸化程度。C类.
很可能是TSC2系统在TSC患者中发现，其编码的功能失调的结节蛋白抑制4E-BP1信号的能力受损。为了解决这个模型，在TSC患者中发现的一个结节蛋白点突变（K599M）与hamartin和4E-BP1共存（图。C类). 表达hamartin和tubin K599M突变体未能抑制4E-BP1磷酸化，而野生型tubin与hamartin的共表达却能抑制4E-BP磷酸化。
Hamartin和Tuberin对S6K1活性的抑制依赖于mTOR。
为了探讨块茎蛋白-哈马丁复合物是否在mTOR水平上负调节S6K1活性，我们使用了对雷帕霉素耐药的S6K1突变体（图。一个). 我们比较了野生型S6K1和S6K1-F5A-ΔCT，后者在mTOR信号基序中包含一个点突变（Phe5Ala），并伴有101个氨基酸的C末端缺失。这种S6K1突变体对胰岛素有反应，但完全抵抗雷帕霉素的抑制作用（尽管比活性显著降低）。第二个突变体F5A/E389-ΔCT（由F5A-ΔCT生成）具有高活性，对雷帕霉素完全耐药，并且具有与野生型S6K1类似的比活性(18).
Tuberin-hamatin对S6K1的抑制依赖于mTOR。(一个)S6K1构造的图示。(B类)对过度表达这些S6K1蛋白的HEK293E细胞（含或不含hamartin（Ham）和tubin（Tub））进行血清饥饿处理，用20 nM雷帕霉素预处理30 min，然后用100 nM胰岛素刺激30 min，如有指示。测定Thr-308处hamartin、tubin的表达以及Akt磷酸化的蛋白水平和程度。按照图进行S6K1激酶分析。图中显示了S6K1的活性，对于每个S6K1结构体的胰岛素处理样品，S6K1活性标准化为1。这些数据代表了三个单独的实验。
胰岛素刺激HEK293E细胞后对这些S6K1衍生物的分析表明，hamartin和tuberin共表达导致野生型S6K1的基础活性降低了四倍，胰岛素刺激活性降低了两倍（图。B类). S6K1的雷帕霉素抗性突变体（F5A-ΔCT和F5A/E389-ΔCT）对hamartin和tubin共表达及雷帕霉素治疗的抑制作用完全不敏感。这些结果表明，结核菌素-哈马丁复合物通过mTOR依赖性途径抑制S6K1，尽管不如雷帕霉素有效。
哈马丁和土霉素通过mTOR抑制氨基酸依赖性信号传导。
氨基酸的提取，如雷帕霉素对mTOR的抑制，可以阻止野生型S6K1的激活，但不能阻止S6K1对雷帕霉素的抗性突变体的激活(23,24). 因此，我们检测了hamartin和tuberin是否可以在细胞中重新添加氨基酸时阻止S6K1的激活。Hamartin和tubin共表达阻止了U20S细胞内氨基酸介导的S6K1激活（图。一个). 这种作用比在沃特曼宁治疗中观察到的抑制作用更为显著，这意味着块茎-哈马丁复合物抑制收敛于mTOR的信号通路。为了进一步支持这一结果，HEK293E细胞被剥夺了氨基酸，然后用氨基酸和胰岛素刺激（图。B类). 无论是雷帕霉素处理还是hamartin和tubin的共表达都比沃特曼宁更能抑制氨基酸介导的S6K1活化。然而，在含有氨基酸的胰岛素刺激下，沃特曼抑制S6K1的激活，其水平与单独使用氨基酸的刺激相当，并且这种抑制作用比hamartin和tubin共存时更强。因此，在这些实验中，hamartin和tuberin共表达并不能完全阻断mTOR依赖性信号传导对有丝分裂原的反应。
哈马丁和块茎素通过mTOR抑制氨基酸介导的信号传导至S6K1。U20S系列(一个)和HEK293E(B类)S6K1过度表达hamartin（Ham）和tubin（Tub）的细胞缺乏营养（D-PBS），如材料和方法细胞用20 nM雷帕霉素或100 nM沃特曼肽预处理30 min，然后在持续存在抑制剂的情况下重新添加氨基酸。如图所示，用100 nM胰岛素处理HEK293E细胞30分钟。hamartin、tubin和Akt水平，以及Thr-308处Akt的磷酸化（如确定）。按照图进行S6K1激酶分析。对于仅提取氨基酸的样品，S6K1的活性被标准化为1。这里提供的数据代表了三个单独的实验。
Hamartin和Tuberin抑制独立于PI3K的mTOR介导的信号传导。
本研究和我们之前的研究表明，块茎蛋白-hamartin复合物损害S6K1的激活，Akt对PI3K激活的反应使块茎蛋白磷酸化绕过了这种抑制(8). 为了研究薯蓣皂苷复合物对PI3K非依赖性S6K1激活的影响，研究了在沃特曼存在和不存在共压榨薯蓣黄素和薯蓣素的情况下，胰岛素刺激的S6K1活化（图。). Wortmanin阻断了Thr-308的Akt磷酸化，证实PI3K被抑制。哈马丁和结核菌素共表达进一步抑制沃特曼处理细胞中野生型S6K1的活性，其水平与雷帕霉素处理的细胞相当。Wortmann治疗完全阻断F5A-ΔCT（雷帕霉素抗性）S6K1突变体的胰岛素依赖性激活（图。)而hamartin和tubin共表达或雷帕霉素治疗几乎没有效果（如图。B类). 这些数据进一步支持了结节蛋白-哈马丁复合物抑制mTOR介导的信号传导的模型。
哈马丁和块茎蛋白抑制独立于PI3K信号传导的S6K1活性。对过度表达野生型或F5A-ΔCT S6K1的HEK293E细胞（含或不含hamartin（Ham）和tubin（Tub））进行血清饥饿处理，用20 nM雷帕霉素或100 nM沃特曼素预处理30 min，然后用100 nM胰岛素刺激30 min，如有指示。测定了hamartin和tubin的表达以及Thr-308处Akt的蛋白水平和磷酸化程度。按照图进行S6K1激酶分析。图中显示了S6K1的活性，对于每个S6K1构建体的胰岛素模拟样本，该活性标准化为1。
讨论
在这里，我们表明，块茎蛋白-哈马丁复合物抑制mTOR介导的4E-BP1和S6K1信号传导。我们还发现，tuberin-hamartin复合物不仅损害S6K1的胰岛素依赖性刺激，而且阻断胰岛素依赖性通路。在所研究的4E-BP1和S6K1的所有信号传递方面，块茎蛋白-哈马丁复合物与雷帕霉素（已知的mTOR抑制剂）具有相似的作用。在这些结果的基础上，我们提出了一个模型，通过该模型，hamartin和tuberin可以直接或间接地限制mTOR依赖性信号传导。只有当mTOR依赖性信号完整时，如在营养和能量充足期间，由丝裂原处理激活的PI3K依赖性信号才会导致S6K1的完全磷酸化和激活，4E-BP1的磷酸化和失活。通过PI3K和Akt进行信号传递还有另一个重要目的，即磷酸化块茎蛋白(8)并抑制结节蛋白-哈马丁复合物作为mTOR抑制剂的功能。因此，mTOR只能在营养、能量和有丝分裂充分期间为S6K1和4E-BP1磷酸化提供许可信号（见图。).
模型显示，块茎蛋白-哈马丁复合物通过mTOR调节4E-BP1和S6K1的PI3K依赖性信号。通过Akt介导的在Ser-939和Thr-1462的酪蛋白磷酸化，PI3K的激活导致酪蛋白-错构瘤蛋白复合物失活(8). 块茎蛋白-哈马丁复合物的失活释放了对mTOR的抑制，并允许mTOR向S6K1和4E-BP1-eIF4E复合物发出营养依赖性信号。因此，cap依赖性和5′末端寡嘧啶束（5′-TOP）mRNA介导的翻译增加。虚线箭头描述了Akt磷酸化mTOR的发现(32).
我们提供的数据表明，hamartin和tubin共表达抑制eIF4E。eIF4E过度表达导致细胞转化(25,26)，4E-BP1的过度表达阻断了eIF4E依赖的转化(25). 我们表明，与野生型块茎蛋白不同，TSC患者（K599M）中发现的一种块茎蛋白在抑制4E-BP1磷酸化的能力上受损（图。C类). 这一结果表明，块茎蛋白-哈马rtin复合物未能下调4E-BP1磷酸化可能在生理上导致人类疾病。因此，正常eIF4E调控的缺失可能至少部分地驱动TSC肿瘤的扩张，导致参与细胞生长和增殖的因子的不当表达(27). Hamartin和tuberin共表达也比wortmannin更有效地抑制氨基酸介导的S6K1活化，这意味着tuberin-Hamartin复合物也可以独立于PI3K信号传导抑制S6K1激活的mTOR依赖性输入。
在哺乳动物细胞内，hamartin或tubin的过度表达导致通过G1/S转换(28,29). TSC患者错构瘤中巨细胞的存在也突显出这些结节蛋白错构蛋白复合物可以限制细胞生长。最近在中的工作果蝇属与上述哺乳动物数据一致，其中dTSC1或dTSC2增加单元格数量和单元格大小(6,7). 鉴于我们在mTOR信号和TSC之间建立的联系，由结核菌素-hamartin复合物介导的生长和增殖抑制可能是通过抑制mTOR依赖性信号而实现的，而这种信号在TSC患者肿瘤中被消除。与此一致，最近在这两个领域的工作果蝇属哺乳动物细胞表明，mTOR信号通过G1/S转换(19,30,31). 似乎抑制mTOR信号的失败可能是TSC患者各种组织生长增加的原因。因此，雷帕霉素作为一种用于癌症化疗和再狭窄的抗增殖药物，目前正在临床试验中进行测试，可能对TSC患者的治疗有用。本文的研究表明，mTOR、4E-BP1/eIF4E和S6K1的下游靶点可能是设计治疗结节性硬化症的治疗药物的重要靶点。
