监管秀丽隐杆线虫糖原合成酶激酶-3介导的氧化应激防御蛋白SKN-1

摘要

氧化应激是影响许多人类疾病的主要致病因素，包括糖尿病、动脉粥样硬化、癌症和衰老(1——6). 真核细胞通过诱导II期解毒基因的表达来应对氧化或外源性应激，该基因编码合成谷胱甘肽、清除自由基和I期（P450）系统解毒反应产物的酶(7——10). 这种解毒反应似乎从酵母到人类都是保守的。

在秀丽隐杆线虫，这种氧化应激反应由转录因子SKN-1调控(11). 在胚胎后阶段，SKN-1蛋白主要存在于ASI化学感觉神经元和消化系统（肠道）中。在ASI神经元中，SKN-1定位于细胞核并诱导II期基因表达。相反，在肠道中，需要氧化应激来引导SKN-1在细胞核中积聚并激活基因表达。这种肠道对氧化应激的反应是通过SKN-1的转录后调节介导的，可以在几分钟内发生，这表明它涉及到细胞质SKN-1池的重新定位。这个skn-1号机组突变体对氧化应激敏感，其寿命缩短了25-30%，表明SKN-1和这种氧化应激防御对于秀丽线虫。

SKN-1通过一种独特的单体机制与DNA结合，但与哺乳动物中的功能对等物——两种二聚体NF-E2相关因子（Nrf）碱性亮氨酸拉链蛋白（Nrf1和Nrf2）有关(12). 与SKN-1一样，Nrf1和Nrf2在细胞核中积累，以应对氧化应激，是抗氧化应激所必需的(7,10,13). 在没有应激的情况下，Nrf2被细胞质肌动蛋白结合蛋白Keap1结合并靶向降解(14——16)，在秀丽线虫Nrf蛋白的调节在其他方面尚不清楚，尽管某些细胞信号通路似乎参与其中(9)。

除了在胚胎后期调节这种古老的应激反应功能外，SKN-1还可以在早期胚胎中启动整个消化道的发育(17). 母体表达的SKN-1随后确定EMS卵裂球及其后代的命运，但通过以下方式阻止其不适当地确定不同细胞（C卵裂球）的命运糖原合成酶激酶-3（也称为sgg-1号机组)，的秀丽线虫哺乳动物直系糖原合成酶激酶-3α/β (18). 糖原合成酶激酶-3（GSK-3）在真核生物中广泛保守，最初被确定为糖原合成的调节器，但后来被证明可以控制多种额外的细胞功能(19,20). 在秀丽线虫，gsk-3影响C卵裂球分化独立于其在Wnt信号传导中的作用(18). 目前尚未确定GSK-3信号是直接作用于SKN-1蛋白还是通过不同的机制作用于SKN-1蛋白。

这里我们报告糖原合成酶激酶-3防止SKN-1在细胞核中积聚，并在胚胎后肠道中诱导II期基因表达。这种抑制通过SKN-1蛋白的GSK-3磷酸化介导。我们得出结论，GSK-3是Ⅱ期解毒反应的重要调节因子秀丽线虫也可能存在于其他生物体中。

材料和方法

菌株和RNA干扰（RNAi）。除非另有说明，否则以下菌株通过标准方法保持在20°C(21)：重量氮气（布里斯托尔实验室），氮气Is007[SKN-1:：GFP]，氮气Ex007[SKN-1:：GFP]，氮气Ex007[SKN-1:：GFP S74、340A]，第1季度(公里4)Is007[SKN-1:：GFP]，通用条款-1::gfp、gcs-1::绿色荧光粉Δ2、和通用条款-1::绿色荧光粉Δ2万立方米（gcs-1，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶）。RNAi实验是通过喂食参考文献中所述的蠕虫进行的。22.大多数鸡蛋由糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)蠕虫未能孵化，但许多逃避者已发育成成虫。这些F1逃逸子代用于SKN-1:：GFP定位和通用条款-1::绿色荧光粉参考文献中描述的诱导实验。11。

质粒构建和转基因。我们创建了SKN-1:：GFP突变结构（参见图2A类)使用QuikChange方法（Stratagene）。所有PCR均使用Pfu公司聚合酶（Stratagene）。除了T386A外，每个突变的转基因都保持了原来的内含子/外显子结构，T386A缺少内含子5，因为Thr-386是由外显子5和6的连接处编码的。如参考文献所述，通过将DNA注射到年轻成年动物体内生成转基因菌株。23SKN-1:：GFP突变结构体以10 ng/μl的剂量注射，同时角色-6100 ng/μl时的标记物（pRF4）。每个构造至少分析两个独立的染色体外系。使用蔡司AxioSKOP2显微镜和AxioCam冷却彩色数码相机采集微分干涉对比显微镜和荧光图像。为了区分肠道自体荧光和SKN-1:：GFP表观荧光，我们使用了三频带发射滤光片组（Chroma 61000）和窄带激发滤光片（484/14 nm），如参考文献所述。11这种组合可以检测到自荧光，即绿色和红色组合信号产生的黄色/橙色荧光，GFP保持绿色。

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图2。

预测的GSK-3磷酸化位点可防止SKN-1:：GFP在肠细胞核中的结构性积累。(A类)SKN-1编码区和突变转基因构建物。预测的编码区域用红色方框表示，未翻译的区域用蓝色方框表示，GFP用绿色方框表示。SKN-1中潜在的GSK-3位点由扫描岩程序（表1）(32). 这些预测的磷酸化残基和启动位点Ser-397（参见结果和讨论)分别用SKN-1:：GFP内的丙氨酸取代。(B类——E类)转基因动物分析。(B类)通过注射图中所示的转基因产生单个转基因系A类和记号笔一起角色-6（pRF4）。这些染色体外系根据肠细胞核中SKN-1的存在进行评分，如图1B类。WT中SKN-1:：GFP S393A线的核SKN-1：：GFP显著增加，但没有sek-1（km4)背景和SKN-1:：GFP S397A线。(C类——F类)代表性转基因动物的荧光图像如所示图1A类。

激酶测定。在在体外激酶分析，肽（如图3B类)在含有20 mM Tris（pH 7.5）、5 mM DTT、20 mM MgCl的缓冲液中与兔子GSK-3β（新英格兰生物实验室）孵育₂冷态200μM ATP和0.4μCi（1 Ci=37 GBq）[γ-³²P] ATP在30°C下保持1小时。添加100μg BSA和冷的20%三氯乙酸，在冰上培养，然后旋转，停止反应。在P81-磷纤维素圆盘（纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology）上发现上清液，用0.3%的磷酸冲洗数次，并在闪烁计数器中计数。

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图3。

通过GSK-3对SKN-1进行磷酸化。(A类)GSK-3磷酸化基序秀丽线虫SKN-1在哺乳动物Nrf1蛋白中保守。该基序具有三个预测的GSK-3位点，在结构上与β-catenin中的GSK-3目标基序相似，其中酪蛋白激酶1α在Ser-45启动磷酸化，然后在Thr-41、Ser-37和Ser-33启动GSK-3磷酸化(26). 预测的化合物GSK-3磷酸化基序也存在于哺乳动物Nrf2和同源果蝇属蛋白质CNC。每组保存的残留物均装箱。h、 人；m、 小鼠；r、 老鼠。(B类)GSK-3β对SKN-1 Ser-393的磷酸化作用在体外GSK-3β磷酸化所示SKN-1肽，前提是磷酸化丝氨酸存在于397位。这种磷酸化依赖于Ser-393的存在。将cpm纳入一个具有代表性的磷酸化分析中，并绘制图表。(C类)SKN-1与秀丽线虫GST-GSK-3融合蛋白在体外。

蛋白质相互作用实验。GST和全长GST的融合秀丽线虫GSK-3表达于大肠杆菌BL21并用谷胱甘肽-Sepharose 4B纯化。全长SKN-1已翻译在体外通过使用TNT SP6偶联的网织红细胞裂解物转录/翻译系统（Promega）并用[³⁵S] 蛋氨酸（Amersham Biosciences，现为GE Healthcare），如参考文献所述。11GST和GST–GSK-3固定在Sepharose珠上，并与这些网织红细胞裂解物在含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl和1%Triton X-100的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中在4°C下培养过夜。用含有274 mM NaCl、5.4 mM KCl和1%Triton X-100的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）清洗珠子15次。最后一次清洗后，用Novex Tris-glycine梯度凝胶（Invitrogen）对样品进行变性和分离，将其干燥并暴露在荧光成像仪（分子动力学）上。

抗氧化应激试验。SKN-1:：GFP、SKN-1::GFP S393A和角色-6染色体外阵列是从氮气背景到skn-1（zu67)(17)如参考文献中所述。11。skn-1（zu67)与携带显性Unc表型的DnT1平衡，因此skn-1号机组纯合子分离为WT。每个阵列都传递相应的SKN-1:：GFP转基因以及角色-6基本上在所有动物身上。在每种情况下，肠道中检测到的转基因SKN-1水平与注射的转基因DNA的原始量（2.5或10 ng/μ1）近似成比例。为了研究氧化应激的敏感性，年轻人被转移到含有6.2 mM的平板上t吨-线虫生长培养基琼脂中的丁基过氧化氢（Sigma）。蠕虫在20°C的温度下在这些平板上孵化，如果它们对用镐反复戳不起反应，则被记为死亡。P（P）值由Student的t吨使用Microsoft测试擅长。

结果和讨论

糖原合成酶激酶-3抑制SKN-1定位和靶基因诱导。为了研究GSK-3是否在胚胎后期抑制SKN-1，我们测试了糖原合成酶激酶-3是防止SKN-1在正常条件下定位于细胞核并激活肠内II期基因表达所必需的。什么时候？糖原合成酶激酶-3RNAi降低表达，最具渗透性的表型是胚胎致死性，涉及异常的C卵裂球分化和Wnt信号(18,24). 然而，有可能研究胚胎后期糖原合成酶激酶-3通过检查糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)完成胚胎发育并通常存活到成年的F1后代。

在这些糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)我们检测了一种先前描述的转基因蛋白的定位，其中全长SKN-1在其C末端与GFP融合(11). 在正常条件下，SKN-1:：GFP在肠细胞核中以低水平存在，如参考文献所示。11相反，在RNAi敲除糖原合成酶激酶-3但不是各种控制基因(图1A类和B类和数据未显示）。在ASI神经元中，SKN-1水平未受以下因素的影响糖原合成酶激酶-3然而，RNAi（数据未显示）。数据表明糖原合成酶激酶-3需要防止SKN-1在胚胎后肠道的组成性细胞核中积累。

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图1。

糖原合成酶激酶-3抑制SKN-1定位和SKN-1靶基因表达。(A类和B类)SKN-1定位于肠细胞核糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)没有压力的动物。氮气Is007[SKN-1:：GFP]，sek-1（km4)Is007[SKN-1:：GFP]，以及氮气将Ex[SKN-1:：GFP S74，340A]L4动物置于含有大肠杆菌HT115携带糖原合成酶激酶-3dsRNA或对照（L4440）喂食载体。然后将动物在20°C下孵育24小时，并允许产卵。如参考文献所述，将其存活后代作为L4幼虫和年轻成虫对SKN-1:：GFP在肠细胞核中的积累进行评分。11“高”表示所有肠细胞核中都存在强烈的SKN-1:：GFP信号，如gsk-3（RNAi)显示动物。“中等”是指细胞核SKN-1:：GFP在肠道前部或前部和后部高水平存在，但在肠道中段几乎无法检测到的动物。第1季度对a进行编码秀丽线虫p38 MAPK激酶，是肠道SKN-1功能所必需的（参见结果和讨论)(28). (C类和D类)通用条款-1::绿色荧光粉以组成形式表达gsk-3（RNAi)动物。糖原合成酶激酶-3RNAi是在gcs-1型::绿色荧光粉,通用条款-1::绿色荧光粉Δ2,和通用条款-1::绿色荧光粉Δ2个月3应变，如A类和B类，然后是肠道通用条款-1::绿色荧光粉对F1 L4幼虫和年轻成人的表达进行评分(11). “高”表示gcs-1型::绿色荧光粉出现在前部的高水平，在大部分肠道中都可以检测到，如糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)如图所示。“中等”指动物，其中通用条款-1::绿色荧光粉在前部和可能在后部出现高水平，但在两者之间未检测到。这个通用条款-1::绿色荧光粉对照图像中明显的荧光来自SKN-1非依赖性咽部表达(11). 在A类和C类，上部图像显示荧光，下部图像显示Nomarski成像，每个插图中显示了成对的肠道细胞核（箭头）。

在肠道中，SKN-1直接调节并需要表达通用条款-1，一个特征明确的II期基因和Nrf蛋白靶点(11). 酶编码通用条款-1是谷胱甘肽生物合成的速率限制。如参考文献所述。11在肠道中，一种转基因通用条款-1启动子区域与GFP相关(通用条款-1::绿色荧光粉)在氧化应激下高水平表达，但在正常条件下低水平表达(图1C类和D类和数据未显示）。相反，在糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)，动物肠道通用条款-1::绿色荧光粉在没有压力的情况下，表达显著提高(图1C类和D类)。糖原合成酶激酶-3RNAi同样导致gcs-1型::绿色荧光粉Δ2转基因，缺乏SKN-1独立的咽部表达（数据未显示），但没有通用条款-1::绿色荧光粉Δ2万立方米转基因，其启动子中一个关键的SKN-1结合位点发生突变(11)(图1D类). 该结果表明，需要SKN-1糖原合成酶激酶-3RNAi击倒增加通用条款-1::绿色荧光粉表达式。我们得出的结论是，在没有压力的情况下，糖原合成酶激酶-3阻止SKN-1在肠道中组成性诱导II期基因表达。

从肠道细胞核中排除SKN-1所需的GSK-3磷酸化位点。SKN-1氨基酸序列包括7个预测的潜在GSK-3磷酸化位点(图2A类和表1，发布为支持信息在PNAS网站上）。为了研究这些残基对SKN-1在肠道中的定位是否重要，我们将它们分别突变为丙氨酸(图2A类). 值得注意的是，SKN-1:：GFP S393A突变体在几乎所有受检动物的肠道细胞核中构成性定位(图2B类和D类)表明Ser-393对SKN-1调控至关重要，可能是功能关键的GSK-3位点。S432A突变适度增加了肠细胞核中SKN-1:：GFP的存在，但检测到的其他单个残基似乎都不影响SKN-1的定位(图2B类). Ser-393和Ser-432是SKN-1中预测最强烈的GSK-3位点（表1），支持它们可能是真正的GSK-2底物的观点。

GSK-3对底物的磷酸化通常取决于启动激酶的事先作用，启动激酶磷酸化位于GSK-3位点四个C位末端的氨基酸(图3A类)(19,25). 例如，在Ser-45通过酪蛋白激酶-1α启动β-连环蛋白的磷酸化，先于在Ser-41、Ser-37和Ser-33的GSK-3β磷酸化(图3A类)(26). 该模型预测，需要在Ser-397启动SKN-1的磷酸化，以使GSK-3磷酸化Ser-393，从而防止SKN-1定位于肠细胞核(图3A类). 因此，在在体外实验中，GSK-3强烈磷酸化了SKN-1肽，其中磷酸化丝氨酸存在于397位。当存在未磷酸化的Ser-397或Ser-393被丙氨酸取代时，GSK-3磷酸化被消除(图3B类). 进一步支持GSK-3直接针对SKN-1的观点，SKN-1强烈且明确地受到约束秀丽线虫GSK-3型在体外(图3C类)。

一种转基因SKN-1蛋白，其中Ser-397被丙氨酸取代（SKN-1:：GFP S397A），与SKN-1::GFP S393A在肠细胞核中的组成相似(图2B类和E类). 因此，GSK-3位点Ser-393及其预测的启动位点Ser-397都是防止SKN-1在无应激状态下积聚在肠细胞核中所必需的，有力地支持了GSK-3磷酸化并直接抑制SKN-1的观点体内有趣的是，哺乳动物Nrf1蛋白包含一个与包含Ser-393和Ser-397的SKN-1基序相关的序列(图3A类). 其他预测的GSK-3位点，包括类似的复合基序，存在于Nrf1、Nrf2和相关的果蝇属蛋白质CNC(图3A类和数据未显示）。这些序列的存在表明，GSK-3磷酸化也可能参与Nrf蛋白的调节，这是一种令人兴奋的可能性。

WT和组成核SKN-1对氧化应激具有相当的保护作用。我们之前展示过skn-1号机组突变体对氧化应激过敏，SKN-1:：GFP(图2A类)转基因可以挽救胚胎发育缺陷(11). 我们现在发现引入SKN-1:：GFP呈现skn-1号机组(zu67号)纯合子对氧化应激的抵抗力显著高于野生型(图4A类)表明SKN-1过度表达显著增强了抗应激能力。这一发现提出了一个问题，即肠道中构成核的SKN-1是否可以提供更有效的应激保护。然而，SKN-1:：GFP S393A转基因(图2B类)当这些转基因以两种不同剂量的DNA并行导入时，与WT SKN-1:：GFP相比，其抗氧化应激能力增加(图4A类和数据未显示）。因此，组成核SKN-1在赋予应力抗性方面并不比WT更有效。虽然不能排除SKN-1:：GFP S393A的全部活性需要额外的GSK-3抑制信号，但我们的研究结果表明，诱导的II期反应可能提供最佳的抗氧化应激保护。强大的诱导性氧化反应系统的存在可能是有利的，因为它可以避免持续解毒基因表达的潜在并发症。例如，在缺乏Keap1的小鼠中，组成性Nrf2活性会导致消化系统发育异常(27)。

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图4。

SKN-1可防止氧化应激。(A类)SKN-1:：GFP过度表达可增强抗氧化应激能力。转基因表达的WT和S393A形式的SKN-1:：GFP可相对缓解小鼠的氧化应激敏感性skn-1号机组(zu67号)突变体，并提供额外的氧化应激保护。所有被分析的动物都携带角色-6转基因标记，来源于杂合的蠕虫DnT1型平衡器。因此，控制是指氮气；角色-6衍生自氮气；角色-6；DnT1型/+动物。将单个蠕虫放在含有6.2 mM线虫生长培养基的平板上后，按照显示的时间对其存活率进行评分t吨-丁基过氧化氢。在这些应激条件下，SKN-1:：GFP在肠细胞核中积累通用条款-1::绿色荧光粉表达增加（数据未显示）。这项具有代表性的实验涉及每组40条蠕虫。误差线表示标准偏差。P（P）的值skn-1型(zu67号),skn-1号机组(zu67号)Ex[SKN-1:：GFP]，以及skn-1号机组(zu67号)与对照组相比，Ex[SKN-1:：GFP S393A]分别为0.034、0.007和0.009。(B类)肠中SKN-1的调节模型。在正常条件下，SKN-1被GSK-3组成性磷酸化，并被阻止在细胞核中积聚。这种抑制依赖于SKN-1的预先启动磷酸化，这表示一个额外的负信号（参见结果和讨论). SKN-1靶基因，表示为通用条款-1，然后以非常低的水平表示。在氧化应激条件下，SKN-1的p38通路信号和PMK-1磷酸化显著增加(28). 该信号抵消了GSK-3对SKN-1的抑制作用，并且是SKN-1在细胞核中高水平积聚并诱导II期基因表达所必需的独立信号。这些磷酸化事件任意显示为发生在细胞质中。MAPKKK，MAPK激酶。

SKN-1直接集成多个监管信号。最近，我们确定肠中SKN-1的功能依赖于p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的信号传导(28). 在秀丽线虫之前已经证明，通过这种保守途径的信号传导对于某些神经元不对称性和先天免疫至关重要(29,30). 氧化应激导致p38 MAPK，PMK-1的激活，这是一种秀丽线虫p38正交(28). SEK-1是磷酸化PMK-1的MAPK激酶，是SKN-1在肠细胞核中积累并激活II期基因表达所必需的，并且sek-1（km4)-空突变体对氧化应激过敏。SKN-1被Ser-74和Ser-340上的PMK-1磷酸化，SKN-1:：GFP不能在细胞核内积聚或挽救小鼠的应激敏感性skn-1号机组(zu67号)当这些残基被丙氨酸取代时的突变体。

我们的发现是，GSK-3阻止SKN-1在肠道内的组成性作用，这提出了一个问题，即p38信号传递到SKN-1功能是否仅仅是为了克服GSK-3的抑制作用。为了研究这种可能性，我们阻断了SKN-1的p38磷酸化，并询问当谷胱甘肽激酶-3的磷酸化被抑制时，SKN-1是否仍然组成性地出现在肠细胞核中。与在WT背景下获得的结果形成鲜明对比sek-1（公里4)动物，糖原合成酶激酶-3RNAi没有明显改变SKN-1:：GFP定位(图1B类)GSK-3磷酸化突变体SKN-1（S393A）仅在细胞核中微弱积累(图2B类和F类). 此外在WT背景中，糖原合成酶激酶-3RNAi没有导致SKN-1（S74A，S340A）突变体的核定位，该突变体在PMK-1的磷酸化中有缺陷(28)(图1B类). 这些结果表明第1季度p38信号传导对糖原合成酶激酶-3关于SKN-1调节，因此排除了p38信号仅调节GSK-3或以其他方式阻止其抑制SKN-1的可能性。因此，在肠道中，II期解毒反应不仅需要通过以下途径抑制SKN-1糖原合成酶激酶-3但也依赖于SKN-1的p38磷酸化提供独立的阳性刺激(图4B类). 通过抑制SKN-1，GSK-3可以设置一个阈值，阻止p38信号的背景水平(28)它可以提供一种缓冲效应，使SKN-1能够对更广泛的压力信号作出相应的响应。

胚胎后肠道中SKN-1的这种可诱导调节与SKN-1如何定位于胚胎和ASI神经元中的细胞核形成鲜明对比(11,31). 我们的研究结果表明，在肠道中，SKN-1直接整合多个独立信号，这些信号结合起来抑制或激活II期反应(图4B类). 因此，我们的结果揭示了GSK-3信号转导通过促进细胞质滞留或SKN-1降解，将这种原本是核转录因子“转换”为该特定组织中的信号反应蛋白的模式。因此，缺乏来自GSK-3或其启动激酶的信号，可以解释为什么SKN-1在ASI神经元中具有组成性核和活性(11). 我们的结果表明，一个有趣的可能性是，GSK-3也可能通过胚胎C卵裂球中的直接磷酸化来抑制SKN-1。

GSK-3调节这种保守的氧化应激反应的观察秀丽线虫揭示了这种多功能且重要的激酶的功能，它与细胞增殖、分化、运动和生存有关(19,20). 该发现还预测，减少GSK-3活性的信号或因子与糖原合成酶激酶-3(RNA干扰)将对II期基因表达产生类似的影响，因此，将提供激活这种解毒反应的方法。GSK-3在哺乳动物中受多种细胞信号调节，参与人类疾病状态，包括癌症、糖尿病和阿尔茨海默病(20). 如果Nrf蛋白由GSK-3类似于SKN-1调节，那么GSK-3活性的改变可能会影响许多哺乳动物的细胞氧化还原条件。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：T.K.B.设计研究；J.H.A.、K.V.和M.L.进行了研究；H.I.、N.H.和K.M.提供了新的试剂/分析工具；J.H.A.、K.M.和T.K.B.分析数据；J.H.A.和T.K.B.撰写了这篇论文。

利益冲突声明：未声明冲突。

缩写：GSK-3，糖原合成酶激酶-3；RNAi，RNA干扰；GCS-1，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶；Nrf、NF-E2相关因子；丝裂原活化蛋白激酶。

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