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分子生物学细胞。2005年12月；16(12): 5761–5772.
数字对象标识：10.1091/桶。E05-07-0651号
预防性维修识别码：项目经理1289419
PMID：16207814

一种新的内循环信号识别Trk神经营养素受体的生物反应D⃞

陈哲余,*† 亚历山德罗·伊拉西,* 迈克尔·塔诺维茨,‡和弗朗西斯·S·李*§
理查德·阿索扬，监控编辑器
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摘要

信号受体的内吞运输到交替的细胞内途径已被证明会导致不同的生物学后果。在本研究中，我们报告了两种神经营养素受体（原肌球蛋白相关激酶TrkA和TrkB）与各自的配体（神经生长因子和脑源性神经营养因子）结合后穿越不同的内吞途径。我们提供证据表明，神经分泌细胞和神经元中的TrkA受体主要以配体依赖的方式再循环回细胞表面。我们已经确定了TrkA膜旁区的一个特定序列，该序列与TrkB受体的序列不同，并且对于内化受体的快速循环既必要又充分。相反，TrkB受体主要被分类到降解途径。将TrkA再循环序列移植到TrkB受体中可以将TrkB接收器重新路由到再循环途径。最后，我们将这些不同的贩运途径与其他生物反应联系起来。与TrkB受体相比，在长期神经营养素治疗中，TrkA受体产生磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号的长期激活以及生存反应。这些结果表明，TrkA受体主要以信号依赖的方式循环，其独特的生物特性由其特定的内吞运输路线决定。

简介

神经营养素，如脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF），是一个生长因子家族，在脊椎动物神经系统和心血管发育和功能中发挥关键作用(Tessarollo，1998年;Huang和Reichardt，2001年;赵，2003). 神经营养素的作用由两类细胞表面受体决定，即原肌球蛋白相关激酶（Trk）受体酪氨酸激酶和p75神经营养素受体。已经证实，Trk受体与神经营养素结合后，会以依赖于氯氰菊酯的方式迅速内吞(格里姆斯等., 1997). 配体结合后Trk受体对不同途径的后细胞分选对神经营养素的生理反应有重要影响，因为它们还决定了激活的Trk受体启动的细胞内信号级联的强度和持续时间(Heerssen和Segal，2002年). 神经细胞中Trk受体的逆行运输是研究最为广泛的细胞后途径之一，这已被证明是营养反应所必需的(金蒂和西格尔，2002年). 然而，已经证明只有一小部分Trk受体是逆行转运的。在交感神经元的分区培养中，8小时后在细胞体内仅发现远端隔室中激活的Trk受体的一小部分（～2%）(Ure和Campenot，1997年;Tsui-Pierchala和Ginty，1999年).

Trk受体可以遵循的两种替代内吞途径是运输到溶酶体或再循环到质膜。溶酶体降解途径的特点是细胞表面受体总数下调，对配体的反应性降低。已经证明，对于TrkA和TrkB，在配体与受体结合后，这些受体的一部分可以被分类为降解途径(克努塞尔等., 1997;索末菲等., 2000;朱利安等., 2002;萨克森那州等., 2005). 此外，在临床试验中，肌萎缩侧索硬化（ALS）患者的系统性BDNF治疗导致BDNF脱敏或支持作用受限(韦萨达等., 1994)这可能是因为TrkB受体下调(Thoenen，2001年;Thoenen和Sendtner，2002年).

相反，关于Trk受体是否向回收途径运输的研究较少。一般来说，受体再循环回质膜可导致功能性再敏和细胞表面特异性信号事件的延长。研究表明，许多细胞表面受体，如转铁蛋白受体，通过膜体流“默认”再循环到质膜(市长等., 1993;格伦伯格，2001年). 或者，对于某些受体，例如G蛋白偶联受体，已经确定了特定的“再循环”序列和分选分子，它们是内吞受体以配体依赖性靶向再循环途径所必需的(曹等., 1999;聪等., 2001;量规等., 2001;Tanowitz和von Zastrow，2003年;Vargas和von Zastrow，2004年). 在Trk受体中，一项研究表明可能存在Trk受体再循环，使用碘化神经生长因子（NGF）证明内吞的NGF重新释放到介质中(Zapf-Colby和Olefsky，1998年).

Trk受体向降解或再循环途径的内吞运输是一个复杂的、高度调控的过程，其机制尚不清楚。在此背景下，提出了关于这一生理重要受体酪氨酸激酶的贩运命运的三个基本问题。首先，Trk受体是否会进入回收途径？如果是这样，是否存在结构决定因素，如“再循环信号”，在再循环和降解途径之间调节这种排序决定？第二，不同Trk受体的细胞后命运有差异吗？先前的研究表明，TrkA和TrkB受体具有潜在的差异信号和生物反应(卡特等., 1995;索末菲等., 2000)尤其是在长期使用各自配体（NGF或BDNF）治疗的情况下。特别是，通过TrkA和TrkB受体之间的结构域交换，确定了TrkB感受器中的某些细胞内区域是优化TrkB接收器降解所必需的(索末菲等., 2000). 第三，如果TrkA和TrkB的细胞后命运存在差异，交替的内吞贩运是否会导致随后的生物反应差异？

为了解决这些问题，我们对神经分泌细胞和神经元中TrkA和TrkB的后细胞命运（降解和再循环）进行了分析。我们已经确定，与TrkB不同，TrkA以配体依赖的方式有效回收，而向回收途径的转运需要在相邻膜区中有一个特定的序列，而TrkB中没有这个序列，回收效率较低。这些观察结果为这两种神经营养素受体之间的差异生物反应性是如何通过对不同膜途径的内吞后分类来确定的提供了证据。

材料和方法

试剂和抗体

小鼠NGF来自Harlan Bioproducts for Science（印第安纳波利斯），人类重组BDNF来自PeproTech（新泽西州罗基山）。抗-FLAG抗体来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）（单克隆、M1和多克隆），抗Trk抗体（B-3）来自Santa Cruz Biotechnology（加利福尼亚州圣克鲁斯）。溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）单克隆抗体是从发育研究杂交瘤数据库（衣阿华大学，衣阿华市，IA）获得的。抗-Alexa-488和荧光转铁蛋白来自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。荧光二级抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories（宾夕法尼亚州西格罗夫）。限制性内切酶购自MBI Fermentas（Hanover，MD）Pfu公司Turbo DNA来自Stratagene（加利福尼亚州La Jolla）。所有其他化合物均来自Sigma-Aldrich。

质粒构建体

大鼠TrkA和TrkB cDNA通过以下方法亚克隆到pCDNA3.1新表达载体（Invitrogen）中生态RI和生态RV场地。将Jeffrey Segall博士（纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院）提供的大鼠表皮生长因子受体（EGFR）cDNA亚克隆到pCDNA3.1质粒中后面的III和Xho公司I站点。通过PCR将氨基末端FLAG表位标签添加到受体酪氨酸激酶的5′端。Shc结合位点的TrkA突变体FLAG-TrkA-N487A、FlagTrkA-Y490A和激酶死亡突变体FLAG-TrkA-K538A通过定点诱变制备。所有TrkA缺失结构和TrkA、TrkB嵌合结构均通过两步PCR产生。所有构建物均通过DNA序列确认，以排除潜在的PCR-引入突变。

荧光比率显微镜分析Trk受体的循环

为了量化单个细胞去除配体后观察到的再循环程度，对以前的受体再循环方法进行了改进(Tanowitz和von Zastrow，2003年;Vargas和von Zastrow，2004年)是设计出来的。瞬时转染细胞或稳定表达Trk或表皮生长因子（EGF）受体的细胞生长在玻璃盖玻片上，并与Alexa-488结合的M1抗FLAG抗体（使用Alexa-Fluro-488的标准方法制备N个-羟基琥珀酰亚胺酯；Invitrogen）选择性标记实验开始时存在于质膜中的FLAG标记受体。然后在NGF、BDNF或EGF的存在下培养细胞（37°C下培养30分钟），以促进细胞内化。培养结束后，细胞在缺乏钙的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中快速清洗三次2+或镁2+并补充1 mM EDTA，以分离与残留在质膜中的残余表面受体结合的FLAG抗体，从而使抗体仅与受体的内化池结合。然后在Cy3-抗鼠剂存在下培养EDTA剥离的细胞（37°C下培养45分钟），以标记返回细胞表面的所有受体，然后用4%多聚甲醛固定细胞。在每个实验中，对于每个检测的受体结构，都包括两个平行的对照盖玻片，其中一个盖玻片在没有配体的情况下培养30分钟后固定细胞，并且没有EDTA剥离步骤（100%表面受体对照），其中一个细胞在EDTA介导的剥离步骤后立即固定（0%回收对照）。通过使用适当的过滤装置选择性检测Alexa-488或Cy3，通过外荧光显微镜对细胞进行检查，并使用MetaMorph软件（加利福尼亚州桑尼维尔的Molecular Devices）整合单个细胞中每个荧光的染色强度。该分析表明，EDTA条带的效率（相对于100%表面受体对照，0%循环对照中Cy3染色强度的降低）大于95%，与之前使用荧光流式细胞术的测量结果一致。然后根据以下公式，从对照条件下确定的红/绿比率计算配体洗脱后在单个细胞中回收的受体的百分比：(E类-Z轴)/(C类-Z轴)×100，其中E类是试验覆滑的平均比率，Z轴是零表面控制的平均比率，以及C类是100%表面控制的平均比率。在每次实验中，以这种方式随机分析20到30个细胞/结构/条件，并在结果表示五个独立实验得出的平均回收率。

荧光流式细胞术

使用稳定转染细胞的荧光流式细胞术评估表位标记受体的内部化和再循环，以测量用Alexa-488结合M1抗体进行表面标记后质膜中存在的FLAG标记受体相对数量的变化，如前所述(量规等., 2001). 使用FACScan仪器（BD Biosciences，San Jose，CA）进行荧光流式细胞术。为每个样品收集细胞（20000）。在每次实验中，针对每个条件分析三种样品。平均每个实验（n=5个实验）的平均荧光值，并计算所有实验的SEM。

表面生物素化和受体蛋白水解分析

如前所述，细胞表面生物素化用于特异性检测质膜中的受体并测量其蛋白水解(拉贾戈帕尔等., 2004). 简言之，用冰冷的PBS洗涤两次稳定转染的表达FLAG标记受体的PC12细胞，并用300μg/ml磺基孵育-N个-羟基琥珀酰亚胺-生物素（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）在4°C的PBS中放置30分钟，以使表面蛋白质生物素化。未反应的生物素被淬灭并用Tris缓冲盐水去除。然后将生物素化细胞转移到含有配体的预加热培养基中指定时间，然后立即在冰上冷冻细胞并在提取缓冲液中溶解[1.0%（vol/vol）]Triton X-100、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、120 mM NaCl、25 mM KCl、1μg/ml亮氨酸肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制素、2μg/ml抑肽酶和0.5 mM苯甲基磺酰氟]。通过离心（12000×克然后通过将生物素化蛋白固定在链霉亲和素结合的Sepharose珠（英国白金汉郡Little Chalfont的GE Healthcare）和含有0.5%Triton X-100的PBS中，从细胞提取物中分离出生物素化蛋白质。用SDS样品缓冲液洗脱洗脱水珠，用SDS-PAGE对洗脱的蛋白质进行分离。

PC12细胞培养、免疫沉淀和免疫印迹

将稳定过度表达FLAG-TrkA或FLAG-Trk B受体的PC12细胞保存在含有10%胎牛血清（Invitrogen）、5%马血清（Invirogen）、补充100 U/ml青霉素-链霉素（Invit罗gen）和2 mM谷氨酰胺+200μg/ml潮霉素（Invitro）的DMEM（Invitrongen）中。如前所述，收集裂解液或条件培养基并通过Western blot分析(Lee和Chao，2001年). 对于密度分析，扫描免疫反应带，并使用NIH图像（Scion，Frederick，MD）量化强度。

皮层细胞培养

如前所述，从定时妊娠的Harlan Sprague-Dawley大鼠中制备胚胎第18天大鼠皮质神经元的分离原代培养物(陈等., 2004). 胎儿在无菌条件下取出，保存在PBS中的冰上，用于大脑皮层的显微解剖。切除脑膜，将组织置于基底神经介质（Invitrogen）中。用细镊子将组织切碎，然后用火焰抛光的巴斯德吸管研磨。计数细胞并将其放置在涂有0.01 mg/ml聚乙烯的培养孔上-d日-赖氨酸在含有B27补充剂的神经基础培养基中过夜（Invitrogen）和我-谷氨酰胺（0.5 mM）（Invitrogen）。如前所述，通过电穿孔（德国科隆Amaxa）将FLAG-Trk受体构建物转染初级皮层神经元(格雷希等., 2004)，并在电镀后4d进行实验。

免疫细胞化学染色和荧光显微镜

PC12细胞或皮层神经元生长在玻璃盖玻片上（纽约州科宁市科宁玻璃制品厂），盖玻片涂有聚乙烯-我-赖氨酸（Sigma-Aldrich），并转染表位标记的神经营养素构建物。转染后48小时，用4%多聚甲醛溶液将细胞固定在PBS中，用冷乙醇短暂处理（5分钟）使其渗透，然后用PBS冲洗三次。用5%的山羊血清在PBS中封闭细胞30分钟。用一级抗体培养标本，然后用亚型特异性荧光二级抗体培养。通过使用安装在配备有电动Z驱动器和100×，1.4数值孔径物镜或60×1.4数值孔径目镜和标准异硫氰酸荧光素-Texas红色二向色滤光片组。使用LSM510显微镜（德国奥伯克郡卡尔蔡司）对皮层神经元标本进行共焦荧光显微镜观察，该显微镜配备蔡司63×1.4数字孔径物镜，带有标准滤光片组和标准针孔（1个Airy圆盘）。

结果

因为以前的研究表明TrkA和TrkB受体具有潜在的差异信号和生物反应(卡特等., 1995;索末菲等., 2000;Thoenen，2001年)特别是在长期使用各自的配体（NGF或BDNF）治疗的情况下，我们试图确定配体治疗后受体的贩运命运是否存在差异。首先，以前已经证实，TrkA和TrkB受体在PC12细胞等细胞系以及原代神经元培养物中通过溶酶体以配体依赖的方式降解(克努塞尔等., 1997;索末菲等., 2000; 朱利安等.,2002,2003). 虽然之前已经假设了降解动力学的改变来解释差异信号反应(克努塞尔等., 1997;索末菲等., 2000;卡特等., 2002)，尚未直接确定。为了检测这两种受体是否有不同的降解，我们直接比较了稳定过度表达FLAG-tagged TrkA或TrkB的PC12细胞中Trk受体的配体依赖性降解率。特别是，使用了稳定过度表达FLAG-TrkA或FLAG-Trk B受体的PC12细胞，这些细胞具有同等水平的表面FLAG-Trk受体(图1，A和B). 我们在生物素化分析的基础上进行了降解分析，生物素化测试以前用于监测各种信号受体的降解(曹国伟和冯·扎斯特罗，2000年;朱利安等., 2002;Tanowitz和von Zastrow，2002年). 生物素化后，用配体（NGF或BDNF）处理PC12细胞不同时间段（1、2、3、4或5 h），用链霉亲和素珠溶解、拉下，并免疫印迹Trk抗体，以评估内吞Trk受体的蛋白水解。Trk抗体的免疫印迹显示TrkA的降解速度明显慢于TrkB(图1，A和B). TrkA降解的速度（超过一半的生物素化池降解时间>1小时）与之前在PC12稳定过度表达TrkA的研究中报告的数量相似（朱利安等.,2002,2003). 为了独立检测TrkA降解率的降低是否代表TrkA对溶酶体降解靶向性的降低，我们使用共焦显微镜观察了内化Trk受体相对于晚期内体/溶酶体标记LAMP1的定位(图1C). 与NGF治疗后的TrkA相比，BDNF治疗后75分钟内，使用LAMP1对TrkB进行更广泛的定位(图1C). 这些结果与生化降解研究一致(图1，A和B)其表明在添加配体1小时后TrkB的降解大于TrkA的降解，并且表明更快速的TrkB降解是由于增加了对晚期内体/溶酶体的靶向。

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Trk受体表现出不同的配体诱导的向降解途径的转运。稳定表达FLAG标记的TrkA（A）或TrkB（B）的PC12细胞表面生物素化，并在没有或存在50 ng/ml配体（A为NGF，B为BDNF）的情况下在37℃孵育指定时间。通过链霉亲和素下拉和抗Trk免疫印迹检测表面标记受体。TrkA和TrkB表达细胞的代表性抗Trk免疫印迹显示。（C） 与LAMP1相关的TrkA和TrkB受体在37°C下孵育75分钟后固定的PC12细胞中的共聚焦显微镜下可见。

我们假设降解率的差异可能是由于添加配体后某些步骤TrkA和TrkB受体运输的改变，即1）在初始内化步骤和/或2）在后内吞步骤，在后内吞步骤中Trk受体可以被分类为降解或再循环途径。为了解决与Trk内吞途径相关的这些问题，我们利用了TrkA和TrkB受体氨基末端FLAG表位标记版本的新特性，其中钙敏感荧光抗FLAG抗体可以与PBS/EDTA快速分离。这种可分离的FLAG系统已被广泛用于研究G蛋白偶联受体（GPCR）的内吞运输(量规等., 2001;Tanowitz和von Zastrow，2003年;Vargas和von Zastrow，2004年)尤其是这些受体的内化率以及再循环和降解。由于这些抗体与Trk受体的胞外区域结合，我们首先通过Western blot分析（补充图1）确定抗体的添加本身并没有诱导Trk受体自动激活，也没有通过免疫荧光显微镜在没有配体的情况下诱导受体内化(图4).

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PC12细胞中配体依赖性Trk受体循环的测定。（A） 将表达FLAG-tagged TrkA或TrkB的细胞与荧光（Alexa-488）抗FLAG抗体在37℃孵育15分钟，然后与50 ng/ml配体（TrkA的NGF、TrkB中的BDNF和EGFR的EGF）在37℃培养30分钟。然后，用EDTA剥离非内部化荧光抗FLAG的抗体，细胞在Cy3抗小鼠存在下37°C孵育45分钟后固定。（B） PC12细胞实验的代表性图像。对照条件是在没有配体且没有EDTA剥离步骤的情况下，将平行盖玻片培养30分钟。剥离条件是一个平行的盖玻片，在EDTA介导的剥离步骤后，细胞立即固定在盖玻片中。（C） 回收行为的量化如所述材料和方法，误差条代表五个独立实验的SEM。

为了确定TrkA和TrkB受体内化的初始速率是否不同，如前所述，在存在和不存在配体的情况下，对稳定表达各自FLAG-Trk受体的PC12细胞进行荧光流式细胞术(基思等., 1998). 与之前的生物素化测定不同，在生物素化测定中，受体在添加配体之前被标记(图1)，首先在37°C下用配体（NGF或BDNF）处理细胞不同时间段，然后冷却至4°C，并添加Alexa-488结合的FLAG抗体1 h。然后通过流式细胞仪对细胞进行荧光定量。以这种方式，与之前的生物素化试验不同，该试验监测配体处理后一组标记受体的降解命运(图1)这一分析是对受体内在化的一种量度。TrkA和TrkB在配体存在下迅速内化(图2B)，并计算内化半衰期（TrkAt吨1/2=5±1分钟和TrkBt吨1/2=5±1分钟）。TrkA和TrkB内化的初始速率没有观察到显著差异(图2B).

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Trk受体表现出类似的配体诱导内化率。（A） 内化测定示意图。稳定表达FLAG-tagged TrkA或TrkB的PC12细胞在37°C下孵育0、5、10、20、30或60分钟，存在或不存在50 ng/ml配体（NGF代表TrkA，BDNF代表TrkB），然后在4°C下用荧光标记的抗FLAG抗体孵育1小时。然后通过流式细胞术测定表面免疫荧光，对细胞进行受体的配体依赖性（B）和配体依赖型（C）内化分析。方形，TrkA；圆圈，TrkB。

为了确定Trk受体再循环的初始速率，我们使用了之前用于确定TGN38质膜再循环的活细胞分析(高希等., 1998)和甘露糖6-磷酸受体(林等., 2004). 将稳定表达FLAG-TrkA或FLAG-Trk B的细胞与Alexa-488结合的FLAG抗体在37℃孵育10分钟，然后在37℃添加配体（NGF或BDNF）30分钟，然后用1 mM EDTA孵育30秒剥离残留的表面FLAG抗体。然后用抗Alexa-488抗体固定或追踪细胞5-60分钟，该抗体已被确定能以约92%的效率灭活细胞(林等., 2004)在追逐媒体上。如果荧光内化受体被回收利用，当其返回到质膜时，它将被抗Alexa-488抗体猝灭。我们观察到追逐过程中细胞相关荧光迅速消失(图3A). 2分钟追踪后，在胞内结构中可以看到荧光Trk受体。然而，追踪20分钟后，细胞相关荧光显著减弱(图3，A和B). 荧光损失率被用作受体再循环率的测量。从这些实验中，我们计算出TrkA和TrkB最初的回收半衰期均为～7分钟。然而，我们注意到，在稳态条件下，例如45分钟后，与TrkA相比，TrkB荧光更多，这表明尽管TrkB回收的初始速率与TrkB相似，但在稳态下，TrkB可分为一种替代的内吞途径，即降解途径。与这一发现一致的是，在这些稳态时间点，与共聚焦显微镜测定的TrkB相比，TrkA与转铁蛋白受体的共定位明显更多(图3C). 综上所述，这些结果表明TrkA主要通过循环途径进行分类，这与其配体依赖性降解速率的降低相一致(图1A).

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配体依赖性Trk受体再循环率的测定。（A） 稳定表达FLAG-tagged TrkA或TrkB的PC12细胞与荧光（Alexa-488）抗FLAG抗体（2μg/ml）在37℃孵育15分钟，然后与50 ng/ml配体（NGF代表TrkA，BDNF代表TrkB）在37°C孵育30分钟。然后，用EDTA剥离非内部化荧光抗FLAG的抗体，和细胞在固定前在10μg/ml抗Alexa-488抗体存在下孵育指定时间。为了获得零分钟时间点，在EDTA剥离步骤之后固定细胞。宽视野显微镜检测到未猝灭荧光。每个细胞的相对荧光强度是与抗Alexa-488孵育时间的函数。虚线表示免疫荧光强度/细胞的稳态水平。方形，TrkA；圆圈，TrkB。（B） 该实验的代表性图像显示，Alexa-488在使用抗Alexa-4880或45分钟后出现荧光，或在不使用抗Alexa-488的情况下进行45分钟追逐。（C） 共焦显微镜下观察与转铁蛋白受体相关的内化TrkA和TrkB受体的染色。稳定表达FLAG-tagged TrkA或TrkB的PC12细胞与荧光（Alexa-488）抗FLAG抗体在37℃孵育15分钟，然后与50 ng/ml配体（TrkA为NGF，TrkB为BDNF）和荧光转铁蛋白（罗丹明转铁蛋白）在37℃孵化15分钟。用PBS/EDTA剥离非内部荧光化的抗FLAG抗体。细胞在37°C的罗丹明转铁蛋白存在下重新培养，固定30分钟，并通过共焦显微镜成像。显示了具有代表性的显微照片。内化Trk和转铁蛋白受体之间的共定位比例表示为四个独立实验分析得出的平均值±SEM(*代表p<0.01，学生t吨测试）。

为了进一步研究稳态TrkA和TrkB细胞后循环的潜在差异，我们改进了一种基于活细胞比率荧光的分析方法，该方法以前用于定量GPCR循环(Tanowitz和von Zastrow，2003年;Vargas和von Zastrow，2004年). 该测定是上述活细胞测定的变体(图3)其中受体内化池用荧光抗FLAG单克隆抗体特异性标记，内部受体池的再循环通过荧光抗小鼠二级抗体的表面可及性检测(图4A). 根据回收时间进程选择了45分钟的时间点(图3)作为稳态循环的一种测量方法，与之前版本的GPCR循环试验一致(Tanowitz和von Zastrow，2003年;Vargas和von Zastrow，2004年). 与之前的比例回收分析相比，主要的变化是，在整个分析的回收阶段，次级抗体（Cy3-抗鼠）都在培养基中(图4A). 这种修改确保了即使Trk受体在一轮循环后再次重新启动，它仍将被测量为“循环”。通过比较Trk受体循环和EGFR的循环，验证了比率分析，一种受体酪氨酸激酶，在配体依赖性激活后不能有效再循环，主要被分类为降解途径(Sorkin和von Zastrow，2002年;马摩尔和雅顿，2004年). 与之前的研究一致，如弱细胞相关荧光所示，45分钟后观察到最小EGFR再循环(图4B，底部）。相反，在相同条件下，TrkA观察到强烈信号(图4B，顶部）。令人惊讶的是，TrkB的荧光信号明显弱于TrkA(图4B，中间）。然而，TrkB-相关荧光仍然大于EGFR相关荧光。通过比率分析对这些结果进行量化（参见材料和方法)证实TrkA以配体依赖的方式回收显著（71±1%），而TrkB回收程度降低（39±1%）(图4C). 此外，正如预测的那样，EGFR的再循环程度大大降低（22±1%）(图4C)与主要分类为降解途径的受体一致(Tanowitz和von Zastrow，2003年).

为了确定在原代神经元中是否观察到TrkA和TrkB受体内吞运输的这种意外差异，我们评估了表达这些受体的FLAG标记版本的皮层神经元中的Trk再循环。我们选择了皮层神经元，因为它们已经被确定在内源性表达TrkA（尽管水平较低）和TrkB受体(皮佐鲁索等., 1999;皮特斯和米勒，2000年;Huang和Reichardt，2001年;罗西等., 2002). 我们确定，与PC12细胞一样，TrkA在皮层神经元中表现出显著的配体依赖性再循环（61±2%）(图5，A和C). 相反，在配体添加后，TrkB受体的再循环最少（28±3%），甚至比PC12细胞中观察到的还要少(图5，A和C). 因此，这些观察结果提供了强有力的证据，证明TrkA和TrkB在添加配体后穿过不同的内吞途径，不仅在细胞系中，而且在自然表达两种形式的Trk受体的原代神经元中。

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皮层神经元中配体依赖性Trk受体循环的测定。（A） 中描述的回收实验的代表性图像图4初级皮质神经元表达FLAG标记的TrkA受体。（B） 该实验中，初级皮层神经元表达FLAG-tagged TrkB受体的典型图像。（C） A和B中回收的定量，如所述材料和方法，误差条表示五个独立实验的SEM。

然后使用比率回收分析来确定TrkA受体中的潜在区域，与TrkB相比，这些区域是增强配体依赖性再循环到质膜所必需的。我们生成了嵌合体，其中不同的TrkA结构域（细胞外、膜旁、激酶和C末端）被替换为相应的TrkB结构域(图5A). 我们假设，通过监测嵌合体中回收行为的增加，我们可以确定足够的起到自主内吞再循环信号的作用。在PC12细胞中，我们观察到只有TrkA旁膜区替换为TrkB（TrkB日本航空公司)导致回收量显著增加，达到与野生型（WT）TrkA相当的水平（65±2%）(图6A). 其他TrkA结构域的互换对TrkB嵌合体的回收行为没有影响。这些观察结果表明，80-aa TrkA并列膜区包含的结构元素足以实现配体依赖性Trk受体的最佳再循环，因为它能够移植到另一个Trk受体以增加再循环。

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TrkA中负责配体依赖性受体再循环的序列的鉴定。（A） 用含有TrkA相应区域的TrkB嵌合体转染PC12细胞。（TrkB欧洲中央银行，TrkA胞外；TrkB公司tmA（tmA），TrkA跨膜；TrkB公司日本航空公司，TrkA juxtamembrane；TrkB公司特卡，TrkA酪氨酸激酶；和TrkBctA公司，TrkA羧基末端）。TrkA和TrkB也作为对照转染。在这些细胞中测量了稳定的配体依赖性再循环，如图4（B）用缺乏以下细胞内区域的TrkA构建物转染PC12细胞：羧基末端，TrkAΔCT；酪氨酸激酶，TrkAΔTK；在这些细胞中测量了并列膜、TrkAΔJM以及并列膜区的较小亚区（TrkA△Box1-3）和稳态配体依赖性再循环，如图4（C）用含有酪氨酸激酶区（K546A）和膜旁区（N496A和Y499A）点突变的TrkA构建物转染PC12细胞，并按照图4在所有实验中，误差条表示五个独立实验的SEM。(*代表p<0.01，学生t吨测试）。

接下来，我们试图确定juxtamembrane域是否必要的用于配体依赖的TrkA回收。为了解决这个问题，从TrkA中删除了包括近膜区在内的各种域，并对回收进行了评估。与野生型受体相比，只有缺乏膜旁结构域的TrkA突变体（TrkAΔJM）的回收率显著降低（对照，70±2%；TrkA△JM，25±3%）(图6B). 为了更准确地定义高效TrkA回收所需的并列膜区域，我们将80-aa JM域划分为三个框：框1（aa 444-472）、框2（aa 473-493）和框3（aa 502-512）。所有突变体中都保留了氨基酸494-501，因为其中有一组关键的残基（N496、Y499），这些残基是Shc结合和Trk信号传导所必需的(拉米内特等., 1996). 删除方框1对TrkA回收没有影响(图6B). 相反，Box2的缺失导致TrkA再循环受到抑制，与TrkAΔJM观察到的情况类似（TrkA△Box2，28±2%）(图6B). 此外，删除方框3对TrkA循环的抑制程度低于删除方框2（TrkAΔBox3，44±3%）(图6B). 方框3的替代TrkA删除包括aa 494-501（TrkAΔBox3′），产生了与TrkA△Box3类似的回收水平（我们未公布的数据）。TrkAΔBox3研究的结果表明，该区域（aa 502-512）有助于TrkA受体的最佳再循环，尽管其程度低于Box2（aa 473-493）。对于所有这些TrkA膜旁突变体，受体的表面靶向性或初始内吞率没有改变（我们未发表的数据）。这些观察结果表明，TrkA的JM区域是配体依赖性再循环所必需的，其中的一个离散区域（aa 473-493）是内吞后TrkA再循环的必要元素。

更直接地评估Shc结合（N496和Y499）和Trk信号传导所需的残基(拉米内特等., 1996)受Trk循环影响，这些残基中的每一个都被点突变为丙氨酸。与TrkA WT对照组相比，两个点突变株（N496A和Y499A）没有改变再循环(图6C). 这一结果与随后的发现一致，即通过两个缺乏整个激酶结构域（TrkAΔTK）或为消除激酶活性而建立的激酶结构域中的点突变（K546A）的突变TrkA受体评估的激酶活性，在配体诱导的内吞作用后，不会减少TrkA的再循环(图6、B和C). 这些结果指出了一个意外的观察结果，即通过配体加成的内吞作用后，受体的再循环操作不需要TrkA激酶活性。应该注意的是，在缺乏配体的情况下，存在最小的内吞作用(图4)和最小可检测TrkA回收(图4A)表明TrkA循环依赖于配体，但不依赖于激酶。

为了进一步研究TrkA中的回收信号是否起到指定转运到回收而非降解途径的作用，我们通过表面生物素化实验评估了缺乏Box2（TrkAΔBox2）的TrkA突变体的配体诱导降解动力学。我们观察到ΔBox2的受体降解显著增强，半衰期类似于TrkB(图7A). 接下来我们研究了将这个TrkA-JM结构域移植到TrkB的类似区域是否会影响TrkB溶酶体的运输。我们之前已经确定这个TrkB突变体（TrkB日本航空公司)与野生型TrkB相比，具有增强的配体依赖性再循环(图6A). 目前的实验是对TrkA JM是否调节Trk内吞分选活性的更严格测试，因为它要求受体通过多轮内吞并在配体持续存在的情况下有效再循环，而不是在再循环阶段将配体洗掉的再循环试验。在我们的表面生物素化降解试验中，如前所述，TrkB在1.5小时后被显著蛋白水解(图7B). 相反，配体诱导的TrkB蛋白水解日本航空公司被显著抑制(图7B). 这个TrkB突变体的降解速率现在与野生型TrkA的降解速率相似。这些观察结果表明，TrkA-JM信号足以促进Trk受体的快速配体依赖性再循环，并强烈抑制细胞后降解。因此，这种再循环信号作为区分神经营养素受体亚型TrkA和TrkB的内吞运输的主要决定因素。

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Trk受体突变体表现出不同的配体诱导的向降解途径的转运。将稳定表达TrkA（A）和TrkB（B）突变体的PC12细胞表面生物素化，并在没有或存在50 ng/ml配体（A为NGF，B为BDNF）的情况下在37°C孵育指定时间。通过链霉亲和素下拉和抗Trk免疫印迹检测表面标记受体。TrkA和TrkB表达细胞的代表性抗Trk免疫印迹显示。

为了确定这种“再循环”信号是否影响Trk受体的生物反应，我们评估了细胞内信号和细胞存活率。NGF对TrkA的刺激和BDNF对TrkB的刺激都通过启动信号级联，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3激酶），提高了各种细胞系和原代神经元培养物的存活率(卡普兰和米勒，2000年;赵，2003). 相反，也有研究表明，长期治疗这两种神经营养素会导致不同的信号反应(卡特等., 1995;克努塞尔等., 1997;索末菲等., 2000). 为了解决在我们的研究中观察到的Trk受体内吞运输命运（再循环或降解）的差异是否也会导致不同的生物反应，我们进行了一系列实验，以解决TrkA增强的再循环行为是否会导致PC12细胞中信号增强和随后的存活。我们采用了一种既定的模式，即延长血清提取时间（8 h），然后延长神经营养素治疗时间（24 h），以评估稳定表达TrkA或TrkB的PC12细胞的神经营养素依赖性存活率。我们进行了三组实验。首先，我们通过表面生物素化和亲和素下拉来测定长期使用相应神经营养素（NGF或BDNF）治疗前后的表面Trk受体水平(图8A). 我们观察到在配体处理之前，所有形式的Trk都在细胞表面平等表达(图8A). 然后，我们观察到，用NGF处理24小时后，我们仍然可以检测到显著的细胞表面野生型TrkA，但用BDNF处理24小时之后，我们无法检测到任何细胞表面野生类型TrkB(图8B). 缺乏内吞再循环所需JM区域部分的TrkA突变体的细胞表面水平（TrkAΔBox2）(图8B)用NGF治疗24小时后未检测到。相反，含有TrkA JM（TrkB）的细胞表面TrkB突变体日本航空公司)加强了TrkB回收(图6A)，在BDNF处理24小时后检测到(图8B). 总之，这些观察结果与之前的观察结果一致，即在NGF的持续存在下，TrkAΔBox2的降解速度比野生型TrkA更快(图7A)以及在BDNF、TrkB的持续存在下日本航空公司降解程度低于野生型TrkB(图7B).

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延长神经营养素治疗对Trk依赖生存的影响。稳定表达TrkA或TrkB突变体的PC12细胞在血清中饥饿8 h，然后表面生物素化（A和B），并在37°C下与50 ng/ml配体（NGF用于TrkA，BDNF用于TrkB）孵育24 h。表面标记受体通过链霉亲和素下拉法检测，然后进行抗-Trk免疫印迹。通过Trk免疫沉淀法和抗Trk免疫印迹法检测总受体。TrkA和TrkB表达细胞的代表性抗Trk免疫印迹显示。（C） 将稳定表达TrkA或TrkB突变体的天然PC12细胞（WT）或PC12细胞血清饥饿8 h，然后在37°C下孵育5 min或24 h，孵育中加入或不加入50 ng/ml配体（TrkA为NGF，TrkB为BDNF）。通过免疫印迹法测定磷酸化标记、Trk、磷酸化Akt和Akt的水平。（D） 将稳定表达TrkA或TrkB突变体的天然PC12细胞（WT）或PC12细胞血清饥饿8 h，然后在37°C下与50 ng/ml配体（TrkA的NGF和TrkB的BDNF）孵育24 h，固定并处理以进行TUNEL分析。与WT PC12细胞（-NGF）相比，对每种培养条件下TUNEL阳性细胞的比例进行评分。误差条表示三个独立进行的实验的SEM。

其次，我们已经证明Trk受体的细胞表面水平增强，配体依赖性再循环增强，降解减少，我们想确定这是否导致生存信号改变。Trk受体激活的主要生存信号通路是PI3-激酶/Akt(卡普兰和米勒，1997年;赵，2003). 用神经营养素治疗24小时后，稳定表达Trk或Trk突变体的PC12细胞通过磷酸特异性Akt抗体检测PI3激酶/Akt信号。经过长时间的神经营养素治疗，野生型TrkA表达细胞仍具有显著水平的磷酸化Akt，而野生型TrkB表达细胞中未检测到磷酸化Ak(图8C). 此外，表达TrkAΔBox2的细胞没有任何可检测到的磷酸化Akt，而表达TrkB的细胞日本航空公司具有与野生型TrkA类似的磷酸化Akt水平(图8C). 总之，这些观察结果与之前的研究结果一致，即在长期神经营养素治疗后，定位于细胞表面的Trk受体(图8B)将能够继续激发生存信号。

第三，为了评估配体治疗后TrkA和TrkB差异定位的功能后果，我们对这些含有Trk受体的PC12细胞进行了细胞存活分析，其中细胞在无血清培养基中培养8小时，然后进行24小时神经营养素治疗。在缺乏任何神经营养素的情况下，通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记（TUNEL）检测评估，在此时间段内维持在无血清培养基中的PC12细胞（WT）发生显著的细胞死亡(图8、D和E). NGF处理导致天然PC12细胞和TrkA过度表达细胞显著存活。相反，BDNF治疗无法将TrkB过度表达细胞的细胞存活维持在与NGF相同的水平。与表达TrkA的PC12细胞相比，表达TrkB的PC12中TUNEL阳性细胞显著增加(图8、D和E). 这一观察结果与长期BDNF治疗后，细胞表面TrkB和PI3激酶/Akt信号显著降低的发现一致。在表达突变TrkA（TrkAΔBox2）且循环受损的PC12细胞中(图6B)与野生型TrkA细胞相比，TUNEL阳性细胞显著增加。相反，含有突变TrkB（TrkB日本航空公司)加强回收利用(图6A)与表达野生型TrkA的细胞相比，长期BDNF处理的细胞死亡率最低(图8E). 总之，这些观察提供了进一步的证据，证明Trk受体的内吞命运不仅与随后的下游信号事件有关，还与细胞存活等生物反应有关。

讨论

信号受体向交替细胞内途径的内分泌运输已被证明会导致不同的生物学后果。在这项研究中，我们证明了两个神经营养素受体（TrkA和TrkB）在与各自的配体（NGF和BDNF）结合后穿越不同的内吞途径。我们提供的直接证据表明，配体处理后，TrkA主要再循环回细胞表面，而TrkB主要通过降解途径进行分类，这有助于改变Trk介导的生物反应。

我们的结果为Trk受体的内吞转运机制提供了一些新的见解。先前使用碘化NGF在分区交感神经元培养中进行的TrkA贩运研究(125I-NGF）注意到的方面125I-NGF贩运表明TrkA受体可能被贩运到再循环途径(Ure和Campenot，1997年;Tsui-Pierchala和Ginty，1999年). 在逆行运输中存在动力学延迟125I-NGF以及少量（～2%）125最终逆行运输的I-NGF-TrkA复合体表明125I-NGF-TrkA复合物被转运到其他内吞途径。以前的研究直接用可裂解生物素化分析检测TrkA贩运，以评估TrkA受体的再循环行为，发现TrkA再循环极少(萨克森那州等., 2005). 然而，在这些生物素化测定中，没有检测到循环到细胞表面并重新内化的TrkA受体。在我们的研究中，使用基于活细胞荧光的再循环分析，我们可以量化以配体依赖方式分类的Trk受体在再循环途径中的比例。TrkA的配体依赖性再循环水平（～70%）相当于以前建立的信号受体，如以配体依赖方式再循环的β肾上腺素能和μ阿片受体(曹等., 1999;Tanowitz和von Zastrow，2003年). 因此，利用我们的比例循环试验，介质中荧光抗鼠抗体的存在使其在检测TrkA循环事件时具有更高的灵敏度，并使新发现TrkA受体主要在配体处理后循环。此外，在同一项研究中，发现TrkA与转铁蛋白受体的共定位最小(萨克森那州等., 2005)与我们观察到的内吞TrkA与转铁蛋白受体显著重叠形成对照(图3C). 这两项研究的主要区别在于之前的研究(萨克森那州等., 2005)评估了总TrkA受体与转铁蛋白受体的共定位，而在本研究中，通过FLAG表位的细胞表面免疫荧光标记选择性地观察了内吞的TrkA受体。

此外，通过该分析，我们能够确定TrkA受体有效循环到质膜需要TrkA细胞质旁膜区域中的一个独特序列（aa 473-493），该序列在TrkB的相应区域或循环GCPR中识别的循环信号中未发现(曹等., 1999;Tanowitz和von Zastrow，2003年;Vargas和von Zastrow，2004年). 这个TrkA回收信号对TrkA的有效回收都是必要的(图6B)并且足以促进主要降解的TrkB的快速回收(图6A). 在此背景下，先前的一项研究将TrkA膜区移植到TrkB受体中，并评估了用BDNF处理HN10细胞24小时后TrkB的受体降解情况(索末菲等., 2000). 在其降解试验的密度分析中，该研究还观察到含有TrkA旁膜区的TrkB嵌合受体降解减少了>50%(索末菲等., 2000). 之前的发现与我们观察到的TrkB一致日本航空公司在5-h降解试验中，受体降解显著延迟(图7B).

其次，以前对受体酪氨酸激酶（即EGF受体）的转运研究主要集中于共价修饰，如泛素化，作为直接转运到溶酶体的分选信号(马摩尔和雅顿，2004年). 相反，当这些分类信号被破坏时，EGF受体向再循环途径的转运可能默认发生(巴斯特等., 2000;主教等., 2002)或在缺乏配体的情况下(费尔德等., 1990). 相反，我们提出的证据表明，被分类到回收途径的活化的TrkA受体需要在膜旁区域产生特定的回收信号，而这种信号的去除会导致TrkA受体的降解增强(图7A). 因此，TrkA受体是受体酪氨酸激酶的一个例子，它主要以信号依赖的方式再循环，并可能代表调节神经营养素受体的胞后运输的独特性质。

第三，通过证明TrkA和TrkB分属于不同的内吞途径，我们提供了一种可能的机制来解释延长NGF或BDNF治疗的差异反应(卡特等., 1995;索末菲等., 2000). 与之前的研究一致，神经细胞和细胞系中长期使用NGF会导致持续的TrkA依赖性信号传导，这与NGF激活一个可经历多次循环的受体相一致(图8). 相反，长期暴露于BDNF导致TrkB受体的反应性降低，这与主要分类到降解途径的受体相一致，并显示出随着配体处理时间的延长反应性降低(卡特等., 1995;索末菲等., 2000). 我们通过提供主要循环的Trk受体（TrkA或TrkB日本航空公司)与主要按降解途径分类的Trk受体（TrkB和TrkAΔBox2）相比，它们还能够增强营养反应(图8). 这些发现表明，调节再循环途径中Trk受体维持的内吞机制将对生物后果产生重大影响，例如神经元中的Trk依赖性营养反应。在这方面，值得注意的是，TrkA“再循环”信号也可以将TrkB导向再循环途径，并改变其生物信号和功能。

在这种情况下，这些发现可能对临床上使用NGF和BDNF作为治疗剂的努力有启示。在以前的临床试验中，对ALS患者进行长期的BDNF系统治疗，可能是由于TrkB受体的下调，导致BDNF的支持作用受到限制(Thoenen，2001年;Thoenen和Sendtner，2002年). 最近，一项涉及对阿尔茨海默病患者基底前脑进行延长NGF治疗的细胞治疗临床试验证明了其治疗潜力(Tuszynski公司等., 2005). 尽管这些治疗工作的一个主要重点领域主要涉及神经营养配体的药代动力学和递送问题，了解调节Trk受体后细胞命运的分子机制也可能是这些治疗策略临床疗效的重要决定因素。

补充材料

【补充材料】

致谢

我们感谢Mark von Zastrow、Frederick Maxfield和Pilar Perez的有益讨论。本研究得到了国家卫生研究院拨款MH-068850（致F.S.L.）、全国精神分裂症和抑郁症研究联盟（致F.S.L.和Z.-Y.C.）、中华人民共和国国家优秀博士论文作者基金会（编号200229）（致Z.-Y.C.）的支持，上海市冉冉升起的明星计划05QMH1401（致Z.-Y.C.）、国家自然科学基金项目30000048（致Z.-Y.C）。

笔记

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E05-07-0651)2005年10月5日。

缩写词：BDNF，脑源性神经营养因子；表皮生长因子受体；GPCR，G蛋白偶联受体；溶酶体相关膜蛋白1；神经生长因子；Trk，原肌球蛋白相关激酶。

D⃞本文的在线版本包含补充材料，网址为MBC在线(http://www.molbiolcell.org).

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会