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基因发育。2005年11月15日；19(22): 2668–2681.
数字对象标识：10.1101/gad.1360605
预防性维修识别码：项目编号1283960
PMID：16260493

TAK1，而不是TAB1或TAB2，在体内的多种信号通路中发挥着重要作用

Jae-Hyuck垫片,1 长春晓,1,6 Amber E.Paschal公司,1 香农·T·贝利,1 平饶,1 马修·海登,1 李基扬（Ki-Young Lee）,1 Crystal Bussey公司,1 迈克尔·斯特克尔,1 田中信义,4 山田将军,2 石佐·阿基拉（Shizuo Akira）,5 松本圭弘,三和桑卡·戈什1,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

TGF-β-活化激酶1（TAK1）是MAPKKK家族的成员，被认为是诱导转录因子NF-κB和AP-1的关键调节剂，因此在调节介导炎症的基因中起着关键作用。尽管体外生物化学研究表明存在TAK1复合物，其中包括TAK1和适配器蛋白TAB1和TAB2，但尚不清楚该复合物的哪些成员对信号传递至关重要。为了分析TAK1在体内的功能，我们删除了1塔卡小鼠的基因，由此产生的表型是早期胚胎致死性。使用缺乏TAK1、TAB1或TAB2的胚胎成纤维细胞，我们发现TNFR1、IL-1R、TLR3和TLR4介导的NF-κB和AP-1活化在1塔卡米/米细胞，但在选项卡1-/-和选项卡2-/-细胞。此外，塔卡1米/米细胞对TNF诱导的凋亡高度敏感。TAK1在TNF-α和IL-1信号通路中介导IKK激活，分别在RIP1–TRAF2和MyD88–IRAK1–TRAF6下游发挥作用。然而，通过LT-β信号转导后的替代途径激活NF-κB并不需要TAK1。在TGF-β信号通路中，TAK1缺失导致NF-κB和c-Jun N末端激酶（JNK）活化受损，而不影响Smad2活化或TGF-？诱导的基因表达。因此，我们的研究表明，TAK1是IKKβ和JNK的上游激活激酶，而不是IKKα，揭示了TAK1在炎症信号通路中出乎意料的特殊作用。

关键词：JNK、NF-κB、TAB1、TAB2、TAK1、TGF-β

NF-κB和c-Jun N末端激酶（JNK）通路在免疫反应中发挥关键作用，保护细胞免受各种应激源和炎症细胞因子诱导的凋亡。由于其在各种疾病状态中的作用及其作为治疗靶点的潜力，炎症细胞因子TNF-α和IL-1激活的信号通路已被深入研究。TNF-α诱导其同源受体（TNFR1）三聚体化，并与衔接蛋白TRADD、TRAF2、TRAF5和RIP1结合，导致IKK复合物和JNK向受体复合物募集(Song等人，1997年). 激活的IKK触发IκBα的降解和随后NF-κB向细胞核的移位，导致TNF-调节基因子集的转录(海登和戈什2004). 一旦激活，JNK就会转移到细胞核，在那里它调节AP-1转录因子复合物（c-Jun和ATF-2）的活性(Chen和Goeddel 2002). 在IL-1信号通路中，IL-1与其同源受体（IL-1R）和IL-1R辅助蛋白（IL-1Racp）的相互作用形成激活的受体复合体，该复合体招募衔接蛋白MyD88、IRAK1、IRAK4和TRAF6。IRAK1的磷酸化和降解诱导TRAF6的泛素化，并将适配器蛋白复合物释放到细胞质中以激活下游激酶，包括IKK和JNK(邓等人，2000;Takaesu等人，2001年;Jiang等人，2002年).

TGF-β活化激酶1（TAK1）是MAPKKK家族的成员，最初被确定为TGF-α诱导信号通路中MAP激酶活化的关键调节因子(Yamaguchi等人，1995年). 在爪蟾TAK1参与了TGF-β家族配体骨形态发生蛋白（BMP）介导的中胚层诱导和模式化(Shibuya等人，1998年). 最近的研究报告称果蝇属TAK1是JNK和NF-κB（Relish）激活所必需的，以应对革兰氏阴性菌感染的免疫挑战，并且TAK1中IMD信号受损-/-苍蝇(维达尔等人，2001年;Boutros等人，2002年;Silverman等人，2003年;Park等人2004). 在哺乳动物中，体外和过表达研究表明，TAK1参与IKK和JNK/p38MAP激酶上游的TNFR1和IL-1R/TLR介导的信号通路(Takaesu等人，2003年). 通过酵母双杂交筛选，分离出两种哺乳动物TAK1衔接蛋白TAB1和TAB2作为TAK1相互作用蛋白。TAB1与TAK1构成性相互作用，并在过度表达时诱导TAK1激酶活性(涉谷等人，1996年). IL-1刺激后，TAB2从细胞膜转移到胞浆，并将TAK1与TRAF6连接，从而介导TAK1活化(Takaesu等人，2000年). 体外生化研究表明，TRIKA1（Ubc13和Uev1A的复合物）和TRIKA2（TAK1、TAB1和TAB2的复合物(Wang等人，2001年). 然而，哺乳动物TAK1、TAB1和TAB2在体内炎症信号传导中的生理作用仍有待确定。已产生TAB1缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）；然而，TAB1的功能尚未在TNFR1和IL-1R/TLR介导的信号中进行测试(小松等人，2002年). 令人惊讶的是，TAB2缺陷的MEF能够正常激活IKK和JNK，以响应TNF-α或IL-1(Sanjo等人，2003年). 因此，现有的遗传证据尚未重述哺乳动物细胞中TAK1复合体在向NF-κB和AP-1发送信号方面的预测作用。

因此，为了明确TAK1在体内的功能，我们产生了突变体1塔卡米/米小鼠，其胚胎致死表型不同于TAB1和TAB2缺陷小鼠。为了避免这种早期致死性带来的困难，我们研究了来自这些小鼠的JNK和NF-κ双胚成纤维细胞的信号转导。不同于选项卡1-/-和选项卡2-/-细胞，1塔卡米/米细胞通过TNFR1、IL-1R和TLR3表现出NF-κB和JNK活化的显著受损，并且对TNF-α诱导的凋亡高度敏感。TAK1（而非TAB1或TAB2）是从RIP–TRAF2和MyD88–IRAK1–TRAF6复合体到IKK复合体的重要信号传感器。虽然TAK1对TLR4诱导的AP-1激活至关重要，但LPS激活NF-κB对TAK1的要求似乎不太完整。然而，LT-β诱导p100加工或NF-κB活化并不需要TAK1，这表明激活替代性IKKα介导的NF-κ的B途径需要不同的条件。在Tak1型米/米TGF-β诱导的细胞、Smad2活化和基因表达正常，而NF-κB和JNK活化受损。因此，对哺乳动物TAK1复合物的体内分析确定了对TAK1（而非TAB1或TAB2）的特殊要求，TAK1是多种信号通路中IKKβ和JNK的上游激活物，可通向AP-1和NF-κB。

结果

的生成1塔卡突变胚胎

为了探索TAK1在体内的生物学功能，我们产生了TAK1缺陷(Tak1型米/米)微量注射trap基因突变小鼠1塔卡胚胎干细胞（ES）进入C57BL/6小鼠囊胚(图1A;Stryke等人，2003年;Austin等人，2004年;Skarnes等人，2004年). 确认trap突变基因的胚胎生成塔卡1胚胎第9.5天（E9.5）野生型分析ES细胞β-半乳糖苷酶的表达(1塔卡+/+)和杂合胚胎(1塔卡+/米) (图1B). PCR基因分型显示β-半乳糖苷酶在杂合子中表达(1塔卡+/米)，但不是野生型胚胎(1塔卡+/+). 抗TAK1抗体的免疫印迹分析证实了野生型TAK1的表达(1塔卡+/+)和杂合子(1塔卡+/米)，但不是纯合突变(1塔卡米/米)胚胎(图1C).

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有针对性地中断Tak1型基因。(A类)的示意图1塔卡基因追踪策略。PCR基因分型中使用的引物（F1、R1和R2）的位置用箭头表示。（En2）2基因；β-半乳糖苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合蛋白（βgeo）；（IRES）内部核糖体进入位点；（PLAP）人胎盘碱性磷酸酶；（SV40 pA）SV40多聚腺苷化信号。(B类)E9.5野生型β-半乳糖苷酶染色(1塔卡+/+)和杂合胚胎(1塔卡+/米). 棒材，100μm。(C类)E10野生型（+/+）、杂合型（+/m）和纯合型（m/m）突变胚胎中TAK1的PCR基因分型和免疫印迹分析。野生型和插入型突变等位基因的PCR片段大小分别为599个碱基对（bp）和195 bp。(D类)野生型（+/+）和1塔卡E9.5、E10.5和E11.5的突变胚胎（m/m）。(E类)Ventral公司(左边)和Dorsal(中间的)E10视图1塔卡E10.5的突变胚胎和侧视图1塔卡突变胚胎(正确的). 采用全胚胎进行PCR基因分型。（HF）头部折叠；（NT）神经管。

神经管发育异常1塔卡突变胚胎

接下来，我们检测了杂交后新生后代的基因型塔卡1杂合父母。无纯合子突变小鼠(Tak1型米/米)得分，表明塔卡1基因导致胚胎死亡(表1). E8.5和E9.5之间的所有胚胎均根据孟德尔期望值进行评分，而在E11.5，所有纯合子突变胚胎均已死亡并被吸收，并且经常观察到空蜕膜(表1). 因此，这些结果表明Tak1型突变胚胎在E10左右开始死亡。大多数野生型胚胎和突变同窝卵在E9.0之前没有表现出任何明显的形态差异，之后突变胚胎在神经管中表现出严重的发育异常(图1D). 在E9.5，大多数突变胚胎小于野生型和杂合胚胎，在E10和E10.5，头褶和神经管呈波浪状，在突变胚胎中不闭合(图1E). E10.5后，胚胎结构在1塔卡突变体。有趣的是1塔卡胚胎与选项卡1（心血管和肺形态发生异常）和选项卡2（肝脏变性和凋亡）突变胚胎(表2;小松等人，2002年;Sanjo等人，2003年). 突变胚胎的表型表明，TAK1复合物不仅作为单个单位发挥作用，而且每个成分在发育过程中都有不同的作用。

表1。

衍生后代的基因型1塔卡杂合父母

1塔卡+/+1塔卡+/-1塔卡-/-
E8.5段275222
公式9.5173413
E10.5级13289 (3)一
图11.516385 (5)
图12.521531（1）
图13.515370
新生儿46810
一死亡胚胎的数量在括号中标明。

表2。

的表型比较Tak1、Tab1、，和选项卡2突变胚胎

Tak1型-/-选项卡1-/-b条选项卡2-/-c（c）
E14.5普遍表达（在神经系统、肾脏、肠道、睾丸、肝脏、肺和胰腺中强烈表达）一通过胚胎发生实现普遍表达普遍表达（在心脏和肝脏中强烈表达）
E10左右的胚胎致死率妊娠晚期胚胎致死E12.5左右的胚胎致死率
神经折叠畸形心血管和肺形态异常肝脏变性与凋亡

TNF-α和IL-1信号通路中NF-κB和JNK激活需要TAK1，而不是TAB1或TAB2

尽管进行了多次尝试，但我们无法从TAK1m/m胚胎中培养胚胎成纤维细胞，以获得足够的细胞用于研究。因此，为了分析TAK1在炎症信号通路中的功能，我们从E9.75野生型中生成永生化胚胎成纤维细胞(1塔卡+/+)，杂合子(1塔卡+/米)，和纯合突变体(塔克米/米)稳定转染线性化SV40大T抗原质粒的胚胎(小林等，2005年). 抗TAK1抗体的免疫印迹分析表明内源性TAK1在1塔卡+/+和1塔卡+/米单元格，但不是1塔卡米/米单元格（未显示数据）。

为了解决TAK1复合物（包括TAK1、TAB1和TAB2）是NF-κB和JNK激活所必需的假设，我们通过荧光素酶分析测试了TAK1复合体每个成员在TNF-α和IL-1信号通路中的需求。用NF-κB和AP-1反应性荧光素酶报告子转染细胞，并用TNF-α或IL-1刺激细胞(图2A、B). α和IL-1激活后，表1-/-和选项卡2-/-细胞表现出野生型或更高水平的NF-κB和AP-1，而在1塔卡米/米细胞。这与体外实验一致，体外实验表明激酶激活TAK1突变体（TAK1-DN）的过度表达以剂量依赖性的方式抑制了TNF-α和IL-1诱导的NF-κB活化（补充图S1A，B）。有趣的是，选项卡2-/-细胞显示到AP-1和NF-κB的信号量都有少量但可重复的增加。我们还分别用IκBα和磷酸化JNK1/2特异性抗体通过免疫印迹检测了TNF-α和IL-1诱导的NF-κB和JNK活化(图2C、D). 在野生型中，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞、IκBα降解和JNK磷酸化正常发生，在对TNF-α和IL-1的反应中于15分钟达到峰值。相反，在没有TAK1 IκBα降解和JNK磷酸化的情况下，TNF-α和IL-1刺激显著降低。此外，TNF-α或IL-1刺激后c-Jun的磷酸化和核移位在野生型细胞中正常发生，而1塔卡米/米细胞表现出受损的c-Jun激活(图2E). 接下来，我们使用电泳迁移凝胶位移分析（EMSA）分析TNF-α和IL-1刺激后NF-κB DNA结合活性(图2 F、G). 野生型，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞对TNF-α和IL-1的反应表现出类似的NF-κB DNA结合活性，而1塔卡米/米TNF-α诱导的结合活性被完全消除，IL-1诱导的活性部分降低。与萤光素酶分析一致，选项卡2-/-与野生型或选项卡1-/-这意味着TAB2负调控NF-κB的活化。因此，这些结果提供了基因证据，证明在TNF-α和IL-1信号通路中NF-κB和JNK激活需要TAK1，而不是TAB1或TAB2。

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TAK1缺乏通过TNF-α和IL-1抑制NF-κB和JNK的激活。(A、 B)野生型（WT），1塔卡米/米（TAK1），选项卡1-/-（表1），以及选项卡2-/-用pBIIx-luc转染（TAB2）细胞(左边)或AP1-luc(正确的)记者与雷尼利亚荧光素酶载体。转染后24小时，用TNF-α（10 ng/mL；A类)或IL-1（10 ng/mL；B类)5h后分析荧光素酶活性。结果表示为荧光素酶活性相对于未处理细胞的折叠诱导。误差线表示标准偏差。(C、 D类)TNF-α对IκB-α的降解和JNK磷酸化(C类)或IL-1(D类)分别用IκB-α和磷酸化JNK特异性抗体进行免疫印迹分析。用抗GAPDH4抗体进行免疫印迹，作为负荷对照。(E类)用TNF-α（10 ng/mL；顶部)或IL-1（10 ng/mL；底部)在指定的时间内，制备核提取物并用抗磷c-Jun抗体进行免疫印迹。用抗HDAC1抗体进行免疫印迹，作为负荷对照。(F、 G公司)用TNF-α（10 ng/mL；E类)或IL-1（10 ng/mL；F类)按照指定的时间制备核提取物。用EMSA分析NF-κB DNA结合活性。

TLR介导的信号通路中NF-κB和JNK的激活需要TAK1，而不是TAB1或TAB2

先前的研究报告称，TAK1在LPS信号传递过程中调节多种蛋白激酶的激活起着关键作用(Lee等人，2000年). 因此，我们检测了TAK1复合物在TLR4介导的信号传导中的功能。由于所有细胞对LPS的反应都很弱，我们将CD4/TLR4（一种显性活性TLR4嵌合体）与NF-κBor AP-1反应性荧光素酶报告子构建物共转染。使用此系统，野生型，选项卡1-/-、和表2-/-细胞表现出类似程度的NF-κB和AP-1活化，而在1塔卡米/米NF-κB活化部分降低，AP-1活化显著降低(图3A). 相比之下，野生型IRF3激活基本上保持不变，1塔卡米/米,选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞。因此，这些结果表明，在TLR4介导的信号中，AP-1激活需要TAK1，而IRF3激活不需要TAB1或TAB2。有趣的是，我们的体外实验表明，激酶非活性TAK1突变体（TAK1-DN）的过度表达以剂量依赖性的方式抑制CD4/TLR4对IRF3的激活。这意味着TAK1-DN的过度表达可能导致TLR4诱导的IRF3激活的非特异性抑制（补充图S1C，D）。接下来，我们使用电泳迁移率凝胶位移法分析LPS诱导的NF-κB DNA结合活性。如所示图3B，在野生型中观察到类似的结合活性，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞对脂多糖的反应。然而，与TNF-α和IL-1信号相比，1塔卡米/米细胞对脂多糖的反应仅表现出DNA结合活性的轻微下降。为了检测TAK1复合物在LPS诱导的JNK激活中的功能，我们用抗磷酸化JNK1/2抗体进行免疫印迹(图3C). LPS刺激后JNK磷酸化在野生型中正常发生，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞，而在1塔卡米/米细胞。因此，这些结果表明，虽然TLR4介导的信号通路中JNK激活需要TAK1，而不是TAB1或TAB2，但它仅部分需要NF-κB激活以响应LPS。

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TLR介导的NF-κB和JNK活化在1塔卡米/米细胞。(A类)野生型，1塔卡米/米,选项卡1-/-、和表2-/-将细胞与CD4/TLR4共转染雷尼利亚荧光素酶载体以及pBIIx-luc(左边)，AP1-luc(中间的)，或IRF3-luc(正确的)记者。转染后24小时，对细胞进行裂解并分析荧光素酶活性。结果表示为荧光素酶活性相对于未处理细胞的折叠变化。(B类)用LPS（1μg/mL）处理细胞指定时间，制备核提取物，并用EMSA分析NF-κB DNA结合活性。(C类)用抗磷酸JNK抗体免疫印迹分析LPS诱导的JNK磷酸化。用抗GAPDH4抗体进行免疫印迹以控制凝胶负载。(D类)用pBIIx-luc转染细胞(左边)或IRF3-luc(正确的)记者与雷尼利亚荧光素酶载体。转染后24小时，用poly（I:C）（5μg/mL）处理细胞，荧光素酶活性分析如下：A类. (E类)分别用抗IκB-α抗体和抗磷酸JNK抗体免疫印迹分析聚（I:C）诱导的IκBα降解和JNK磷酸化。用抗GAPDH4抗体进行免疫印迹以控制凝胶负载。

为了评估LPS信号中对TAK1的部分依赖性是否是由于TLR4下游信号通过MyD88依赖性和使用适配器TRIF和TRAM的独立通路的不同性质所致，我们检查了TAK1在TLR信号传递中的作用，TLR对NF-κB的激活路径更为线性。聚（I:C）连接TLR3导致TAK1通过TRIF–TRAF6激活(Sato等人，2003年)随后NF-κB激活(Jiang等人，2003年). 然而，通过TLR3激活IRF3不需要激活TAK1(Jiang等人，2004年). 因此，我们使用荧光素酶报告检测分析了TLR3介导的NF-κB和IRF3激活(图3D). 野生型，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞对poly（I:C）的反应通常诱导NF-κB和IRF3活化；然而，在1塔卡米/米多聚（I:C）刺激后NF-κB的活化显著降低，尽管IRF3的活化基本上完好无损。这与体外实验一致，体外实验表明TAK1-DN的过度表达以剂量依赖性的方式抑制poly（I:C）诱导的NF-κB激活，但不抑制IRF3激活（补充图S1E，F）。因此，这些结果表明，TLR3介导的NF-κB活化需要TAK1，而不是TAB1或TAB2，而IRF3活化则不需要。接下来，我们使用针对IκBα和磷酸化JNK1/2的抗体进行免疫印迹分析，分别分析聚（I:C）诱导的NF-κB和JNK活化(图3E). 在野生型中，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞，IκBα降解发生在用poly（I:C）诱导15分钟后，然而，在1塔卡米/米细胞。因此，这些结果表明TAK1，而不是TAB1或TAB2通过TLR3在早期NF-κB激活中发挥作用。令人惊讶的是，1塔卡米/米，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞对poly（I:C）均表现出延迟的JNK磷酸化。因此，这些结果表明，在TLR3介导的信号通路中，NF-κB活化需要TAK1，而不是TAB1或TAB2，而JNK活化和IRF3活化则不需要TAB1。综上所述，TAK1在TLR3和TLR4的信号传导中起着不同的作用，这可能反映了这些受体产生的通路的复杂性。

1塔卡米/米细胞对TNF高度敏感-α-诱导细胞凋亡

TNF-α刺激后NF-κB的激活保护细胞免受TNF-β诱导的凋亡(1996年贝格和巴尔的摩;Van Antwerp等人，1996年). 在p65、IKKβ和NEMO/IKKγ缺陷的MEF中，NF-κB活化缺陷增加了它们对TNF-α诱导的凋亡的敏感性(Beg等人，1995年;Tanaka等人，1999年;鲁道夫等人，2000年). 为了检测TAK1复合物每个成员的丢失是否影响TNF-α诱导的凋亡，我们用TNF-β处理细胞8小时，并用Annexin-V和PI染色分析细胞死亡(图4A). 与我们对NF-κB活化的分析一致，TNF-α单独在野生型中没有诱导任何凋亡，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞，而1塔卡米/米细胞对TNF-α诱导的凋亡高度敏感。与此结果一致，抗Caspase 8抗体的免疫印迹分析表明，TNF-α诱导前天冬氨酸酶8（55KD）裂解为活性Caspase-8（43KD塔卡1米/米细胞但不是野生型，表1-/-、和选项卡2-/-单元格(图4B). 因此，这些结果表明TNF-α可诱导细胞凋亡1塔卡米/米细胞通过Caspase 8激活。为了研究TNF-α诱导细胞凋亡的动力学1塔卡米/米细胞，我们处理野生型，第65页-/-、和1塔卡-/-用Annexin-V和PI染色分析多个时间点的细胞死亡。如所示图4C，野生型细胞对TNF-α诱导的凋亡具有抵抗力，而两者第65页-/-和1塔卡-/-细胞对TNF-α诱导的凋亡高度敏感。有趣的是，1塔卡米/米细胞对TNF-α诱导的凋亡的敏感性高于第65页-/-细胞。最近的研究报道，TAK1对IAP介导的JNK1激活的调节至关重要，JNK1-激活在保护细胞免受TNF-α诱导的凋亡中起作用(Sanna等人，2002年). 此外，JNK/JunD通路在TNFα刺激后与NF-κB协同传递生存信号。然而，在缺乏NF-κB激活的情况下，JNK途径介导对TNFα的促凋亡信号(Lamb等人，2003年). 因此，我们的结果表明，由于NF-κB和JNK激活缺陷，TAK1缺失增加了对TNF-α诱导的凋亡的敏感性。接下来，我们测试了TAK1蛋白的外源性表达是否可以拯救1塔卡米/米单元格(图4D). 用GFP与pcDNA3或野生型TAK1（TAK1-WT）共同转染细胞，并用TNF-α处理4小时，1塔卡米/米表达pcDNA3的细胞发生TNF-α诱导的凋亡；然而，表达外源性TAK1蛋白的细胞对凋亡具有抵抗力。因此，外源性TAK1表达恢复了对TNF-α诱导的凋亡的抵抗Tak1型米/米细胞。

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1塔卡米/米细胞对TNF-α诱导的凋亡高度敏感。(A类)野生型（WT），1塔卡米/米，选项卡1-/-、和选项卡2-/-用TNF-α（10 ng/mL）处理细胞8 h。通过FITC-Annexin V染色和碘化丙啶（PI）染色分析细胞凋亡。给出的数据是PI和Annexin V染色阳性的细胞百分比(B类)用TNF-α刺激细胞达到指定时间，裂解并用抗caspase 8抗体进行免疫印迹。用抗GAPDH4抗体进行免疫印迹以控制凝胶负载。(C类)野生型，第65页-/-和1塔卡米/米用TNF-α（10 ng/mL）处理细胞达到指定时间。通过FITC-Annexin V和碘化丙啶（PI）染色分析细胞凋亡A类. (D类)将GFP表达载体与pcDNA3或HA标记的野生型TAK1（TAK1-WT）一起转染细胞。转染后24小时，用TNF-α（10 ng/mL）处理细胞4小时，并用荧光显微镜进行分析。

TAK1在TNFα和IL-1/TLR信号通路中作用于IKK复合体上游和RIP1–TRAF2和MyD88–IRAK1–TRAF6下游

激活IKK复合物对于各种炎症细胞因子激活NF-κB至关重要(海登和戈什2004). 因此，我们使用体外激酶检测分析了TNF-α和IL-1诱导的IKK激活(图5A). 在野生型中，选项卡1-/-、和选项卡2-/-IKK复合物在TNF-α诱导后15分钟活性达到峰值，而在1塔卡米/米细胞。在野生型中，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞，IL-1诱导的IKK复合物激活正常，在诱导后30分钟达到峰值；然而，IKK复合物激活在1塔卡米/米细胞。与这些结果一致的是，用NF-κB反应的报告子进行的萤光素酶分析显示，塔卡1米/米,选项卡1-/-、和选项卡2-/-通过过度表达IKKβ-SSEE（一种显性活性突变体），所有细胞都表现出类似程度的NF-κB活化(图5B). 因此，这些结果表明，TAK1在IKK复合物上游通过TNF-α或IL-1激活NF-κB中发挥作用，并且TAK1破坏了IKK复合体的表达1塔卡该基因不影响IKK复合物下游NF-κB的信号传导。接下来，我们研究了TNF-α或IL-1对IKK复合物磷酸化中TAK1的需求(图5C). 抗磷酸化IKKα/β抗体的免疫印迹分析表明，在TNF-α或IL-1刺激后，IKKβ的磷酸化正常发生，在野生型细胞中在15-30分钟达到峰值，而在1塔卡米/米TNF-α诱导的磷酸化显著降低，IL-1诱导的磷酸化度轻度降低。因此，这些结果表明，TAK1在调节TNF-α和IL-1信号通路中IKK复合物的激活方面起着不同的作用。总之，TAK1在IKK复合物上游发挥作用，其中TAK1介导TNF-α和IL-1信号通路中IKK复合体的磷酸化和活化。

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TAK1是TNF-和IL-1诱导的IKK激活所必需的。(A类)野生型（WT），1塔卡米/米，选项卡1-/-、和选项卡2-/-用TNF-α（10 ng/mL；顶部)或IL-1（10 ng/mL；底部)在指定的时间内。使用GST-IκB-α底物，通过体外激酶测定分析IKK活性。蛋白质输入通过IKKα和Nemo特异性抗体的免疫印迹分析进行分析。(B类)将pcDNA3或IKKβ（SSEE）与pBIIx-luc和雷尼利亚荧光素酶载体。通过萤光素酶测定分析NF-κB活性，并与未处理的对照相比以倍数变化表示。(C类)野生型（WT）和1塔卡米/米用TNF-α（10 ng/mL；顶部)或IL-1（10 ng/mL；底部)然后用抗磷酸IKKα/β抗体进行免疫印迹。用抗IKKα抗体进行免疫印迹分析作为对照。(D类)将HA-IKKβ与pcDNA3、Flag标记的TRAF2或RIP1表达载体一起转染细胞。转染24 h后取细胞，用抗HA抗体和蛋白A琼脂糖免疫沉淀细胞。通过体外激酶测定分析IKKβ激酶活性A类.(E类)用HA-IKKβ表达载体和pcDNA3、标记TRAF6或MyD88表达载体转染细胞。转染24 h后采集细胞，用抗HA抗体和蛋白A琼脂糖免疫沉淀IKKβ。体外激酶分析法检测IKKβ活性。(F类)用IL-1（10 ng/mL）处理细胞指定时间，然后用抗IRAK1抗体进行免疫印迹。用抗GAPDH4抗体进行免疫印迹以控制凝胶负载。(克)野生型和1塔卡米/米将Flag-IKKβ表达载体与pcDNA3或HA标记的野生型TAK1（HA-TAK1-WT）一起转染细胞。24 h后用TNF-α（10 ng/L）或IL-1（10 ng/mL）刺激细胞20 min，裂解，并用体外激酶分析免疫沉淀IKKβ激酶活性。

在TNF-α信号通路中，RIP1和TRAF2分别是IKK复合体激活和IKK复合物向TNFRI受体复合体募集所必需的(Devin等人，2000年;Chen和Goeddel 2002). 为了测试TRAF2或RIP1介导的IKK复合物激活是否需要TAK1，野生型和1塔卡米/米用HA标记的IKKβ和pcDNA3、标记的TRAF2或RIP1转染细胞(图5D). 体外激酶分析表明，野生型细胞在TRAF2或RIP1的存在下表现出IKK复合物激活，而TRAF2和RIP1诱导的IKK复合体激活在1塔卡米/米细胞。因此，该结果表明，从TRAF2和RIP1向IKK复合体发送信号需要TAK1。鉴于MyD88、IRAK1/4和TRAF6是IL-1R和TLR信号通路的关键调节器(武田和亚基拉2005)接下来，我们在野生型和1塔卡米/米单元格(图5E). 用HA标记的IKKβ和pcDNA3、标记的MyD88或TRAF6转染细胞，通过体外激酶分析IKK复合物的活性。正如预期的那样，MyD88或TRAF6的表达诱导了野生型细胞中IKK复合体的激活，而塔卡1米/米细胞表现出IKK复合物的活化受损。此外，用抗IRAK1抗体进行的免疫印迹分析显示，IL-1诱导的IRAK1降解在野生型和塔卡1米/米单元格(图5F). 因此，这些结果表明，在IL-1信号通路中，TAK1是从MyD88或TRAF6向IKK复合物发送信号所必需的，而不是IRAK降解所必需的。因此，这些结果表明TAK1在TNFR1和IL-1R/TLR介导的信号通路中分别从TRAF2–RIP1和MyD88–TRAF6–IRAK1介导IKK复合物激活中发挥作用。

检测TAK1蛋白的外源性表达是否可以恢复IKK活性1塔卡米/米细胞，野生型和1塔卡米/米用标记的IKKβ和pcDNA3或HA标记的野生型TAK1转染细胞(图5G). 体外激酶分析表明1塔卡米/米表达外源性TAK1蛋白的细胞在TNF-α或IL-1的作用下表现出IKK复合体激活，而表达pcDNA3的细胞中IKK复合物激活受损。因此，外源性TAK1表达恢复了TNF-α或IL-1信号通路中IKK复合体的活性。综上所述，TAK1在IKK复合物上游作为IKK激酶发挥作用，在TRAF2–RIP1和MyD88–TRAF6–IRAK1下游发挥作用。因此，TAK1通过受体复合物介导IKK复合物激活，包括TNF-α和IL-1诱导的信号通路中的TRAF2–RIP1和MyD88–TRAF6–IRAK1。

由于ERK和p38 MAP激酶是TNFR1和IL-1R/TLR介导的信号通路中必不可少的下游分子(Baud和Karin 2001;武田和亚基拉2005)，我们使用磷酸化ERK1/2和磷酸化p38 MAP激酶特异性抗体通过免疫印迹分析ERK和p38 MAP-激酶激活的动力学（补充图S2A，B）。野生型和1塔卡米/米在TNF-α的作用下，细胞均表现出ERK和p38 MAP激酶的磷酸化，尽管p38 MAP激酶的磷酸化酶在肿瘤坏死因子α作用下略有降低Tak1型米/米细胞。相反，在1塔卡米/米与ERK和p38磷酸化正常发生的野生型细胞相比，IL-1刺激后ERK磷酸化延迟，p38磷酸化度严重受损。因此，这些结果表明TAK1在调节TNF-α和IL-1诱导的信号通路中ERK和p38 MAP激酶的激活方面起着不同的作用。

LT-β信号通路中的选择性NF-κB激活不需要TAK1

在另一种NF-κB激活途径中，IKKα同源二聚体通过NF-κB诱导激酶（NIK）被激活，以响应细胞因子，如LT-β、BAFF和CD40(Dejardin等人，2002年;Derudder等人，2003年). 活化的IKKα反过来磷酸化NF-κB p100蛋白并诱导其加工成成熟的p52亚单位(Xiao等人，2004年). 最后，含有p52的异二聚体，尤其是p52:RelB，易位到细胞核并驱动NF-κB靶基因子集的表达(Xiao等人，2001年;Bonizzi和Karin，2004年;海登和戈什2004). 为了检测TAK1在NF-κB替代途径中的作用，我们对野生型和塔卡1米/米TNF-α或LT-β细胞，并使用荧光素酶报告分析NF-κB应答基因表达(图6A). 正如预期的那样，TNF-α诱导的NF-κB激活在野生型细胞中正常发生，但在1塔卡米/米细胞。相反，野生型和1塔卡米/米细胞对LT-β的反应显示出类似程度的NF-κB激活，表明在缺乏TAK1的情况下，LT-β诱导的NF-kb B激活是正常的。NIK过度表达引起的NF-κB活化在1塔卡米/米细胞，相对于野生型细胞(图6B)这与之前的报道一致，NIK过度表达强烈诱导经典和替代NF-κB活化途径(Malinin等人，1997年;Woronicz等人，1997年). 因此，这些结果表明，在LT-β信号通路中，TAK1介导NIK信号传导至经典NF-κB激活通路，但不参与替代NF-κ）B通路的激活。为了进一步验证这一假设，我们在多个时间点用LT-β处理细胞，并用抗p100抗体进行免疫印迹(图6C). 野生型和1塔卡米/米在对LT-β的反应中，两种细胞都表现出了相似程度的p100加工诱导作用，这表明LT-β诱导的p100处理在1塔卡米/米细胞。因此，TAK1不参与替代NF-κB途径中IKKα的激活。

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LT-β诱导的NF-κB活化在塔卡1米/米细胞。(A类)野生型（WT）和塔卡1米/米用pBIIx-luc报告基因转染细胞雷尼利亚荧光素酶载体。转染后24小时，分别用TNF-α（10 ng/mL）或抗-LT-βR抗体（2μg/mL）处理细胞5或12 h，然后分析荧光素酶活性。结果表示为荧光素酶活性相对于未处理细胞的倍数变化。(B类)用pcDNA3或NIK表达载体以及pBIIx-luc报告子转染细胞雷尼利亚荧光素酶载体。荧光素酶法检测NF-κB活性。(C类)用抗-LT-βR抗体（2μg/mL）刺激细胞指定时间，然后用抗p100抗体进行免疫印迹。用抗GAPDH4抗体免疫印迹法分析蛋白质含量。

TAK1复合物在TGF-β信号通路中的作用

TAK1最初被确定为TGF-β信号转导的关键调节因子，据信，它通过BMP信号传导参与中胚层诱导和模式化爪蟾早期开发(Yamaguchi等人，1995年;涉谷等人，1998年). 为了研究TAK1复合物的每个成员在TGF-β信号传导中的作用，我们利用荧光素酶报告子分析了TGF-？、NF-κB和AP-1应答基因诱导对TGF-(图7A). 在缺乏TAK1的情况下，TGF-β诱导的NF-κB和AP-1活化受到损害，尽管野生型通常会在TGF-，选项卡1-/-、和选项卡2-/-细胞。与这些结果一致，JNK磷酸化在1塔卡米/米细胞相对于野生型，选项卡1-/-、和选项卡2-/-磷酸化正常发生的细胞(图7B). 有趣的是，野生型，1塔卡米/米、和选项卡2-/-细胞对TGF-β的反应均表现出正常的基因表达，而在表1-/-细胞。因此，这些结果表明，在TGF-β诱导的信号通路中，TAK1是NF-κB和JNK激活所必需的，但不是基因诱导所必需的，TAB1是基因诱导所必需的，但不是NF-κB和JNK激活所必需的，TAB2不是基因诱导或NF-κB和JNK激活所必需的。这意味着TAK1和TAB1，而不是TAB2在TGFβ信号通路中发挥不同的作用。接下来，我们通过免疫印迹和抗磷酸Smad2抗体免疫染色来检测TGFβ诱导的Smad2激活(图7B、C). TAK1、TAB1或TAB2的缺失不会影响TGF-β刺激后Smad2的磷酸化或核移位。这表明，TAK1复合物对TGF-β诱导的Smad2激活不是必需的，这是经典的TGF-α信号通路。综上所述，这些结果表明TAK1复合物的每个成员在TGF-β信号通路中发挥不同的作用。TAB1是有效诱导TGFβ应答报告子所必需的，TAK1是TGFβ诱导的NF-κB所必需的。TAB2中AP-1的激活和缺失似乎不会影响TGFβ信号传导。

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TAK1复合物在TGF-β信号通路中的作用。(A类)野生型，1塔卡米/米,选项卡1-/-、和选项卡2-/-用3TP-lux转染细胞(左边)，AP-1-luc(中间的)，或pBIIxluc(正确的)记者与雷尼利亚荧光素酶载体。转染后24小时，用TGF-β（1 ng/mL）处理细胞24小时，然后分析荧光素酶活性。结果表示为荧光素酶活性相对于未处理细胞的折叠诱导。(B类)分别用抗磷酸Smad2抗体和抗磷酸JNK抗体进行免疫印迹，分析TGF-β（1 ng/mL）对Smad2和JNK磷酸化的影响。用抗GAPDH4抗体进行免疫印迹分析作为对照。(C类)用TGF-β（1 ng/mL）刺激细胞20 min，用抗磷酸Smad2抗体染色，并用免疫荧光显微镜进行分析。

讨论

诱导转录因子AP-1和NF-κB是免疫和炎症反应多方面的关键介质，在受到促炎细胞因子、微生物产物和各种细胞应激源的刺激后被激活。多个受体，尤其是Toll/IL-1和TNF受体家族，已被证明能激活AP-1和NF-κB，IKK复合体和JNK的激活被认为是导致NF-κ的信号通路的汇合点。然而，最近，蛋白激酶TAK1已成为这两种途径的潜在调节器，作为IKK激酶（IKKK）和JNK激酶（JNKK）作用于IKK和JNK的上游。该假设的最初支持来自多种体外实验，这些实验表明TAK1复合物（TAK1、TAB1和TAB2）与泛素化TRAF家族成员的相互作用导致TAK1激活，随后是IKK和JNK的激活。尽管TAK1复合物发挥这种作用的生化证据似乎有说服力，但几乎没有明确的遗传证据支持TAK1、TAB1和TAB2通过泛素依赖机制被激活的假设，并且TAK1复合物在哺乳动物细胞中的AP-1和NF-κB信号通路中起着如此重要的作用。

因此，为了研究TAK1的生物学作用，我们利用突变的基因陷阱产生了TAK1缺陷小鼠1塔卡西班牙(图1A;Stryke等人，2003年;Austin等人，2004年;Skarnes等人，2004年).Tak1型纯合突变胚胎在E10左右死亡，神经管发育异常，表明TAK1对早期胚胎发育至关重要(图1D、E). The phenotype of塔卡1胚胎与选项卡1和选项卡2-胚胎缺陷，因为选项卡1由于心血管和肺形态发生异常，突变胚胎在妊娠后期死亡，而选项卡2突变胚胎在E12.5左右死于肝脏变性和凋亡(小松等人，2002年;Sanjo等人，2003年). 这些结果进一步强调，TAK1具有一个或多个独立于衔接蛋白TAB1和TAB2的独特功能。

在NF-κB活化途径中，TAK1在TNF-α或IL-1刺激后与TRAF2或TRAF6和IKKα/β相互作用，通过RNA干扰减少TAK1抑制IL-1和TNF-β诱导的IKK活化(Takaesu等人，2003年). 在JNK激活途径中，TAK1直接与JNK1相互作用，激酶活性TAK1的表达抑制TNF-α诱导的JNK活化(Sanna等人，2002年). 虽然主要1塔卡米/米胚胎成纤维细胞无法培养，我们能够在缺乏TAK1的情况下生成SV40大T抗原转化的胚胎成纤维纤维细胞以分析信号(小林等，2005年). 我们已经发现，TAK1的缺失导致NF-κB和JNK应答报告基因表达、NFκB DNA结合活性、IκBα降解、IKK复合物激活和TNF-α信号通路中JNK磷酸化的缺陷。相反，TNF-α刺激后NF-κB和JNK的激活在选项卡1-/-和选项卡2-/-细胞。因此，这些结果表明，TNF-α信号通路中NF-κB和JNK激活需要TAK1，而不是TAB1或TAB2。此外，体外激酶测定1塔卡米/米细胞证明TAK1是从RIP1和TRAF2向IKK复合体发送信号所必需的(图5). 因此，TAK1是TRAF2–RIP1招募到TNFR1之间的关键功能中间产物(Devin等人，2000年;Chen和Goeddel 2002)以及IKK复合物的活化。NF-κB和JNK的激活在保护细胞免受TNF-α诱导的凋亡中发挥作用(1996年贝格和巴尔的摩;Van Antwerp等人，1996年;Lamb等人，2003年). 因此，1塔卡米/米细胞对凋亡高度敏感，与野生型相比，caspase 8激活水平升高，选项卡1-/-、和选项卡2-/-单元格(图4). 正如预期的那样，外源性TAK1表达可以修复1塔卡米/米TNF-α诱导细胞凋亡。先前的体外研究表明，TAK1衔接蛋白TAB1和TAB2对TAK1激活和TNF-α信号传导至关重要，与此相反，我们的结果表明，只有TAK1才需要TNF-β诱导的IKK激活和JNK磷酸化，从而在体内激活NF-κB和JNK。

体外研究表明，MyD88–IRAK1–IRAK4–TRAF6复合物通过TAB1和TAB2调节TAK1激活，从而导致IKK复合物和MKK6激活以响应IL-1(Wang等人，2001年;Jiang等人，2002年). 然而，当我们检测TAK1、TAB1和TAB2在IL-1信号通路中的作用时，只有TAK1缺陷才能消除IL-1诱导的NF-κB和JNK激活。有趣的是，IL-1刺激后的NF-κB DNA结合活性和IKK复合物活性在1塔卡米/米尽管在TNF-α和IL-1刺激后未观察到NF-κB反应性报告基因表达。对这种差异的一个可能解释是，胚胎成纤维细胞转染效率低，因此无法使用荧光素酶分析来区分TNFα后的完全缺失和IL-1后NF-κB活化的近完全缺失（通过生化分析检测到）。在体内，这些结果表明，尽管TAK1对IL-1和TNF-α诱导的JNK激活都至关重要，但IL-1诱导的IKK复合物和NF-κB激活对TAK1的需求并不完全。体外激酶分析表明，TAK1功能的需求位于IRAK–MyD88–TRAF6和IKK复合物的激活之间(图5). 考虑到TAK1缺陷导致延迟ERK激活和受损p38激活以响应IL-1的结果（补充图S2），TAK1可能作为MyD88–IRAK1–TRAF6复合物到NF-κB、JNK、ERK和p38 MAP激酶途径的分支信号转导子(图8).

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显示TAK1复合物在炎症信号通路中作用的示意图模型。红线表示TAK1依赖性信号通路，而绿线表示TAK1非依赖性通路。

先前的研究表明，在LPS诱导的信号传导中，TAK1是IKK复合物和JNK激活所必需的(Lee等人，2000年). 然而，我们发现，虽然TAK1缺失消除了JNK应答的报告基因表达，但NF-κB DNA结合亲和力和报告基因表达仅部分降低(图3A-C). 或者，当TAK1活性受到DN-TAK1过度表达的干扰时，与先前公布的结果一致(Lee等人，2000年)，我们发现TLR4对NF-κB的激活被完全消除（补充图S1C）。LPS刺激后NF-κB和JNK的激活在选项卡1-/-和选项卡2-/-细胞；因此，LPS诱导的JNK激活需要TAK1，而不是TAB1或TAB2。这些结果表明，TAK1介导MyD88–IRAK–TRAF6复合物对NF-κB活化的信号传导，而TRAM介导的NF-κ的活化完全独立于TAK1。先前的观察表明，TAK1参与所有通向NF-κB的TLR4信号通路，这可能是由DN-TAK1结构过度表达诱导的非生理效应所致。与此假设一致，而1塔卡米/米细胞表现出正常的LPS诱导的IRF3激活，这依赖于TRIF，DN-TAK1的过度表达完全抑制NF-κB和IRF3的激活。我们对TLR3诱导的NF-κB活化的分析进一步支持TAK1在TLR信号传导中的选择性作用。在poly（I:C）刺激后，NF-κB活化需要TAK1，而IRF3活化不需要TAB1或TAB2。因此，TAK1，而不是适配器蛋白TAB1和TAB2，似乎在AP-1和经典NF-κB通路的炎症信号传导中发挥着重要作用。

近年来，两条NF-κB激活途径被认为在哺乳动物免疫反应的调节中发挥着不同的作用(Bonizzi和Karin 2004;海登和戈什2004). 在经典途径中，多种刺激，如促炎细胞因子TNF-α和IL-1、病原体相关分子模式（PAMPs）和抗原受体（即TcR和BcR）以IKKβ和NEMO依赖的方式诱导iκB的磷酸化和降解。所谓的替代途径反而依赖于IKKα。细胞因子，如LT-β、BAFF和CD40通过蛋白激酶NIK激活IKKα，激活的IKKβ反过来诱导NF-κB2/p100前体加工成成熟的p52，随后将含有p52的复合物移位到细胞核(Senftleben等人，2001年). 我们发现TAK1缺失并不影响NF-κB报告基因的表达或LT-β刺激后p100到p52的处理。有趣的是，NIK过度表达后NF-κB报告基因的表达激活了IKKα和IKKβ(Woronicz等人，1997年)，在年适度下降1塔卡米/米细胞。这些结果提出了一种有趣的可能性，即TAK1可能是NIK过度表达时发生的IKKβ激活所必需的，但TAK1不是NIK介导的IKK-α激活和LT-β信号p100处理所必需的。此外，这些结果强调了IKK复合物本身上游替代和经典NF-κB活化的独特要求，并表明TAK1和NIK可能在这两个信号通路中占据与IKKK类似的位置。

据报道，TAK1参与TGF-β诱导的爪蟾和哺乳动物细胞(涉谷等人，1996年;Yamaguchi等人，1995年). 为了测试TAK1复合物每个成员在TGF-β信号传导中的需求，我们使用NF-κB、JNK和TGF-？响应性报告物分析荧光素酶活性。有趣的是，TAB1是有效诱导TGFβ应答报告子所必需的，而TAK1是TGFβ诱导的NF-κB和AP-1激活所必需的。TAB2缺乏似乎不会影响TGFβ信号传导。然而，包括TAK1、TAB1和TAB2在内的TAK1复合物对TGFβ信号中Smad2的激活不是必需的。因此，这些结果表明，TAK1复合物的每个成员在TGF-β信号通路中调节NF-κB、JNK和Smad2活化方面发挥不同的作用(图8). TGF-β诱导的信号传导是否需要整个TAK1复合物，仍有待通过产生缺乏TAK1的细胞以及TAB1和TAB2来确定。

我们的研究得出的一个令人惊讶的结论是，在缺乏TAB1或TAB2的细胞中，对TNFα、IL-1、LPS和poly（I:C）信号传导没有任何影响。目前，单个敲除物的早期致死性阻止了对缺乏TAB1和TAB2的细胞进行信号分析。此外，最近将人类TAB3描述为TAB2同源物，进一步使TAB蛋白作用的遗传分析复杂化。小鼠TAB3基因尚未克隆，尽管正在努力敲除该基因。最近的一项研究报告称，为了观察TNF-α和IL-1对IKK和JNK激活的抑制，有必要使用RNA干扰下调TAB2和TAB3，这表明TAB2与TAB3可能在这些信号通路中发挥冗余作用(Cheung等人，2003年;Ishitani等人，2003年). 因此，很明显，有必要进行额外的分析，以确定TAB蛋白在调节TAK1活性中的确切作用。然而，在TAK1、TAB1和TAB2敲除物中观察到的不同发育表型强烈表明，这三种蛋白质并不总是作为复合物一起发挥作用。值得注意的是，只有TAB1的缺乏导致TGF-β诱导的基因表达显著减少，这再次强烈暗示了TAB1的独特作用，它不依赖于TAK1或其他TAB-蛋白。我们的结果也对广泛讨论的TAK1泛素依赖激活模型提出了质疑，其中TAB1被认为发挥着重要作用。虽然我们还无法从遗传学上解决泛素化在TAK1调节中的作用，但似乎还需要进行额外的研究，以充分阐明不同TAB蛋白如何调节TAK1的细节。

材料和方法

细胞和抗体

HEK 293（人肾胚胎细胞）和COS1（猴成纤维细胞）购自ATCC。HEK 293、COS1和永生化MEF细胞在含有7%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和5×10的DMEM培养基（GIBCO）中培养-5Mβ-巯基乙醇。使用的抗体是抗TAK1抗体(Ninomiya-Tsuji等人，1999年)、抗磷酸IKKα/β、抗磷酸c-Jun、抗磷酸Erk1/2、抗磷酸JNK1/2、抗JNK1/2、抗磷酸p38和抗磷酸Smad2（细胞信号）、抗IκBα（Santa Cruz，C21）和抗GAPDH4（研究诊断）。如图所示，用poly（I:C）和LPS（Sigma）、anti-LT-βR（Alexis Biochemicals）、rhTNF-α、mTGF-β和mIL-1β（R&D Systems）处理细胞。

的生成1塔卡米/米老鼠

1塔卡基因陷阱ES克隆（XB444）来自Williams Skarnes博士（BayGenomics）(Stryke等人，2003年;Skarnes等人，2004年). 这个塔卡1ES克隆被注射到C57BL/6囊胚中并转移到ICR雌性体内。雄性嵌合体小鼠与C57BL/6雌性小鼠交配，导致插入的等位基因传递到生殖系。阳性小鼠在129×C57BL/6混合背景下进行杂交和维持。

中小企业基金的产生

E9.75定时繁殖胚胎1塔卡-/-将小鼠从母体组织和Reichert膜中分离出来，用PBS清洗，并在37°C下用0.1%胶原酶（Sigma）和胰蛋白酶-EDTA（GIBCO）孵育30分钟。将细胞悬液置于含有补充有10%胎牛血清的DMEM的12孔板中。1塔卡米/米通过用TAK1抗体进行免疫印迹或使用胚胎外组织进行PCR来鉴定MEFs。使用FuGENE6用线性化的SV40大T抗原质粒稳定转染MEFs。

免疫荧光

为了进行免疫荧光分析，细胞生长在Alcian Blue-coated盖玻片上，用TGF-β（1 ng/mL）处理20 min，用PBS洗涤，在室温下用4%多聚甲醛固定30 min，并用渗透缓冲液渗透（0.05%皂苷，1%FBS，10 mM HEPES，PBS中10 mM甘氨酸，pH 7.5）在室温下保持30分钟。细胞在室温下与抗磷酸Smad2抗体孵育30分钟，然后在相同条件下与山羊抗兔-FITC孵育。

TNF诱导的细胞凋亡

MEF电池（3×105)在TNF-α刺激前24小时，以指定浓度在6厘米培养皿中播种一段时间。根据制造商的说明，在PBS中采集细胞，并与Annexin V-FITC和碘化丙啶（BD Pharmingen）孵育，然后用流式细胞仪进行分析。

荧光素酶报告试验

MEF电池（2.5×105)将生长在12孔板上的FuGENE 6与NF-κB依赖性报告基因构建物pBIIx-luc和雷尼利亚荧光素酶载体（Promega）。通过向DNA混合物中添加适当的空载体来保持每个实验中的总DNA浓度。转染后24小时，对细胞进行裂解，并使用双荧光素酶检测试剂盒（Promega）测量荧光素酶活性。用适当的表位特异性抗体通过免疫印迹法检测裂解物中转染蛋白的水平。

体外激酶测定

对于体外激酶分析，1×107如上文所述，使用FuGENE 6试剂，用各种DNA瞬时转染在10-cm培养皿上生长的MEF细胞。转染48小时后，将细胞在TNT裂解缓冲液中裂解30分钟。或者，将细胞未经处理或用TNF（10 ng/mL）和IL-1（10 ng/mL）处理，然后在TNT分解缓冲液中进行裂解。通过使用Bio-Rad蛋白质分析试剂盒（Bio-Rad）测定每个裂解液中的蛋白质量，然后在样品中进行归一化。使用抗Nemo抗体和蛋白G-Sepharose或抗Flag（M2）偶联琼脂糖珠在4°C下过夜，对裂解产物中的蛋白质进行免疫沉淀，并在TNT裂解缓冲液中洗涤沉淀，然后在激酶缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.5，20 mM MgCl）中洗涤沉淀21 mM EDTA、2 mM NaF、2 mM-甘油磷酸、1 mM二硫苏糖醇、10μM ATP）。沉淀在含有适当GST融合底物蛋白和10μCi的激酶缓冲液中在37°C下培养15分钟32P] ATP（Amersham Biosciences）。然后使用谷胱甘肽琼脂糖（Amersham Biosciences）沉淀底物，通过SDS-PAGE进行解析，并通过放射自显影术显示磷酸化蛋白。

胚胎半乳糖苷酶染色

如前所述进行β-半乳糖苷酶染色(Lawson等人，1999年).

致谢

我们感谢Williams Skarnes（BayGenomics）提供1塔卡米/米ES细胞。M.S.H.获得了NIH/国家普通医学科学研究所医学科学家培训拨款GM07205的支持。这项工作得到了NIH的资助（R37-AI33443）。

笔记

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1360605。

补充材料可在http://www.genesdev.org。

通讯作者。

电子邮件ude.elay@hsohg.raknaS公司; 传真：（203）737-1764。

工具书类

  • Austin C.P.、Battey J.F.、Bradley A.、Bucan M.、Capecchi M.、Collins F.S.、Dove W.F.、Duyk G.、Dymecki S.、Eppig J.T.等人，2004年。淘汰鼠标项目。自然遗传学。 36:921–924.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Baud V.和Karin，M.，2001年。肿瘤坏死因子及其相关因子的信号转导。趋势单元格。生物。 11:372–377. [公共医学][谷歌学者]
  • Beg A.A.和Baltimore，D.1996年。NF-κBin在预防TNF-α诱导的细胞死亡中起重要作用。科学类 274:782–784. [公共医学][谷歌学者]
  • Beg A.A.、Sha、W.C.、Bronson、R.T.、Ghosh、S.和Baltimore，D.1995年。缺乏NF-κB RelA组分的小鼠的胚胎致死率和肝脏变性。自然 376:167–170. [公共医学][谷歌学者]
  • Bonizzi G.和Karin，M.，2004年。两条NF-κB激活途径及其在先天性和适应性免疫中的作用。趋势。免疫学。 25:280–288. [公共医学][谷歌学者]
  • Boutros M.、Agaisse H.和Perrimon M.，2002年。果蝇先天免疫反应期间信号通路的顺序激活。开发单元 三:711–722. [公共医学][谷歌学者]
  • Chen G.和Goeddel，D.V.，2002年。TNF-R1信号传导：一条美丽的途径。科学类 296:1634–1635. [公共医学][谷歌学者]
  • Cheung P.C.、Campbell D.G.、Nebreda A.R.和Cohen P.，2003年。SAPK2a/p38α对蛋白激酶TAK1的反馈控制。EMBO J。 22:5793–5805.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dejardin E.、Dorin N.M.、Delhase M.、Hass E.、Cao Y.、Makris C.、Li Z-W.、Karin M.、Ware C.F.和Green D.R.，2002年。淋巴毒素-β受体通过两种NF-κB途径诱导不同模式的基因表达。免疫 17:525–535. [公共医学][谷歌学者]
  • Deng L.，Wang，C.，Spencer，E.，Yang，L.，Braun，A.，You，J.，Slaughter，C.，Pickart，C.和Chen，Z.J.2000。TRAF6激活IκB激酶复合物需要一个二聚泛素结合酶复合物和一个独特的多泛素链。单元格 103:351–361. [公共医学][谷歌学者]
  • Derudder E.、Dejardin E.、Pritchard，L.L.、Green，D.R.、Korner，M.和Baud，V.，2003年。RelB/p50二聚体受肿瘤坏死因子-α和淋巴毒素-β受体活化的差异调节。生物学杂志。化学。 278:23278–23284之间。[公共医学][谷歌学者]
  • Devin A.、Cook，A.、Lin，Y.、Rodriguez，Y.、Kelliher，M.和Liu，Z-G.2000。TRAF2和RIP在TNFR1激活IKK中的不同作用：TRAF2将IKK招募到TNF-R1，而RIP介导IKK激活。免疫 12:419–429. [公共医学][谷歌学者]
  • Hayden M.S.和Ghosh，S.2004年。NF-κB信号转导。基因与发育。 18:2195–2224. [公共医学][谷歌学者]
  • Ishitani T.、Takaesu G.、Ninomiya-Tsuji J.、Shibuya H.、Gaynor R.B.和Matsumoto K.，2003年。TAB2相关蛋白TAB3在IL-1和TNF信号传导中的作用。EMBO J。 22:6277–6288.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jadrich J.L.、O'Connor，M.B.和Coucouvanis，E.，2003年。小鼠胚胎发育过程中TGF-β和BMP信号传导介质TAK1的表达。基因表达。模式 三:131–134. [公共医学][谷歌学者]
  • Jiang Z.、Ninomiya-Tsuji，J.、Qina，Y.、Matsumoto，K.和Li，X.，2002年。白细胞介素-1（IL-1）受体相关激酶依赖的IL-1诱导的信号复合物磷酸化TAK1和TAB2位于质膜上，并激活胞浆中的TAK1。分子细胞。生物。 22:7158–7167.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jiang Z.、Zamanian-Daryoush，M.、Nie，H.、Silva，A.M.、Williams，B.R.G.和Li，X.，2003年。聚（dI-dC）诱导的toll样受体3（TLR3）介导的NF-κB和MAP激酶的激活是通过使用信号成分TLR3–TRAF6–TAK1–TAB2–PKR的白细胞介素-1受体相关激酶（IRAK）非依赖性途径实现的。生物学杂志。化学。 278:16713–16719. [公共医学][谷歌学者]
  • 蒋Z.，Mak，T.W.，Sen，G.，和Li，X.，2004年。Toll样受体3介导的NF-κB和IRF3激活在Toll-IL-1受体结构域适配器诱导IFN-β发生分化。程序。国家。阿卡德。科学。 101:3533–3538.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 小林石H.、田中N.、浅草H.、三浦S.、九尾M.、三村K.、石井N.和杉木K.，2005年。Hrs是哺乳动物囊泡运输和蛋白质分选的主分子，抑制ESCRT蛋白信号转导接合器分子1和2的降解。生物学杂志。化学。 280:10468–10477. [公共医学][谷歌学者]
  • 小松Y.、涩谷H.、武田N.、Ninomiya-Tsuji J.、Yasui T.、Miyado K.、Sekimoto T.、Ueno N.、Matsumoto K.和Yamada G.2002。Tab1基因的靶向性破坏会导致胚胎死亡以及心血管和肺形态发生缺陷。机械。开发。 119:239–249. [公共医学][谷歌学者]
  • Lamb J.A.、Ventura，J-J.、Hess，P.、Flavell，R.A.和Davis，R.J.，2003年。JunD通过JNK信号转导途径介导生存信号。摩尔细胞 11:1479–1489. [公共医学][谷歌学者]
  • Lawson K.A.、Dunn，N.R.、Roelen，B.A.J.、Zeinstra，L.M.、Davis，A.M.、Wright，C.V.E.、Korving，J.和Hogan，B.L.，1999年。在小鼠胚胎中生成原始生殖细胞需要Bmp4。程序。国家。阿卡德。科学。 13:424–436.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee J.、Mira-Arbibe，L.和Ulevitch，R.J.，2000年。TAK1调节细菌脂多糖激活的多个蛋白激酶级联。J.Leukoc的研究。生物。 68:909年至915年。[公共医学][谷歌学者]
  • Malinin N.L.、Boldin，M.P.、Kovalenko，A.V.和Wallach，D.1997年。MAP3K相关激酶参与TNF、CD95和IL-1诱导NF-κB。自然 385:540–544. [公共医学][谷歌学者]
  • Ninomiya-Tsuji J.、Kishimoto K.、Hiyama A.、Inoue J.、Cao Z.和Matsumoto K.1999。激酶TAK1可以激活IL-1信号通路中的NIK-IκB和MAP激酶级联。自然 398:252–256. [公共医学][谷歌学者]
  • Park J.M.、Brady H.、Ruocco M.G.、Sun H.、Williams D.、Lee S.J.、Kato Jr.、T.、Richards N.、Chan K.、Mercurio F.等人，2004年。NF-κB蛋白Relish靶向TAK1调节JNK介导的免疫应答果蝇属.基因与发育。 18:584–594.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 鲁道夫·D、叶·W·C·、韦克汉姆·A·、鲁道夫·B·、纳拉尼坦·D·、波特·J·、埃利亚·A·J·和马克·T·J·，2000年。NEFMO/IKKγ缺陷小鼠的严重肝变性和NF-κB活化不足。基因与发育。 14:854–862.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sanjo H.、Takeda K.、Tsujimura T.、Ninomiya-Tsuji J.、Matsumoto K.和Akira S.，2003年。TAB2对防止胎肝细胞凋亡至关重要，但对白细胞介素-1信号传导不起作用。分子细胞。生物。 23:1231–1238.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sanna M.G.、Correia J.S.、Ducrey O.、Lee J.、Nomoto K.、Schrantz N.、Deveraux Q.L.和Ulevitch R.J.，2002年。IAP抑制凋亡涉及不同的机制：TAK1/JNK1信号级联和caspase抑制。分子细胞。生物。 22:1754–1766.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sato S.、Sugiyama M.、Yamamoto M.、Watanabe Y.、Kawai T.、Takeda K.和Akira S.，2003年。诱导干扰素-β（TRIF）的Toll/IL-1受体结构域适配器与TNF受体相关因子6和TANK-binding激酶1相关，并激活Toll样受体信号中两种不同的转录因子NF-κB和IFN-调节因子-3。免疫学杂志。 171:4304–4310. [公共医学][谷歌学者]
  • Senftleben U.、Cao，Y.、Xiao，G.、Greten，F.R.、Krahn，G.和Bonnizi，G.，Chen，Y.，Hu，Y.和Fong，A.、Sun，S.C.等人，2001年。IKKα激活第二个进化保守的NF-κB信号通路。科学类 293:1495–1499. [公共医学][谷歌学者]
  • 涉谷H.、山口K.、白桦K.、通川A.、后藤Y.、上野N.、伊丽K.、西田E.和松本K.，1996年。TAB1：TGF信号转导中TAK1 MAPKKK的激活物。科学类 272:1179–1182. [公共医学][谷歌学者]
  • Shibuya H.、Iwata H.、Masuyama，N.、Gotoh，Y.、Yamaguchi，K.、Irie，K.、Matsumoto，K.、Nishida，E.和Ueno，N.1998年。TAK1和TAB1在早期BMP信号转导中的作用爪蟾发展。EMBO J。 17:1019–1028.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Silverman N.、Zhou，R.、Erlich，R.L.、Hunter，M.、Bernstein，E.、Schneider，D.和Maniatis，T.，2003年。NF-B和JNK的免疫激活需要果蝇属拍摄1。生物学杂志。化学 278:48928–48934之间。[公共医学][谷歌学者]
  • Skarnes W.C.、von Melchner，H.、Wurst，W.、Hicks，G.、Nord，R.S.、Cox，T.、Young，S.G.、Ruiz，P.、Soriano，P.、Tessier Lavigne，M.等人，2004年。用于小鼠功能基因组学的公共基因陷阱资源。自然遗传学。 36:543–544.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Song H.Y.、Regnier、C.H.、Kirschning、C.J.、Goeddel、D.V.和Rothe，M.，1997年。肿瘤坏死因子（TNF）介导的激酶级联：TNF受体相关因子2处核因子-B和c-jun N末端激酶（JNK/SAPK）通路的分支。程序。国家。阿卡德。科学。 94:9792–9796.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stryke D.，Kawamoto，M.，Huang，C.C.，Johns，S.J.，King，L.A.，Harper，C.A.，Meng，E.C.，Lee，R.E.，Yee，A.，L'Italien，L.等人，2003年。BayGenomics：小鼠胚胎干细胞插入突变资源。核酸研究。 31:278–281.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Takaesu G.、Kishida S.、Hiyama A.、Yamaguchi K.、Shibuya H.、Irie K.，Ninomiya-Tsuji J.和Matsumoto K.，2000年。TAB2是一种新的衔接蛋白，通过在IL-1信号转导途径中连接TAK1和TRAF6来介导TAK1 MAPKKK的激活。分子电池 5:649–658. [公共医学][谷歌学者]
  • Takaesu G.、Ninomiya-Tsuji J.、Kishida S.、Li X.、Stark G.R.和Matsumoto K.，2001年。白细胞介素-1（IL-1）受体相关激酶通过在IL-1信号通路中诱导TAB2易位而激活TAK1。分子细胞。生物。 21:2475–2484.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Takaesu G.、Surabhi R.M.、Park K.J.、Ninomiya-Tsuji J.、Matsumoto K.和Gaynor R.B.，2003年。TAK1对IκB激酶介导的NF-B通路激活至关重要。分子生物学杂志。 326:105–115. [公共医学][谷歌学者]
  • 武田K.和阿基拉S.，2005年。先天免疫中的Toll样受体。国际免疫学。 17:1–14. [公共医学][谷歌学者]
  • Tanaka M.、Fuentes M.E.、Yamaguchi K.、Durnin M.H.、Dallymple S.A.、Hardy K.L.和Goeddel D.V.，1999年。IKK-β缺陷小鼠的胚胎致死率、肝脏变性和NF-κB活化受损。免疫 10:421–429. [公共医学][谷歌学者]
  • Van Antwerp D.J.、Martin S.J.、Kafri T.、Green D.R.和Verma I.M.，1996年。NF-κB抑制TNF-α诱导的细胞凋亡。科学类 274:787–789. [公共医学][谷歌学者]
  • Vidal S.、Khush R.S.、Leulier F.、Tzou P.、Nakamura M.和Lemaitre B.，2001年。中的突变果蝇属dTAK1基因揭示了MAPKKs在控制rel/NFB依赖性先天免疫反应中的保守功能。基因与发育。 15:1900–1912.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 王C.，邓L.，洪M，。Akkaraju，G.R.、Inoue，J.和Chen，Z.J.，2001年。TAK1是MKK和IKK的泛素依赖性激酶。自然 412:346–351. [公共医学][谷歌学者]
  • Woronicz J.D.、Gao，X.、Cao，Z.、Rothe，M.和Goeddel，D.V.，1997年。IκB激酶-β：NF-κB活化以及与IκB激酶-α和NIK形成复合物。科学类 278:866–869页。[公共医学][谷歌学者]
  • Xiao G.，Harhaj，E.W.和Sun，S-C.2001。核因子-κB诱导激酶调节核因子κB2 p100的加工。分子电池 7:401–409. [公共医学][谷歌学者]
  • Xiao G，Fong，A.和Sun，S.C.2004年。NF-κB诱导激酶对p100加工的诱导涉及IκB激酶α（IKKα）与p100的对接以及IKKβ介导的磷酸化。生物学杂志。化学。 279:30099–30105. [公共医学][谷歌学者]
  • 山口K.、白桦K.、涉谷H.、伊丽K.、小石I.、上野N.、谷口T.、西田E.和松本K.，1995年。鉴定MAPKKK家族的一个成员作为TGF-β信号转导的潜在介质。科学类 270:2008–2011. [公共医学][谷歌学者]
文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社