通过干环RT–PCR实时定量微小RNA
陈彩福,* 达娜·里德松（Dana A.Ridzon）,亚当·J·布鲁默,周朝晖,丹尼·H·李,朱莉·T·阮,毛拉·巴比辛,南兰旭,维克拉姆·马哈瓦卡,马克·安徒生,老开琴,肯尼思·利瓦克、和卡尔·J·盖格勒 应用生物系统公司，美国加利福尼亚州福斯特市林肯中心大道850号，邮编94404
2005年5月24日收到；2005年7月8日修订；2005年10月25日接受。
版权©作者2005。牛津大学出版社出版。保留所有权利 本文的在线版本是在开放存取模式下发布的。用户有权出于非商业目的使用、复制、传播或展示本文的开放存取版本，但前提是：原创作者是正确且完全归属的；《华尔街日报》和牛津大学出版社被认为是原始出版地，并提供了正确的引用细节；如果一篇文章随后被复制或传播，而不是全部复制或传播，而是部分复制或传播，或者作为衍生作品复制或传播，则必须清楚地表明这一点。如需商业再使用，请联系gro.slanruojdrofxo@snoissimrep.slanruej
- 补充资料
【补充资料】
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摘要
一种新的microRNA（miRNA）定量方法已经开发出来，它使用干环RT和TaqMan PCR分析。茎环RT引物在RT效率和特异性方面优于常规引物。TaqMan miRNA分析对成熟的miRNAs具有特异性，并可区分差异仅为一个核苷酸的相关miRNA。此外，它们不受基因组DNA污染的影响。大多数miRNAs的总RNA只有25 pg，因此通常可以实现精确定量。事实上，这种方法的高灵敏度、特异性和精确性允许在没有核酸纯化的情况下直接分析单个细胞。与标准TaqMan基因表达分析一样，TaqMan-miRNA分析显示出7个数量级的动态范围。对7个小鼠组织中的5个miRNAs进行定量分析表明，每个细胞的miRNAs10个拷贝数小于10个，而miRNAs30个拷贝数大于30 000个。这种方法能够快速、准确和灵敏地分析miRNA的表达，并可以识别和监测组织或疾病特异性的潜在生物标志物。干环RT-PCR可用于其他小RNA分子的定量，如短干扰RNA（siRNAs）。此外，茎环RT引物设计的概念可以应用于小RNA克隆和多重分析，以获得更好的特异性和效率。
简介
微RNA（miRNAs）是天然存在的高度保守的转录家族（长度为18-25 nt），由较大的发夹前体加工而成(1,2). miRNAs存在于动物的基因组中(三–9)和植物(10–12). 到目前为止，桑格中心miRNA注册库中有约1000个独特的转录本，包括326个人类miRNA(13).
miRNAs通过催化信使RNA（mRNA）的裂解调节基因表达(14–19)或抑制mRNA翻译(19–21). 它们被认为在细胞发育、分化和通讯中至关重要(2). 具体作用包括调节细胞增殖和代谢(22)，发展时机(23,24)，细胞死亡(25)，造血(26)，神经元发育(27)，人类肿瘤发生(28)DNA甲基化和染色质修饰(29).
虽然miRNAs代表了一类相对丰富的转录物，但它们的表达水平在物种和组织之间差异很大(30). 较少的miRNAs通常通过克隆、北方杂交等技术逃避检测(31)和微阵列分析(32,33). 在这里，我们提出了一种新的实时定量方法，用于准确、灵敏地检测miRNAs和其他小RNA。该方法扩展了实时PCR技术，用于检测从大分子（如mRNA）到小分子（如miRNA）的基因表达变化。
材料和方法
靶点、引物和探针（补充数据）
17个miRNA基因从桑格中心miRNA注册库中选择http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml所有TaqMan miRNA分析可通过Applied Biosystems（P/N:4365409）获得。标准TaqMan®使用PrimerExpress设计了pri-miRNA前体、pri-let-7a-3和pri-miR-26b以及前miRNA前体pre-miR-30a的分析®软件（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。补充数据部分提供了所有序列。合成miRNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies（IDT，Coralville，IA）。
组织RNA样品、细胞、细胞裂解物和总RNA制备
从Ambion购买第10-12天大脑、心脏、肝脏、肺、胸腺、卵巢和胚胎的小鼠总RNA样品（P/N:7810、7812、7814、7816、7818、7824、7826和7968）。Ambion的小鼠总RNA来自瑞士韦伯斯特小鼠。所有RNA样本均根据TaqMan标准化®人或小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内源性对照的基因表达测定（P/N：4310884E和4352339E，Applied Biosystems）。
使用Gibco MEM（P/N:12492–021，Invitrogen，Carlsbad，CA）培养两个细胞系HepG2和OP9，补充10%胎牛血清（FBS）（P/N:SH30070.01，HyClone，Logan，UT）。用血细胞仪计数胰蛋白酶化细胞。约2.8×106悬浮细胞在1500转/分离心（Allegra 6，Beckman Coulter，Fullerton，CA）5分钟，用不含MgCl的1 ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤2和氯化钙2（零件号：14190078，Invitrogen，Carlsbad，CA）。将细胞颗粒重新悬浮在140µl PBS中，并使用三种不同的样品制备方法进行处理。在第一种方法中，50µl样品（106细胞）与等量核酸纯化裂解液（P/N:4305895；Applied Biosystems）通过上下移液管混合10次，然后短暂旋转。在将溶液添加到RT反应之前，用1 U/µl RNase抑制剂溶液（P/N:N8080119；Applied Biosystems）将裂解液稀释1/10。在第二种方法中，50µl样品（106根据制造商的协议，使用mirVana™miRNA分离试剂盒（P/N:1560，Ambion，Austin，TX）纯化总RNA。纯化的总RNA在100µl洗脱缓冲液中洗脱。第三种方法是用1×PBS稀释细胞1/2，在95°C下加热5分钟，然后立即在冰上冷却，然后直接等分到RT反应中。
使用mirVana™miRNA检测试剂盒检测miRNA
根据制造商的协议，使用mirVana™miRNA检测试剂盒（分类号：1552，Ambion）进行基于溶液杂交的miRNA分析。通过IDT合成RNA探针。放射性同位素标记的RNA片段通过旋风储存磷光系统（马萨诸塞州波士顿珀金埃尔默）进行检测和定量。
逆转录酶反应
逆转录酶反应包含RNA样品，包括纯化的总RNA、细胞裂解物或热处理细胞、50 nM干环RT引物（P/N:4365386和4365387，Applied Biosystems）、1×RT缓冲液（P/N:4319981，AppliedBiosystes）、每个dNTP 0.25 mM、3.33 U/µl MultiScribe逆转录酶和0.25 U/µl核糖核酸酶抑制剂（P/N:N8080119；Applied Biosystems）。将7.5µl反应在Applied Biosystems 9700热循环器中的96或384孔板中培养30分钟（16°C）、30分钟（42°C）和5分钟（85°C），然后在4°C下保持。所有逆转录酶反应，包括无模板对照和RT阴性对照，均重复进行。
聚合酶链反应
使用标准TaqMan进行实时PCR®应用生物系统7900HT序列检测系统的PCR试剂盒协议（P/N:4329002，应用生物系统）。10µl PCR包括0.67µl RT产物，1×TaqMan®通用PCR主混合液（P/N:4324018，Applied Biosystems），0.2µM TaqMan®探针、1.5µM正向底漆和0.7µM反向底漆。反应在384孔板中95°C培养10分钟，然后在95°C下40个循环培养15秒，在60°C下培养1分钟。所有反应均进行三次。阈值周期(C类T型)定义为荧光通过固定阈值的分数周期数。塔克曼® C类T型使用合成lin-4 miRNA的标准曲线将数值转换为绝对拷贝数。
pri-miRNA前体let-7a-3和miR-26b以及前miRNA前体miR-30a的实时定量方法在别处描述(34).
结果
我们提出了一种新的实时RT-PCR方法用于miRNA定量(). 它包括两个步骤：RT和实时PCR。首先，将干环RT引物与miRNA分子杂交，然后用MultiScribe逆转录酶逆转录。接下来，使用常规TaqMan PCR对RT产物进行定量。
TaqMan miRNA分析的示意图描述，基于TaqMans的miRNA实时定量包括两个步骤，即干环RT和实时PCR。茎环RT引物与miRNA分子的3′部分结合，并用逆转录酶进行逆转录。然后，使用传统的TaqMan PCR对RT产物进行定量，该PCR包括miRNA-特异性正向引物、反向引物和染料标记的TaqMan探针。5′末端正向引物的目的是根据miRNA分子的序列组成提高其熔化温度（Tm）。
miRNA定量方案的动态范围和灵敏度首先使用合成的cellin-4靶点进行评估。根据A定量合成RNA260价值和稀释超过7个数量级。cel-lin-4 TaqMan miRNA分析显示目标输入的对数与C类T型值，证明该分析的动态范围至少为7个对数，并且能够在PCR反应中检测到7个拷贝().
TaqMan lin-4 miRNA检测的动态范围和灵敏度。(A类)合成lin-4 miRNA七个数量级的扩增图。合成RNA输入范围为1.3×10−3fM（相当于每个反应7份）至1.3×104fM（7×107每个反应的拷贝数）；(B类)lin-4 miRNA的标准曲线。
此外，还使用小鼠肺总RNA验证了八种额外的miRNA分析。RNA输入范围为0.025至250 ng(). 这个C类T型与RNA输入相关的值(R（右）2>0.994）超过四个数量级。阴性对照试验cel-miR-2即使在与250 ng小鼠总RNA的反应中也没有给出可检测的信号。
总RNA输入与周期阈值的相关性(C类T型)八种miRNA分析的值。小鼠肺总RNA输入量为0.025至250纳克/次RT反应。A类秀丽隐杆线虫miRNA（miR-2）作为阴性对照试验。
在七种不同的小鼠组织中测定五种miRNA的表达谱，以创建miRNA表达图。根据输入的总RNA（假设15 pg/细胞）和合成lin-4靶的标准曲线计算每个细胞的拷贝数。从这个表达图中进行了一些有趣的观察。首先，miRNAs非常丰富，在这些组织中每个细胞平均有2390个拷贝。每个细胞的表达量在10到32090拷贝之间。在12个miRNA中，miR-16和miR-323分别是所有组织中含量最高和最低的miRNA。此外，每个组织都有独特的miRNA表达特征。miRNA的总表达水平在小鼠肺中最高，在胚胎中最低。最后，在这七种组织中，miRNA表达的动态范围变化很大，从小于5倍（let-7a）到超过2000倍（miR-323）().
表1
| miRNA ID | 每个单元格的拷贝数 | c折叠变换 |
|---|
| 大脑 | 心脏 | 肝脏 | 肺 | 胸腺 | 卵巢 | 胚胎 | 平均 | |
|---|
| 第7a列 | 2010 | 1420 | 700 | 2390 | 1420 | 3120 | 1050 | 1730 | 5 |
| miR-16型 | 10 240 | 13 520 | 3890 | 22 080 | 32 090 | 11 100 | 5210 | 14 020 | 6 |
| miR-20型 | 70 | 300 | 130 | 580 | 1990 | 420 | 620 | 590 | 28 |
| miR-21型 | 670 | 2540 | 4450 | 7970 | 3550 | 5310 | 390 | 3550 | 20 |
| miR-22型 | 290 | 1020 | 310 | 590 | 130 | 560 | 40 | 420 | 26 |
| 平均 | 2240 | 2040 | 1140 | 4430 | 3540 | 2600 | 750 | 2390 | 17 |
为了评估RNA分离的需要，我们将细胞裂解物直接添加到miRNA分析中。将相当于2.5–2500个细胞直接添加到7.5µl RT反应中。检测到后C类T型相关值(R（右）2>0.998）RT反应中至少三个数量级以上的细胞数量().
使用OP9细胞裂解物的八种TaqMan miRNA分析的动态范围。每个RT.A的细胞输入数量从3个到2500个不等秀丽隐杆线虫miRNA（miR-2）作为阴性对照。
非特异性基因组DNA对TaqMan miRNA检测的影响也进行了12次检测。结果显示C类T型在存在或不存在添加到RT反应中的5ng人类基因组DNA的情况下的值，表明该测定对RNA靶标具有高度特异性（数据未显示）。基于此观察，我们将热处理细胞直接添加到miRNA定量分析中。说明了使用纯化的总RNA、细胞裂解物和来自等量HepG2细胞的热处理细胞对miRNA定量的比较。将热处理的细胞直接添加到miRNA测定中产生的结果最低C类T型三种不同的样品制备方法之间的值和良好的一致性。
对热处理细胞、细胞裂解物和总RNA进行比较，以实时定量10个miRNA。在阈值周期中测量miRNA表达水平(C类T型). 每个PCR分析约400个HepG2细胞。
TaqMan miRNA分析的再现性通过两个独立操作员执行12个miRNA分析和16个重复进行检查（数据未显示）。的标准偏差C类T型s平均值为0.1，证明了分析的高精度。
基于溶液杂交的miRNA北部分析被用作一项独立技术，以与TaqMan miRNA分析进行比较(). 我们观察到，基于杂交的miRNA分析的重复性较差，与TaqMan分析的一致性因靶点而异。这两种方法基本一致(R（右）2=0.916），针对五个小鼠组织样本的miR-16。然而，对于不太丰富的miRNAs，如miR-30，相关性相对较低(R（右）2=0.751）。
TaqMan miRNA miR-16分析与基于溶液的北方杂交分析的比较。使用来自小鼠肾脏、肝脏、肺、脾和睾丸组织的总RNA。
杂交方法对成熟的miRNA缺乏特异性。我们使用pri-miRNA前体、pri-miR-26b和pri-let-7a的合成靶点以及前miRNA前体pre-miR-30a，研究了TaqMan miRNA分析区分成熟miRNA及其较长前体的能力(). 设计用于检测前体或成熟miRNAs的TaqMan分析进行了测试，合成靶点平均为1.5×108每个RT反应的拷贝数（1.3×107每个PCR的拷贝数）。仅产生pri-miRNA前体分子的TaqMan miRNA分析C类T型值至少比成熟miRNA分析高11个周期。这一结果表明，如果成熟miRNA和前体的浓度相等，后体将为成熟靶点的检测贡献<0.05%的背景信号。对于成熟miRNA miR-30a-3p位于前miR-30a序列3′端的前miR-30α，差异为8.4C类T型观察到。结果表明，TaqMan miRNA检测对成熟miRNA具有特异性。然而，如果miRNA位于前miRNA前体的5′链上，则检测特异性更好。对总RNA而非合成靶点进行分析的实验表明，前体分子的丰度至少比成熟的miRNAs低两个数量级C类T型miR-26b-1和let-7a-2前体差异为7或更多。综合考虑，这些结果表明TaqMan miRNA分析对成熟miRNA具有高度特异性。
表2
| 身份证件 | 合成miRNA（拷贝数） | 合成前体（份数） | 总RNA（ng） | C类T型微小RNA | 前辈 |
|---|
| miR-26b型 | 1.5×108 | 0 | 0 | 16.5 | ND（无损检测） |
| 0 | 1.5 × 108 | 0 | 27.4 | 18.7 |
| 0 | 0 | 7.5 | 21.9 | 28.7 |
| 0 | 0 | 0 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| let-7a | 1.5 × 108 | 0 | 0 | 16.5 | ND（无损检测） |
| 0 | 1.5 × 108 | 0 | 29.5 | 19.4 |
| 0 | 0 | 7.5 | 19.9 | 34.7 |
| 0 | 0 | 0 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| miR-30a-3p | 1.5 × 108 | 0 | 0 | 15.8 | ND（无损检测） |
| 0 | 1.5 × 108 | 0 | 24.2 | 17.2 |
| 0 | 0 | 7.5 | 25.4 | 30.3 |
| 0 | 0 | 0 | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| miR-30a-5p | 1.5 × 108 | 0 | 0 | 16.3 | ND（无损检测） |
| 0 | 1.5×108 | 0 | 29.1 | 18.9 |
| 0 | 0 | 7.5 | 22.1 | 30.3 |
| 0 | 0 | 0 | 39.6 | ND（无损检测） |
用let-7a、let-7b、let-7c、let-7d和let-7e五种合成miRNAs测试TaqMan miRNA分析区分差异小至单个核苷酸的miRNAs的能力(). 对每种miRNA进行检测。相对检测效率根据C类T型完美匹配和不匹配目标之间的差异，假设完美匹配的效率为100%。观察到非常低的非特异性信号水平，对于具有2–3个不匹配碱基的miRNAs，其范围为0至0.3%，而对于与单个核苷酸不同的miRNAs，其范围仅为0.1–3.7%。大多数交叉反应是由RT反应期间的G–T错配引起的（let-7a分析与let-7c靶点等）。如果任何两个miRNA之间存在三个以上不匹配的碱基，则仅检测到目标miRNA。
let-7 miRNA分析的鉴别能力。相对检测（%）计算依据C类T型完全匹配和不匹配目标之间的差异。总计1.5×108将合成RNA的拷贝添加到RT反应中。浓度是根据A类260值。
我们比较了TaqMan miRNA分析和基于溶液的杂交分析的鉴别能力(). 在我们手中，杂交方法很好地区分了let-7a和let-7b。然而，let-7a、let-7c和let-7d之间的差别很小或没有差别，相差1-3 nt。
基于溶液杂交（northern）分析的miRNAs识别能力较差。
我们推测，茎环引物可能比线性引物提供更好的RT效率和特异性。茎的碱基堆积可能增强RNA-DNA异源双链的热稳定性。此外，与传统的线性RT引物相比，茎环的空间限制可能会提高检测特异性。我们使用合成miRNAs比较了let-7a的干环和线性RT引物的敏感性和特异性(). 我们观察到干环RT的几个优点。首先，在合成let-7a靶的存在下C类T型线性RT法和干环RT法之间的值相差7，表明干环RT的效率至少高出100倍。其次，干环RT能够更好地区分基于Δ的两个碱基差异的miRNAsC类T型值。最后，基于ΔC类T型（前体与成熟）。
TaqMan miRNA分析在干环和线性RT引物之间的特异性。针对let-7a、let-7e和pri-miR前体let-7a-3测试成熟let-7a特异性分析。ΔC类T型代表C类T型两个目标或方法之间的差异。总计1.5×108合成靶的拷贝被添加到每个RT反应中。
讨论
自从发现miRNAs以来，这些基因家族特征的显著进步揭示了它们在基因调控中的作用机制(35). 因此，广泛的调查已经开始确定针对组织类型或疾病状态的miRNA生物标记物。这些研究将受益于能够准确识别和定量miRNAs的方法。
目前检测和定量miRNAs的方法主要基于克隆、northern印迹(5)，或底漆延伸(36). 尽管微阵列可以提高miRNA分析的吞吐量，但该方法在敏感性和特异性方面相对有限(32,33). 低灵敏度成为miRNA定量的一个问题，因为很难扩增这些短RNA靶点。此外，低特异性可能导致来自密切相关的miRNA、前体和基因组序列的假阳性信号。最近，有报道称，一种改进的Invader分析方法可以定量分析几种miRNAs(37). 然而，入侵检测的特异性和敏感性有限，每次检测至少需要50 ng总RNA或1000个裂解细胞。
实时PCR是基因表达定量的金标准(38,39). 对于科学家来说，设计一种平均长度为～22nt的miRNAs的常规PCR检测方法是一个长期的挑战。我们开发了一种新的方案来设计TaqMan PCR检测方法，该方法比现有的传统检测方法具有更高的性能，能够专门量化miRNA表达水平。我们设计并验证了222种人类miRNAs的检测方法（Chen等.，未发表的数据）。这些分析结合了PCR的强大功能，具有极高的灵敏度、大动态范围的实时监测以及TaqMan分析报告，以提高特异性。在我们手中，miRNA前体的有效靶点至少是成熟miRNA的2000倍(). 由于这些检测对前体或基因组DNA不敏感，我们能够将热处理的细胞直接添加到检测中，从而消除了样品制备的需要。对于成熟miRNAs及其前体都需要检测的应用，传统TaqMan检测可以与特定检测的前体并行使用。
我们观察到，与传统的线性引物相比，茎环RT引物具有更好的特异性和敏感性，这可能是由于碱基堆积和茎环结构的空间限制所致(). 碱基堆积可以提高热稳定性，并扩大RT引物/RNA双链的有效足迹，这可能是相对较短的RT引物进行有效RT所必需的。茎-环结构的空间限制可能会阻止其结合双链基因组DNA分子，因此无需TaqMan miRNA分析来制备RNA样品。茎环RT引物可能用于多重RT反应和小RNA克隆，以获得更好的效率和特异性。
越来越需要敏感和特异的完整miRNA分析。有效分析miRNA的能力可能导致发现疾病或组织特异性miRNA生物标记，并有助于理解miRNA如何调节干细胞分化。我们的茎-环RT-PCR方法应该为这些研究提供一个实用的解决方案。我们目前正在开发多种方法，这将进一步提高该方法的实用性。
致谢
我们非常感谢凯利·麦克唐纳（Kelly McDonald）、芬顿·威廉姆斯（Fenton Williams）、威尔·布洛赫（Will Bloch）、尼尔·斯特劳斯（Neil Straus）和维克托·安布罗斯（Victor Ambros）对手稿的批判性阅读。支付本文开放获取出版费用的资金由应用生物系统公司提供。
利益冲突声明。未声明。
参考文献
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