人类非综合征遗传性耳聋DFNA17是由非肌肉肌球蛋白突变引起的MYH9年

摘要

介绍

我们之前绘制了一个新的非综合征遗传性听力障碍（HHI）基因座DFNA17(MIM 603622接口)，染色体22q12.2-q13.3。DFNA17公司映射到17–23 cM的相对较大的遗传区域，这是所研究家族大小的典型特征（Lalwani等人。1999). 链接区域的低分辨率阻止了使用位置克隆方法来识别疾病基因。因此，采用了候选基因方法，这是位置克隆的默认替代方法（柯林斯1995). 对22号染色体基因图谱的分析在跨越DFNA17基因座的区域内鉴定了163个候选基因（Dunham等人。1999). 选择其中一个编码非肌肉-肌球蛋白重链A（MYH9）的候选基因进行进一步分析。选择MYH9年（其编码II类或常规肌球蛋白的一个成员）是基于对其他几个与HHI致病相关的肌球蛋白重链基因突变的鉴定（Friedman等人。1999).

II类肌球蛋白广泛表达于骨骼肌、心肌和平滑肌以及非肌肉组织中，它们由一对重链、一对轻链和一对调节轻链组成（Sellers2000). N末端运动结构域是肌球蛋白重链最保守的区域，包含ATP和肌动蛋白结合位点。肌球蛋白，也称为“肌凝肌球蛋白”，调节骨骼肌收缩，是II类肌球蛋白家族最具特征的代表。心肌细胞和平滑肌细胞也具有II类肌球蛋白的亚型，与肌聚肌球蛋白不同，并介导这些肌肉细胞的收缩。

非肌肉细胞中肌球蛋白的特征已确定II类肌球蛋白有两种不同的亚型：非肌肉肌球蛋白–IIA（MYH9）（Saez等人。1990; Simons等人。1991)和非肌肉肌球蛋白–IIB（MYH10）（Simons等人。1991).MYH9年和10马来西亚令吉已分别映射到22q11.2和17q13，并在其运动域中表现出85%的一致性。一些骨骼肌重链基因也定位于含有10马来西亚令吉大多数细胞表达的每种肌球蛋白数量相对相等，只有少数例外。例如，血小板仅表达MYH9（Maupin等人。1994; 菲利普斯等人。1995)而神经元组织主要表达MYH10。当MYH9和MYH10在同一细胞类型（Kolega1998一,1998b条). 这两种亚型的体外运动研究表明，MYH9在ATP水解速率和肌动蛋白丝运动速率方面比MYH10快几倍（Kelley等人。1996). 它们的定位和体外特性的差异表明体内功能不同。

我们对非肌肉肌球蛋白生物学作用的理解部分来自对无脊椎动物的研究，并与骨骼肌和平滑肌肌球蛋白II相类比。无脊椎动物模型系统的使用表明，非肌肉肌球蛋白II直接参与多种细胞功能，包括介导细胞分裂粘液菌物种（De Lozanne和Spudich1987)，发育过程中的形态发生果蝇属物种（爱德华兹和基哈特1996)以及细胞极性的建立秀丽隐杆线虫胚胎（Guo和Kemphues1996). 在脊椎动物中，MYH10的生物学作用已经通过基因敲除小鼠的产生进行了研究（Tullio等人。1997). MYH10^−/−胎儿在宫内或围产期死于充血性心力衰竭，这表明MYH10是心脏正常发育所必需的。MYH9在脊椎动物中的生物学作用尚未被研究或描述。

在本研究中，我们确定了MYH9年与非综合征性耳聋相关的突变，称为“DFNA17”。突变R705H是核苷酸序列中G→a转座的结果，被认为对肌球蛋白运动结构域的ATP酶活性至关重要。突变体的共分离MYH9年非综合征性听力损伤对MYH9年与突变等位基因相关的听力和器官特异性病理学。

族、材质和方法

结果

MYH9在大鼠耳蜗中的表达分析

对大鼠肾、肺和耳蜗组织样本进行筛选，以表达MYH9年成绩单。使用引物对MYH9（2504）A和MYH九（3201）B（参见家族、材料和方法部分）扩增肾、肺和耳蜗cDNA中的698 bp DNA(图1A类). 通过引物MYH9（2163）A和MYH9（3201）B扩增相邻的MYH9编码序列，也发现了类似的组织表达模式（数据未显示）。来自所有三种组织类型的cDNA的CYPR表达均为阳性，证实了cDNA的完整性(图1B类). 使用MYH9特异性引物进行PCR-扩增的耳蜗片段被测序，发现与大鼠几乎相同MYH9年其他地方发布的序列（GenBank登录号GI 6981235标准). 扩增的PCR片段的核苷酸序列跨度大于1 kb的编码区，与大鼠MYH9的已发表序列相比，在四个单独的密码子中包含四个单碱基对差异。其中三个替代是无声的改变。第四个是核苷酸3019的G→a转座，它代表密码子1007中的第一个碱基，将氨基酸从天冬氨酸（D）变为亮氨酸（N）；人类的密码子1007也存在NMYH9年D3019N改变被认为是多态性。

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图1

大鼠耳蜗cDNA中MYH9表达的RT-PCR分析。使用MYH9特异性引物，通过PCR检测包括耳蜗在内的多个组织的cDNA，以检测MYH8的表达。A类，来自耳蜗、肾脏和肺部的cDNA。所有样本均获得了预期的698 bp片段，该片段使用大鼠MYH9特异性引物进行扩增。在没有RT和水（H）的情况下，耳蜗RNA₂O） 作为阴性对照。B类，检测MYH9表达的所有组织的cDNA。所有样本均呈阳性表达中国青训营，一种家务基因，使用中国青训营-产生预期371-bp片段的特异性引物。

使用针对纯化血小板肌球蛋白制备的多克隆抗MYH9抗体在耳蜗切片中进行免疫定位（生物医学技术）。在各种耳蜗组织中检测到MYH9免疫反应(图2A类); 这些包括Corti器官的外毛细胞、螺旋韧带的中下区域和Reissner膜。MYH9未在听觉神经元或血管纹（形成耳蜗管侧壁的血管组织）内观察到。尽管MYH9在听觉神经上皮中存在，但在杯状前庭神经上皮中却没有MYH九免疫反应。

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图2

MYH9在大鼠耳蜗中的免疫定位。将大鼠耳蜗放射状切片与抗MYH9抗体杂交，用生物素化碱性磷酸酶连锁扩增系统扩增，并用NBT-BCIP染色。A类大鼠耳蜗导管的显微照片，显示耳蜗的几个区域存在抗MYH9免疫反应，包括外毛细胞、Corti器官细胞（OC）、螺旋韧带中下区（SL）和Reissner膜（RM）。SGN=螺旋神经节神经元；SV=血管纹。B类，在没有抗MYH9抗体的情况下培养耳蜗切片。切片无免疫反应。

分析MYH9年在DFNA17家族中

序列分析MYH9年在证明其转录本和翻译产物存在于大鼠耳蜗内耳后，在DFNA17家族中进行了研究。这个MYH9年首先通过其cDNA的序列分析进行筛选，该cDNA由从DFNA17家系受影响和未受影响成员的外周血淋巴细胞中获取的反转录RNA制备而成，如图3A类。来自受影响成员（III-4）的序列在编码序列中的两个位置（核苷酸2114和4902）包含一个单碱基对杂合性，而在MYH9年未受影响成员（V-2）的cDNA序列。核苷酸4902的G→A转座位于密码子1634的第三个位置，是一种无声的碱基对改变，因为它不会改变该位点的氨基酸。这两种差异中的第二种导致了MYH9多肽的改变。在代表密码子705中第二个核苷酸的核苷酸2114处观察到这种序列改变。虽然未受影响的个体在核苷酸2114处显示G，但受影响的个人同时显示G和A。核苷酸2114上的A改变密码子705，导致精氨酸被组氨酸取代。由这种单碱基对转座引起的氨基酸替换位于MYH9年基因。

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图3

A类，谱系与DFNA17。DFNA17家族五代中受影响的成员用黑色符号表示。B类，序列分析MYH9年在DFNA17家族中。MYH9年在DFNA17家族受影响和未受影响成员的基因组DNA中测序。尽管在核苷酸2114处观察到单个峰（G）MYH9年来自未受影响构件V-2的序列（上面板），在受影响的成员III-4的核苷酸2114（N）处观察到一个双链（a/G）（下面板）G→A转座将密码子从精氨酸（R）改变为组氨酸（H）。C，限制性分析MYH9年外显子16 2114G→突变消除了Fnu（Fnu）4HI限制性位点，这反映在MYH9年DFNA17家系受影响（III-4）和未受影响（V-2）个体的第16外显子。284-bp的PCR-扩增片段包含三个识别位点Fnu（Fnu）4HI-at位于距5′端130、135和168 bp处，其最后一个位点在突变等位基因中缺失。左边的数字是DNA梯带的大小。

所有40个编码外显子的序列分析MYH9年从DFNA17家族代表成员的基因组DNA中提取的基因证实了受影响成员的外显子16中存在G→A转座，但未受影响成员中没有(图3B类). 密码子705第二个核苷酸中的G→A转位导致消除Fnu（Fnu）4HI限制场所。因此Fnu公司从受影响个体扩增的外显子16的4HI消化物预计会产生149 bp的额外限制性片段，这在未受影响的个体中是看不到的。该标记用于证实MYH9年在DFNA17家族的受影响成员中，以及在未受影响的成员中(图3C). 通过序列分析和限制性分析，发现个体V-1和V-3未受影响，其受影响状态因其在连锁分析时年龄较小而未知。随机挑选的50名健康人的基因组DNA中没有核苷酸2114的G→A转座。跨越7个物种的肌肉和非肌肉II类肌球蛋白SH1-SH2连接区的MYH9多肽序列比对表明该连接区的严格保守性和精氨酸（R705）在该序列基序中的不变性(图4).

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图4

II类肌球蛋白中SH1连接区的排列。7个物种的肌肉和非肌肉II类肌球蛋白SH1连接区的肽序列比对表明，该连接区严格保守，精氨酸（R705）在该序列基序中具有不变性。

讨论

通过使用候选基因方法，我们确定了MYH9年作为DFNA17基因座的基因，负责常染色体显性HHI。MYH9年代表了第一个与听力损伤相关的传统肌球蛋白重链基因，它加入了越来越多的非常规（非II类）肌球蛋白重链基因（肌球蛋白VI[Avraham et al。1995]，VIIA【吉布森等人。1995，Weil等人。1995]，和XV[Probst等人。1998])与HHI相关。与MYH9类似，这些非常规肌球蛋白的表达并不局限于内耳的细胞和组织，但其功能障碍的主要临床表现是听力损伤。

已鉴定的突变R705H发生在肌球蛋白重链运动结构域的羧基末端一半内的一个高度保守和功能关键区域，该区域在六聚肌球蛋白分子中形成球状头部。在运动结构域内，R705位于一个高度保守的连接子区域，该区域跨越16个氨基酸，包含两个游离硫醇基团，即C704（SH1）和C694（SH2）。骨骼肌肌球蛋白球状头部的晶体结构表明，这两个硫醇是通过保守G696残基（Rayment1996; Gulick和Rayment1997). SH1和SH2螺旋被认为在肌球蛋白头部的构象变化中起着关键作用，这些构象变化发生在与ATP水解耦合的力产生过程中。X射线晶体学研究表明，在动力中风期间，轻链结合域相对于催化/ATP结合域摆动。这种摆动运动的枢轴点被认为位于SH1-SH2螺旋线附近（Houduse等人。1999). 毫不奇怪，SH1螺旋的体外和体内修饰，包括SH1-SH2基团的交联或SH1/SH2的改变/替代，已被证明破坏了肌球蛋白运动结构域的机械功能（Patterson等人。1997; 铃木等人。1997). 这些研究表明，肌球蛋白的功能完整性关键取决于其在SH1-SH2螺旋上的灵活性。在种内和种间肌球蛋白II亚型中，该连接子区域的严格保护进一步强调了其功能重要性。DFNA17家族中的R705H突变可能导致SH1螺旋的构象改变，从而影响其灵活性和运动，从而破坏运动域的机械功能。

我们尚未确定MYH9功能障碍导致失聪的机制以及观察到的DFNA17先证者的内耳组织病理学，即CSD。哺乳动物耳蜗中MYH9表达的定位对于理解和解释与其功能障碍相关的组织病理学具有特别重要的意义。在大鼠耳蜗内，MYH9的表达定位于三种不同的组织类型：Corti器官、螺旋韧带的中下区和Reissner膜。在Corti器官内，MYH9的表达在包括角质板在内的外毛细胞中得到了鉴定。肌球蛋白VI和肌球蛋白VIIA也定位于机械感觉毛细胞内。肌球蛋白VI定位于富含肌动蛋白的角质板和从静纤毛下降到角质板的小根肌动蛋白丝中，表明其在稳定静纤毛的基础附着方面发挥作用（Avraham等人。1997，Hasson等人。1997). 肌球蛋白VIIA定位于毛细胞的静纤毛和细胞体中（Hasson等人。1997). 肌球蛋白VIIA的假定作用包括维持静纤毛的完整性和内毛细胞的膜运输。MYH9在毛细胞中的作用尚待解释。

MYH9也在Reissner膜中表达，Reissner是一种由两层细胞组成的膜屏障，形成耳蜗管的上边界。受DFNA17影响的先证者的CSD组织病理学显示，Reissner膜塌陷（Lalwani等人。1997). Reissner膜中MYH9的功能障碍可能导致其细胞构筑受损，从而干扰耳蜗液稳态并影响耳蜗功能。在各种耳蜗组织中，MYH9表达缺失最明显的是血管纹，它形成了耳蜗导管的外侧壁，其功能障碍通常被认为是CSD的原因。血管纹中MYH9的表达缺失表明，这种组织类型与CSD的潜在病理生理学没有直接关系。

MYH9也在由纤维细胞组成的结缔组织组成的螺旋韧带内表达。螺旋韧带的纤维细胞根据钠的不同亚型进行分类⁺和K⁺它们表达的ATP酶以及它们的细胞骨架成分。螺旋韧带的次中心区对MYH9抗体具有免疫反应，其特征是存在III型和IV型纤维细胞。III型纤维细胞富含肌动蛋白和其他收缩和收缩相关蛋白（Henson等人。1984,1985). 这些细胞的假定作用包括为周围细胞提供锚定和/或对基底膜-螺旋韧带复合体中产生的张力进行发育或反应（Henson等人。1985). 这种张力的维持在耳蜗的基底转中可能更为关键，因为耳蜗对高频敏感，基底膜比耳蜗尖更宽。这可能是DFNA17中观察到的高频听力损伤的简单解释。MYH9功能障碍对HHI和老年性耳聋（类似于DFNA17表型的年龄相关听力障碍）的贡献仍有待确定。MYH9在耳蜗中的确切作用以及R705H突变导致DFNA17表型进行性听力损伤和CSD的机制仍有待阐明。

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