体内利用双链断裂诱导同源重组筛选工程化归巢核酸内切酶
CELLECTIS S.A.,法国罗曼维尔Noisy路102号,邮编:93235
2005年9月5日收到;2005年10月21日修订;2005年10月21日接受。
版权©作者2005。牛津大学出版社出版。保留所有权利 本文的在线版本是在开放存取模式下发布的。用户有权出于非商业目的使用、复制、传播或展示本文的开放存取版本,但前提是:原创作者是正确且完全归属的;《华尔街日报》和牛津大学出版社被认为是原始出版地,并提供了正确的引用细节;如果一篇文章随后不是全部复制或传播,而是部分复制或作为衍生作品传播,则必须明确指出。如需商业重复使用,请联系gro.slanruojdrofxo@snoissimrep.slanruej
摘要
归巢内切酶是一种能够识别长DNA序列的内切酶,已被证明是精确和高效基因组工程的首选工具。因此,设计具有定制特异性的新型内切酶的可能性正在大力研究中。在本报告中,我们提出了一种简单有效的方法,根据其切割特性从变体库中选择巨型核酸酶。该方法的优点是可以直接选择在真核环境中诱导双链断裂诱导同源重组的能力。模型选择表明浓缩程度较高。此外,与噬菌体展示相比,该方法在从突变文库中富集活性突变体方面表现良好。这种方法使探索大序列空间成为可能,从而为基因组工程提供了一种有价值的工具。
简介
使用罕见的双链DNA内切酶(称为巨核酸酶)已成为增强基因靶向性的最成功手段(1),这是一种研究基因功能和纠正遗传缺陷的强大策略。在野外,巨核酸酶主要由归巢核酸内切酶代表,这是一个DNA核酸酶家族,存在于噬菌体、细菌、古菌和各种真核生物中(2–4). 归巢核酸内切酶由自我繁殖的遗传元素编码,通常是内含子或内含子。这些蛋白质识别并切割内含子或无内含子等位基因内的长DNA序列(12–40 bp),留下重组双链DNA断裂(DSB)。通过与内含子或内含子内含子基因的同源重组修复DSB导致内含子插入(归巢)。大核酸酶诱导的基因靶向源于这种自然归巢机制:一种罕见的切割DNA内切酶用于在选定的基因组位点切割靶标,通过同源重组显著增强所需的染色体DNA重排。特别是,使用I-SceI(内含子编码的内切酶I来自酿酒酵母)是最早的归巢核酸内切酶之一(5,6),凭借其同源归宿站点,它已迅速成为一种标准策略(7–17). 然而,应用仍然局限于天然归巢核酸内切酶位点最初引入染色体靶位点的情况。当这种工程步骤不实用或根本不需要时,DSB诱导的基因靶向需要一种专用的切割剂,必须进行定制工程。
人们正在努力寻找、设计或设计具有所需切割特异性的新内切酶。一个成功的例子是Cys2–His2型锌指蛋白(ZFP)与FokI核酸酶的催化域融合,以生成功能性序列特异性内切酶(18,19). 噬菌体显示选择和从头开始该设计已用于选择一组锌指,能够瞄准(G/a/C)NN三元组,这些锌指可以组合起来瞄准感兴趣的位置(20–23). 然而,保持非常窄的特异性是基因组工程应用的主要问题之一,目前尚不清楚ZFP是否能满足许多应用的非常严格的要求。
另一种获得定制巨核核酸酶的方法是通过分子工程改变天然归巢核酸酶的特异性。为了实现这一目标,几个团队已经采取了几种方法,包括构建杂交蛋白,以及筛选或选择技术。这些技术基本上是基于细菌基因选择系统,该系统将DNA切割或DNA结合与细胞生存或生长联系起来(24–27).
针对DSB诱导的基因靶向性,我们开发了两种类似的方法来鉴定促进裂解诱导的酵母细胞同源重组的活性内切酶。除了选择染色体DNA重排而不是DNA切割或结合之外,使用真核细胞是我们的方法相对于以前方法的一个优点。第一种方法将内切酶基因和DNA靶点放在不同的复制酵母质粒上,而第二种方法将DNA靶点放置在染色体位点上。虽然两者都报告了重组事件导致标记酶活性的恢复,但它们具有不同的特征和结果。前者允许高通量筛选(HTS),我们已经用它从中分离出大量新的高特异性I-CreI(内含子编码的内切酶I莱茵衣藻)基于meganucleases切割新靶点(28). 新的归巢核酸内切酶集合的产生,以及将其结合的能力,可能会创造出一个大的工程巨型核酸酶目录。然而,当必须定位精确的染色体位点时,可能需要探索大型库,而HTS可能证明是不够的。在这种情况下,使用选择过程将克隆从大型变体库中分离出感兴趣的位点的可能性是无价的。
第二种方法是选择方法。为了测试它选择感兴趣的变体的能力,我们处理了一个基于I-CreI的库(29,30). 该巨核酸酶是归巢内切酶LAGLIDADG家族(四个归巢内切酶家族中最大的一个)中的归巢核酸酶。I-CreI的3D结构(4,31)其定义足以准确识别与同源DNA靶点相互作用的氨基酸残基。因此,可以进行一种半理性方法,目的是只随机化这些相关残留物。为了进一步评估我们的新体内选择方法,我们使用众所周知的噬菌体展示策略进行了类似的选择,这为DNA结合蛋白如锌指提供了巨大的成功(22,32). 我们的结果表明体内选择方法可以在10个5范围,并在输出多样性方面优于噬菌体展示。这种方法应该有助于大核酸酶工程,并为基因组手术提供有价值的工具。
材料和方法
结构分析
所有蛋白质结构的分析都是使用Pymol实现的。I-CreI中的结构对应于pdb条目1g9y。本文中的残基编号始终指的是这些结构,但同型二聚体的第二个I-CreI蛋白结构域的残基除外,其中残基编号设置为第一个结构域。
酵母DNA靶序列
野生型天然I-CreI靶点(命名为C1234:tcaaaacgtgagacattgtgg)和两个24 bp的回文(称为C1221:tcaaaacgtacgacgtttga公司和C4334:ccaactgtctcgagacagttgg公司)在筛选活动中使用了与该靶点的两个半位点的反向重复相对应的标记(我们对靶点的命名基于将天然I-CreI同源DNA靶点描述为六个碱基的四分之四)。构建了三个pGEM-T Easy载体(Promega),构成我们的目标序列。接下来,切除400 bp的PvuII片段并克隆到酵母载体pFL39-ADH-LACURAZ中,如前所述(33). 酵母报告载体转化为面包酵母应变FYBL2-7B(材料a、,ura3Δ851,trp1Δ63,leu2Δ1,lys2Δ202).
酵母中的选择
利用菌株FYC2-6A(MATα,trp1Δ63,leu2Δ1,his3Δ200). 首先,aLYS2型通过修改溶血素2引入两个3240bp的直接重复序列的基因,该重复序列由含有卡那霉素抗性基因的4.3kb盒和目标位点分离,使用含有溶血素2含有5′和3′缺失的基因,在转化前被NheI消化。由此产生的中间酵母菌株对氨基糖苷G418耐药,无法在缺乏赖氨酸的最低培养基上生长。然而,I-CreI过表达后,该菌株能够在不含赖氨酸的培养基上生长(但对G418敏感)。第二,一个阿德2添加了SSA目标:ade2用含有ade2含有5′和3′缺失的基因,并通过StuI线性化,从而引入两个1.1kb的直接重复序列,由含有色氨酸选择性标记和靶位点的3.6kb盒分离。因此,最终选择的酵母菌株对G418和色氨酸的原营养性具有抗性,而不能在缺乏赖氨酸和/或腺嘌呤的最小培养基上生长(详细方案可根据要求提供)。
为了进行选择,使用I-CreI突变文库通过经典的TRAFO方法从选择菌株转化酵母细胞(34). 细胞被镀到不含亮氨酸的选择性培养基上(转化细胞的选择),并含有半乳糖作为碳源,以诱导I-CreI突变体的过度表达。在37°C下生长三天后,菌落悬浮在水中,将小份悬浮液涂布在缺乏亮氨酸、腺嘌呤和赖氨酸的选择性培养基上(选择克隆,其中ADE2型和LYS2型SSA报告员已重组)并含有半乳糖。最后,使用QPix2菌落采集器(Genetix)将分离的克隆排列成96周的微点板,微点板含有100µl/孔的YPD培养基。将所有微孔板在30°C下搅拌培养过夜,并添加无菌甘油(最终甘油浓度为20%),以便在−80°C下储存。
酵母筛选
使用菌落网格(QpixII,Genetix)进行交配。用高网格密度(~20点/cm)将突变株网格化在覆盖YPD中板的尼龙过滤器上2). 在相同的过滤器上进行第二次网格化处理,以确定第二层,该层由六个不同的报告宿主酵母菌株组成,用于每个变体。将膜放置在富含YPD的固体琼脂培养基上,并在30°C下培养一晚,以便交配。接下来,将过滤器转移到缺乏亮氨酸和色氨酸的合成培养基中,以半乳糖(2%)为碳源,并在37°C下培养5天,以选择携带表达和目标载体的二倍体。5天后,将过滤器置于含有0.02%X-Gal的固体琼脂糖培养基上,置于0.5 M磷酸钠缓冲液、pH 7.0、0.1%十二烷基硫酸钠、6%二甲基甲酰胺、7 mMβ-巯基乙醇、1%琼脂糖中,并在37°C下培养,以监测β-半乳糖苷酶活性。
突变体文库的构建
如前所述,合成了I-CreI wt和I-CreI D75N开放阅读框架(ORF)(33). 通过用AAC替换密码子75引入突变D75N。利用Sigma的简并引物,在44、68和70位携带密码子VVK(编码氨基酸A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或T的18个密码子),并以I-CreI基因作为DNA模板,通过PCR产生了巨核酶文库的多样性。最终PCR产物用特定限制性内切酶消化,并克隆回用相同限制性内切酶消化的I-CreI ORF中(详细方案可根据要求提供),在pCLS542中。在这个基于2µm的复制载体中,标记有LEU2级基因,I-CreI变体受半乳糖诱导启动子控制(33). 电穿孔后大肠杆菌,我们得到了7×104克隆,代表DNA水平上理论多样性的12倍(18三= 5832). 提取DNA并转化为面包酵母应变FYC2-6A(材料α,trp1Δ63,亮2Δ1,his3Δ200). 使用菌落采集器(QpixII,genetix)采集菌落(13824),并在144个微量滴定板中生长。
噬菌体显示目标
为了进行噬菌体展示选择和筛选,使用相应的pGEM-T载体作为模板和一对包含5′-生物素化寡核苷酸的引物,通过PCR产生特定的400 bp生物素化DNA靶点。获得单带PCR产物(在琼脂糖凝胶上检查),并根据经验确定用于选择或ELISA测定的工作量。为了用噬菌体展示I-CreI突变体丰富我们的文库,这些突变体结合我们的DNA靶点,实现了几个噬菌体生产和选择循环。S1234包含一个24 bp的I-SceI裂解位点(CACGCTAGAGATAACAGGGTATA)。
噬菌体生产
通过NcoI和EagI消化和连接将Ulib2 N75文库亚克隆到噬菌体载体中(35). TG1型大肠杆菌用噬菌体文库转化的细胞或经过一轮选择后收集的细胞在37°C的50 ml 2YTAG(含有100µg/ml氨苄西林和2%葡萄糖的2YT培养基)中生长。一旦文化达到OD600将辅助噬菌体M13KO7(Amersham)以噬菌体与细菌之比20:1添加到5 ml等分试样中,并在37°C下保持30 min,无需搅拌。然后通过离心法回收细胞(3100克悬浮在25 ml 2YTAK(含有100µg/ml氨苄青霉素和25µg/ml卡那霉素的2YT培养基)中,并在30°C下培养过夜,以产生噬菌体颗粒。通过离心(3100克在4℃下持续20分钟),并添加0.2 vol的20%PEG6000 2.5 M NaCl以沉淀噬菌体(在冰上1小时)。通过离心(3100)获得噬菌体颗粒克在4°C下保持20分钟),并溶解在1 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。清洗溶液(1000℃离心克5min),噬菌体颗粒沉淀。噬菌体最终悬浮在250µl PBS中。
噬菌体选择
将噬菌体颗粒稀释在1 ml TMC(10 mM Tris缓冲液,pH 8,含有150 mM NaCl、3%奶粉和25 mM CaCl2)室温下孵育1h。然后将生物素化DNA靶点样品添加到噬菌体溶液中。在室温下1小时后,将链霉亲和素珠(Dynal,100µl或200µl用于第一轮选择)在TMC中清洗三次,并在同一缓冲液中封闭1小时,然后添加到噬菌体/DNA混合物中。在室温下15分钟后,收集这些珠子(使用磁铁在小瓶壁上),在含有0.1%吐温-20的TMC中清洗10次,再在PBS中清洗一次。最终将它们悬浮在0.5 ml 100 mM三乙醇胺(pH 12)中,并培养10分钟,以释放噬菌体颗粒。收集上清液并立即中和,添加0.5 ml pH为8的1 M Tris。连续稀释输入和输出噬菌体溶液的等分样品,并用于评估相应数量的噬菌体颗粒,从中可以监测富集水平。将2YT(4 ml)和指数生长的TG1细胞(5 ml)添加到剩余的输出噬菌体溶液中,并在37°C下孵育30 min,不搅拌。然后将(噬菌体感染的)细胞接种在2YTAG平板上,在30°C下培养过夜。所有生长的菌落在2YTAG中恢复并悬浮,调整最终OD600至100,并添加甘油至最终浓度15%,所得细胞样品储存在−80°C。
噬菌体展示筛选
TG1型大肠杆菌用噬菌体文库转化的细胞或经过一轮筛选后收集的细胞在琼脂平板上生长形成分离菌落。然后将结肠用牙齿挑入96孔微量滴定板中的100µl 2YTAG中,在37°C下搅拌培养过夜。在添加无菌甘油(最终甘油浓度为20%)以在−80°C下储存之前,使用转移装置复制所有平板。复制板在37°C下搅拌培养2.5 h。2YTAG含有2×109添加辅助噬菌体M13KO7的pfu,并在30°C下进一步培养板30 min(无搅拌),然后在1700 r.p.m.下旋转15 min。细胞颗粒悬浮在150µl 2YTAK中,细胞在30℃下生长过夜,以在培养基中产生噬菌体颗粒。离心(1700转/分,4°C下15分钟)后,在噬菌体ELISA中使用20µl上清液。用生物素化BSA(Sigma)包被微量滴定板(Maxisorp,Nunc)(在37°C下用100µl/孔含有2µg/ml BSA的PBS孵育1小时)。用含有0.1%吐温20(PBST)的PBS洗涤三次后,将链霉亲和素(Promega)结合到涂层板上(室温下用100µl/孔含有10µg/ml链霉菌亲和素的PBS培养1小时)。如前所述清洗板,并添加特定的生物素化DNA靶(100µl/孔PCR产物,PBS中约250 pM)。在室温下培养1小时并清洗(如前所述)后,用TMC(300µl/孔10 mM Tris缓冲液,pH 8,含有150 mM NaCl、3%奶粉和25 mM CaCl)使平板饱和2). 1小时后丢弃TMC,并用80µl TMC和20µl/孔含有噬菌体颗粒的培养上清液填充平板。在室温下1小时后,用PBST广泛清洗微孔板(10次)。将抗M13-马萝卜过氧化物酶(HRP)结合抗体(Pharmacia)在TMC中稀释1/5000,并添加到微孔板中(100µl/孔)。在室温下培养平板1小时,然后用PBST清洗(10次)。最后,添加TMB(Sigma)(100µl/孔),提供HRP底物,5分钟后,添加50µl/1孔的1 M h,对HRP反应进行淬火2SO公司4。然后读取所有平板在450 nm处的吸光度(BioRad Microplate Reader 550)。阳性结合物是指那些吸光度信号高于背景水平阈值(用无噬菌体或噬菌体显示非功能性核酸内切酶测定)加上该背景信号标准偏差三倍的结合物。
结果
选择菌株和报告质粒的构建
我们的原则体内酵母的选择基于营养缺陷标记的恢复。在这种情况下,酵母菌株的选择标记(称为选择标记)被含有转化标记的插入物破坏,感兴趣的位点两侧有两个直接重复序列()从而创建一个名为selection strain的菌株。由于自发重组,为了获得非常低的背景,每个选择菌株在两个不同的位点(即ADE2型和赖氨酸2). 当细胞中表达的活性巨核酸酶裂解感兴趣的位点时,SSA可获得完整的选择标记,允许在合适的平板上选择重组克隆(). 按照该程序,构建了五株对应于靶点C1234、C1221、C4334和两个相关回文靶点H1221和H4334的菌株().
选择和筛选原则。(一)选择菌株的构建:菌株FYC2-6A用含有缺失基因的线性化质粒进行转化LYS2型、目标站点和标记KanR。在含有氨基糖苷G418的选择性培养基上进行选择后,将产生的菌株转化为含有缺失基因的线性化质粒ADE2型、目标位置和标记TRP1号机组因此,最终菌株表型为Trp+、KanR、Ade−,赖氨酸−. (b条)选择过程:用携带LEU2级标记和表达库。在不含亮氨酸的选择性培养基(L板)上选择转化子后,菌落重新悬浮,并在培养基上镀上固定数量的细胞,以选择完整的选择标记和表达载体(含有不含亮嘌呤、腺嘌呤和赖氨酸的选择性培养液的LAK板)。SSA,允许恢复选择标记的事件。(c(c))筛选过程中,携带表达载体的菌株与携带基于lacZ基因破坏的报告基因的菌株交配。诱导后,产生一个突变体,切割目标位点,并允许SSA恢复标记。在含有X-gal的平板上可以直接观察到LacZ基因的表达。灰色小球代表巨核酶(mega),白色小球代表β-半乳糖苷酶。
突变库和目标(一)为随机化(绿色)和相互作用碱基对(−3,橙色;−4,粉红色;−5,洋红)选择的结合界面区域(底视图)的定位。(b条)缩放显示随机选择的残基44、68和70(绿色)、D75(红色)和相互作用的碱基对(−3,橙色;−4,粉红色;−5,洋红)。(c(c))用于选择和筛选的目标序列。C1234,野生型靶标C1221;和C4334,回文位点来源于C1234。H1221和H4334,与C1221相关的回文位点。方框突出显示C1221或C4334站点中未发现的底座。
我们还开发了一种类似的方法,其中DSB诱导的重组导致功能性LacZ基因的恢复()而不是染色体营养缺陷标记。此方法可用于直接HTS(28),但也包括选择实验的下游:选择后,仍然可以通过将克隆与含有LacZ报告质粒的菌株配对来筛选结果克隆的活性(). 实验的总体方案在.
型号选择
为了评估我们的选择策略的效率,我们用编码不相关归巢内切酶(I-DmoI)的固定数量的表达载体转化了含有野生型I-CreI位点的选择菌株,该表达载体添加了不同数量的编码I-CreI N75的表达载体,比率为10−3, 10−4和10−5先前的实验比较了直接选择重组克隆(带有恢复选择标记)和第一次选择含有表达载体(转化子)的克隆,然后刮除并重新涂布重组体的培养基,结果表明,两步法的富集效果显著更高(数据未显示)。所以,以不同比例转化的选择菌株首先接种在缺乏亮氨酸的培养基上。殖民地随后被从盘子上刮下来,10个7将每个选择的细胞接种在Leu的培养基上+阿德+酵母细胞,称为重组克隆。只有10的比率−4和10−3与对照组相比,重组克隆的数量有显著差异(). 然而,对每种比率的16个选定克隆进行筛选后,发现存在I-CreI N75表达克隆,即使是10个克隆−5比率(). PCR和限制性分析证实这些阳性克隆携带I-CreI N75 ORF。这一结果表明,我们的选择技术可以在105单轮射程。
表1
比率 | 转化体 | 重组物 | 正面评论 |
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0 | 298 000 | 45 | 0/16 |
10−5 | 310 000 | 51 | 4/16 |
10−4 | 305 000 | 275 | 10/16 |
10−3 | 308 000 | 2540 | 16/16 |
Ulib2 N75的设计和施工
为了进一步证明选择方法的效率,我们决定创建一个I-CreI变体库,以随后丰富活性突变体。I-CreI是一种二聚体归巢核酸内切酶,可裂解22 bp的假盲靶点(). 对I-CreI结构与其天然目标结合的分析表明,在每个单体中,8个残基与7个碱基建立直接相互作用(31). 残基Q44、R68、R70在位置3–5(和−3至−5;). 作为第一次尝试生成具有修改特异性的活性I-CreI突变体并验证我们的选择策略,我们选择随机化I-CreI DNA-binding接口的这一区域,并针对I-CreI野生型目标(此处命名为C1234)选择产生的库。由于酵母中的表达导致同源二聚体,我们还针对来自I-CreI野生型靶点(C1221和C4334)的两个回文位点和两个相关的回文位点(H1221和H4334)选择了我们的文库(). 我们的I-CreI支架首先从D75突变为N,以减少由于库中碱性残基R68和R70的替换而引起的可能的能量应变,这些残基满足I-CreI结构中埋藏的D75的氢受体电位(). D75N突变并未影响蛋白质结构,但在过度表达实验中降低了I-CreI的毒性(数据未显示)。该支架突变体名为QRR,通过筛选进行了分析,显示其能够有效地切割靶点C1234和C1221,在较小程度上切割靶点C4334和H4334。目标H1221根本没有被劈开(). 接下来是位置44、68和70()使用编码氨基酸A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S或T的密码子VVK随机化,得到一个理论多样性为5832(DNA水平)的小文库,该文库被克隆到适合酵母表达的载体中。对随机挑选的80个克隆进行测序,得到79个不同的突变体(此样本中不存在支架QRR),并表示了三个随机位置的所有可能残基,表明库中具有良好的多样性(数据未显示)。
从C1234酵母中筛选克隆的结果(一)95个克隆的原始结果(A1井为阴性对照)。(b条)针对C1234选择的突变体概况。目标图例:1,C1234;2、C1221;3,C4334;4、阴性对照;5、H1221;和6,H4334。
体内用于切割的Ulib2 N75酵母筛选
接下来,将文库Ulib2 N75转化到五种不同的选择菌株中,并如上所述进行选择。大约106每个病例都获得了转化菌落,10个8将转化细胞接种到选择板上,以获得足够的重组体用于进一步分析。从每个选择中挑选重组克隆(95个),并使用我们的筛选试验通过交配进行分析。对几个克隆的ORF进行了PCR-扩增和测序。显示了每个选择中能够切割用于选择的位点的克隆数量,以及每个突变的序列和频率,通过残基44、68和70进行鉴定。正如预期的那样,在野生型位点C1234上进行的选择非常有效,并产生了绝大多数活性克隆,其中支架蛋白(QRR)是继突变QTK(17%)之后第二常见的克隆(15%)。从该选择获得的78个序列中,鉴定出13个新的活性突变体。在回文左侧位点(C1221)上进行的选择同样有效,并且大多导致相同的突变体(). 然而,在获得的84个序列中,QRR占优势(19%)。I-CreI野生型位点(C4334)的右回文位点被I-CreI和突变QRR切割的效率较低(). 引人注目的是,针对该靶点选择Ulib2 N75主要产生了一个突变,即QRK(95%)和少数QRR(3%)。筛选结果显示克隆QRK对C4334的活性略高(). 针对H4334的选择只导致两个群体:QRR(66%)和QRK(34%)。筛选试验没有显示这两个克隆对C4334的活性有任何显著差异(). 最后,针对H1221的选择只产生了少数在筛选试验中呈阴性的重组体。
表2
目标 | 1234元 | 1221元 | 4334元 | H1221型 | H4334型 |
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重组子 | 8.6 × 105 | 7.8 × 105 | 3.9 × 103 | 1.6 × 106 | 2.3 × 104 |
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刀具(%) | 96 | 98 | 68 | 0 | 97 |
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突变体 | QTK 13号机组 | QRR 16 | QRK 59号机组 | 没有人 | QRR 57型 |
| QRR第12条 | 量化风险编号12 | 量化风险评级2 | | QRK 29号机组 |
| 二维码8 | QRT第12条 | TRR 1号机组 | | |
| 量化风险编号8 | 量化风险评估8 | | | |
| QRT第8条 | QRK 8级 | | | |
| 量化风险评估7 | QTK 7号机组 | | | |
| TRR 4号机组 | QRG四 | | | |
| 问题解答3 | QSK 4号机组 | | | |
| QNK 3号机组 | 问题解答3 | | | |
| QRG三 | QGK 3号机组 | | | |
| 质量标准3 | QRQ三 | | | |
| 第2季度 | TRR 2号机组 | | | |
| QRH 2级 | QNK 1号机组 | | | |
| QRS 2级 | QQK 1号机组 | | | |
体外基于噬菌体展示的Ulib2 N75结合选择
为了比较我们的选择程序与标准的基于噬菌体展示的选择的效率,我们还将Library Ulib2 N75克隆到噬菌体显示载体中,并在中进行电穿孔大肠杆菌在救援后,对该文库进行筛选,以对抗用含有I-CreI衍生位点的生物素化400 bp双链DNA预培养的链霉亲和素涂层磁性微球。选择重复三次,并使用标准噬菌体ELISA程序分析每轮输出的80个克隆与所有靶点的结合。针对C1234和C1221的第一轮选择分别产生了60%和71%的粘合剂(). 针对C4334的选择只产生5%的阳性反应,发出微弱信号。作为控制,对无关目标执行的选择只产生一个克隆,能够绑定到C1234,但不能与用于选择的序列相反。目标C1234和C1221的第2轮和第3轮几乎只产生了粘结剂,而C4334的第2和第3回合导致粘结剂比例适度增加。从每轮选择中挑选32个克隆并测序(). 总体而言,噬菌体展示选择输出与酵母输出相似。噬菌体展示中也发现了大多数常见的酵母突变体(QRN、QRR、QRK、QRT、QRA、QRS和QAK)。两个显著的例外是QTK,它是酵母C1234选择中最常见的克隆,没有出现在噬菌体展示输出中,QQK分别代表针对C1234和C1221的最终噬菌体选择的35%和31%,在C1234酵母选择中没有发现(尽管在C1221酵母选择中存在1%)。在通过噬菌体展示分离的9个突变体中,只有QHK在酵母输出中不存在,而通过酵母筛选发现的8个突变体在噬菌体显示中没有发现。
表3
目标 | 1234元 | 1221元 | 4334元 | 1234元 |
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圆形 | 1 | 2 | 三 | 1 | 2 | 三 | 1 | 2 | 三 | 1 | 2 | 三 |
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粘结剂(%) | 60 | 98 | 99 | 71 | 99 | 100 | 5 | 46 | 90 | 1 | 1 | 1 |
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突变体 | 量化风险编号8 | 量化风险编号13 | 量化风险编号16 | 量化风险编号14 | 量化风险编号23 | 量化风险编号17 | QQK三 | QRR 15型 | QRR第29条 | 量化风险评估1 | 快速反应小组1 | 量化风险审查1 |
| QRT六 | 问题QK 7 | QQK 10号 | QQK四 | 问题QK 9 | 问题QK 9 | 快速反应小组1 | QRK 2级 | QRK 1号机组 | | | |
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| QRK 1号机组 | | | | | | | | | | | |
| 问题解答1 | | | | | | | | | | | |
| 香港特别行政区1 | | | | | | | | | | | |
在这两种技术中,针对C4334等难靶点的选择导致QRK和QRR突变。然而,QRR在噬菌体展示中占主导地位,而QRK占酵母产量的94%。
讨论
第一个体内应用于归巢核酸内切酶的选择策略是为了研究I-CreI归巢位点识别和切割的序列要求(24). 尽管该方法可以测试直接接触DNA的残基的重要性,但它是基于阴性选择的,目的是检索无法切割目标的克隆。一秒钟大肠杆菌-该策略旨在为功能性归巢内切酶提供选择,并通过三种LAGLIDADG归巢内切酶(I-SceI、PI-SceI和I-ScaI)进行了验证(25). 然而,据报道,如果这种选择策略用于在蛋白库中寻找功能性内切酶,降低背景生长水平的需要很重要。最近,体内从归巢内切酶变体的随机(但定向)文库中进行选择(27). 然而,不是选择切割,而是使用双杂交策略选择与目标DNA结合。
我们希望设计一种方法,能够根据突变体在真核细胞内触发DSB诱导的同源重组的能力来分离突变体,从而直接选择突变体以获得最终想要的特性,而不是间接选择它们进行结合或未修复的切割。我们利用酵母中SSA的高效性,在目标位点由巨核酶诱导的DSB触发的标记(供选择的营养缺陷,供筛选的报告)恢复的基础上,推导了一种选择和筛选方法。使用加标混合物的模型选择实验揭示了该方法的两个显著特征。首先,我们获得的背景非常低,因为在没有I-CreI的情况下进行的选择只产生了45个10个菌落7转化体,即在10个−5范围。这一特征主要是由于每个菌株存在两个SSA标记。事实上,初步实验证明了10−3到10−4只携带一个标记的菌株(数据未显示)。其次,25%的无性系在选择后选择,输入比I-CreI N75/I-DmoI为10−5,在我们的筛查分析中发现呈阳性。这表明体内选择可以提供10中的富集因子5范围,这可以被认为是显著的。相比之下,用抗体片段进行的模型噬菌体展示选择通常达到10个富集因子2到10三每轮射程。
接下来,我们使用相同的方法从一个小的I-CreI变体库中选择活性归巢内切酶。正如预期的那样,野生型目标C1234及其左回文C1221产生了高百分比的切割器,而H1221与C1234显示出少量同源性,仅产生了背景克隆。有趣的是,C1234和C1221上的成功选择导致了突变体的高度多样性,与C4334和H4334上的选择不同,I-CreI N75(也称为QRR)缓慢切割的两个靶点,其中只有两个克隆QRK和QRR存活下来。因此,许多突变体能够有效切割C1234和C1221,但只有支架克隆QRR和一个密切相关的突变体QRK能够有效切割C4334和H4334,以进行富集。应该注意的是,许多针对C1234选择的突变体能够非常有效地切割该靶点,但与支架克隆QRR不同,C4334不再显示任何可检测信号,这证明了如果没有选择压力,活性是如何丧失的。我们可以观察到我们的选择和筛选试验之间的良好相关性,因为在H4334上选择后出现的仅有两个克隆,QRR和QRK是筛选试验中显示抗H4334高信号的唯一两个克隆().
将我们的结果与已建立的方法在效率方面进行比较,并查看体内我们认为,基于重组的战略会导致强烈的偏见在体外我们文库的噬菌体展示选择针对显示I-CreI衍生位点的磁珠。尽管存在一些显著差异,但这两种方法的总体输出非常相似。这一结果可以被认为是显著的,因为这两种技术非常不同。事实上,主要区别在于选择原则,酵母技术选择切割器,而噬菌体展示是基于结合。其他差异可能导致强烈的偏见。例如,噬菌体颗粒表面的成功展示取决于蛋白质在原核环境中有效生产的能力大肠杆菌细胞质,在周质中输出,最后并入噬菌体衣壳。然而,酵母选择使用真核蛋白质合成机制,因此不太容易出现表达问题。这两种技术之间的这种差异可能解释为什么突变QTK在酵母选择中表现良好,但在噬菌体展示输出中却没有。
正在执行在体外噬菌体展示选择强烈依赖于使用的条件,如缓冲液组成、温度和洗涤次数。因此,找到合适的条件可能很复杂。相反,在酵母选择方法中,只有少数参数,如温度(但在酵母可耐受的范围内)或诱导(葡萄糖或半乳糖),与操作人员有关。然而体内环境是非常相关的,因为它密切模拟了巨核酶作为最终产物必须运行的条件。另一个优点是体内选择过程是细胞毒性突变体的内在损耗,因为它们在转化和重组体选择过程中丢失。
总的来说,在选择输出的效率和多样性方面,酵母选择优于噬菌体展示,并且似乎不会产生强烈的偏见。其强大的富集能力和简单的使用使该技术成为归巢核酸内切酶工程的首选工具。我们最近设计了一种基于HTS的方法,可以提供大量具有新特异性的新型巨核酶(28). 虽然这种方法被证明是非常快速和强大的,但它对可以分析的库的大小施加了限制,~104克隆。因此,它仅适用于结构信息有助于准确选择待检测归巢核酸内切酶的残基,并严重限制待随机化残基数量的情况。这个体内本文中描述的选择方法允许处理更大的序列空间。实际上,唯一的大小限制是由于库的初始转换为选择应变。经典热休克酵母转化技术在酵母中的平均转化效率(34)是106转化子/微克DNA。这种技术的简单升级可以导致108一个实验中的转化子,重复这一步骤可能会导致10个9范围,允许处理库105倍于直接HTS中使用的。然而,必须对每个选择菌株执行此转换步骤。我们目前正在通过开发一种协议来消除这一限制,该协议使用一种可重复使用的文库菌株,通过高效的液体交配方法与不同的选择菌株进行交配。
总之,这个体内酵母选择和我们之前描述的机器人辅助HTS是两个关键过程,这两个过程极大地促进了新定制巨核酶的工程化,并应为基因组工程提供一套有价值的工具。
致谢
我们要感谢朱莉安·史密斯对手稿的批判性阅读。这项工作得到了法国创新机构(ANVAR)0212508Q拨款和法国研究部04W107拨款(EUREKA∑!)的部分支持!3294.法国创新署(ANVAR)为支付本文的开放获取出版费用提供了资金。
利益冲突声明。未声明。
参考文献
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