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Nutr Metab（伦敦）。2005; 2: 28.
2005年10月17日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1743-7075-2-28
预防性维修识别码：项目经理1282589
PMID：16229744

生酮饮食降低阿尔茨海默病小鼠模型中淀粉样β40和42

英格丽德·范德奥韦拉，1 斯特凡·韦拉，1 弗雷德·范·鲁文，2和塞缪尔·亨德森通讯作者三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

阿尔茨海默病（AD）是一种渐进性神经退行性疾病，主要发生在老年人身上。在人类和动物模型中的研究都将胆固醇和饱和脂肪的摄入与淀粉样蛋白-β（Aβ）的沉积和AD的发展联系起来。然而，这些研究并没有研究高脂肪饮食与碳水化合物摄入减少的结合。在这里，我们测试了高饱和脂肪/低碳水化合物饮食对AD转基因小鼠模型的影响。

结果

从三个月大开始，给两组携带“伦敦”APP突变（APP/V717I）的雌性转基因小鼠喂食，一组喂食由高碳水化合物/低脂食物组成的标准饮食（SD），另一组喂吃由极低碳水化合物/高饱和脂肪食物组成的生酮饮食（KD）43天。与喂食SD的动物（0.29±0.06 mM）相比，喂食KD的动物的血清酮体水平（β-羟丁酸（3.85±2.6 mM））显著升高。此外，喂食KD的动物体重减轻（SD 22.2±0.6 g vs.KD 17.5±1.4 g，p=0.0067）。与早期的研究相比，短暂的KD喂养方式显著降低了大脑总Aβ水平约25%。尽管酮水平、体重和Aβ水平发生了变化，KD饮食并没有改变行为指标。

结论

以前的研究表明，富含胆固醇和饱和脂肪的饮食会增加Aβ的沉积和患AD的风险。这里我们证明，富含饱和脂肪和低碳水化合物的饮食实际上可以降低Aβ的水平。因此，旨在降低Aβ水平的饮食策略应考虑饮食成分和代谢结果的相互作用，特别是碳水化合物水平、总热量和酮体的存在。

背景

阿尔茨海默病（AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，在美国非常常见，影响到高达50%的75至84岁人群[1]. 由于发达国家人口老龄化，未来50年内AD病例数量将急剧增加，并将带来越来越多的医学挑战[2]. 临床上，阿尔茨海默病的特点是记忆力和语言逐渐受损，并经常伴有焦虑和抑郁等行为症状。病理学上，AD的特征是老年斑块、营养不良的神经突起和神经原纤维缠结的堆积。斑块中含有大量β-淀粉样蛋白（Aβ）肽，该肽源于淀粉样前体蛋白（APP）的裂解。在家族性AD病例中，已发现APP突变导致aβ（aβ42）特定形式生成增多，这种联系导致了aβ是AD病因的核心假设（有关综述，请参阅[三]). 然而，APP作为一种囊泡转运蛋白发挥作用，该病的病因可能与aβ没有直接关系，而是与APP的异常分裂和未能有效移动轴突中的囊泡有关[4]. 虽然Aβ在AD中的确切作用尚未明确，但很明显Aβ是该病的病理标志物。

AD的发展和Aβ的积累与饮食因素有关。流行病学研究一再涉及富含饱和脂肪的饮食[5-8]尽管它们很难复制[9]. 此外，在小鼠模型中进行的几项实验似乎证实了高脂饮食与AD之间的联系。使用AD转基因小鼠模型，一些组报告说，高脂饮食或添加胆固醇的饮食增加了Aβ肽的水平和沉积[10-14]. 然而，这些研究并没有检验高脂饮食与低碳水化合物摄入相结合的效果。

众所周知，碳水化合物含量极低、脂肪含量高的饮食会诱导肝脏产生酮体（β-羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮），通常称为生酮饮食（KD）。生酮饮食在某些方面模拟了饥饿，根据长期观察记录，即禁食可以减少癫痫发作，开发出用于人类治疗癫痫的饮食[15]). 实验性KD的热量有限，成分固定，因此与用于减肥的低碳水化合物饮食不同，低碳水化合物饮食通常是即兴演奏成分可变。尽管存在这些差异，低碳水化合物饮食也可能有效地预防癫痫发作，并可能通过与KD相似的机制发挥作用[16]. 这些饮食的抗惊厥特性的确切机制尚不清楚。这两种饮食中的低碳水化合物含量会引起许多可能具有保护作用的代谢变化，例如循环酮体水平升高、脂肪氧化增加、蛋白质代谢变化和基因表达变化[17，18]。

结果

本研究在AD转基因小鼠模型中对由极低碳水化合物和极高饱和脂肪含量组成的KD的作用进行了实验测试。小鼠表达了一种人类APP基因，该基因包含由一种基因驱动的“伦敦”APP突变（APP/V717I）胸腺1基因启动子。APP/V717I转基因小鼠早在3个月大的时候就在大脑中产生了显著水平的可溶性Aβ，并且在12到14个月时出现了广泛的斑块沉积。这些动物表现出早期行为缺陷，是早发家族性AD的模型[19]。

饮食

喂食16只雌性APP/V711I小鼠随意标准饮食（SD）包括高碳水化合物/低脂食物（Muracon-G食物：35%碳水化合物、21%蛋白质、4.5%脂肪、39.5%水、纤维和灰分）。Muracon-G中的主要脂肪酸是亚油酸（18:2），它占到食物重量的1.4%。在三个月大时，一半的组（8只动物）被改为生酮饮食（KD），由极低碳水化合物/高脂肪的食物组成，而其余8只动物仍留在SD中。在这两种情况下，动物都可以随时自由进食，摄入不受实验限制。对于KD，我们使用Bio-Serv Inc.F3666 chow：0.76%碳水化合物、8%蛋白质、79%脂肪、12%水、纤维和灰分。F3666是一种生酮食物，由猪油、黄油脂肪、葡萄糖、酪蛋白、纤维、玉米油、矿物质混合物和维生素混合物组成。F3666富含饱和脂肪。超过29%的F3666杂粮由饱和脂肪组成（按重量计）：2.4%肉豆蔻酸（C14:0）、18.9%棕榈酸（C16:0）和8.4%硬脂酸（C18:0）（见表​表1）。1). 喂食F3666食物的动物被称为KD组。留在Muracon-G chow上的小鼠被称为SD组。

表1

F3666（KD）chow的脂肪酸分布

脂肪酸克/千克克/千克
C4丁酸4.59C16棕榈岩189.03
C6六方3.19C16:1顺-9-十六碳烯酸28.18
C8辛酸2.99C17十七烷2.38
C10十进制4.39C17:1十七烯酸1.43
C10:1十二进制0.80C18硬脂酸84.79
C12月桂6.41C18.1油酸298.34
C12:1顺-9-十二烯酸0.40C18:2亚油酸119.44
C14肉豆蔻24.43C18:3亚麻酸6.33
C14:1顺-9-十四烯酸6.14C20二十烷酸1.18
C15五烷酸0.48C20:1顺-11-二十碳烯酸3.80

KD饮食和减肥

在最初的7天里，KD组的许多动物都不愿意吃新的食物，体重减轻了（图​（图1）。1). 为了提高摄入量和减轻体重减轻，从第16天到第20天，将SD chow与KD chow以1:3的比例混合。在第二天的第20天里，SD食物的量减少到了洒在KD食物上的一些面包屑。第28天之后，这些动物只被送回KD chow。混合食物使KD组的体重恢复到SD组的水平，约为20克（图​（图1）。1). 当只喂KD chow时，体重再次下降，但趋于稳定在约18克（图​（图1）。1). 实验结束时，平均体重差异显著（SD 22.2±0.6 g vs.KD 17.5±1.4 g，p=0.0067）。

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实验过程中各组的平均重量（单位：克）。蓝色方块代表标准饮食（SD）组。红圈代表生酮饮食（KD）组。误差条表示平均值的标准误差。天数表示从饮食改变开始的天数。KD上的动物体重减轻。为了减轻体重减轻和改善喂养，在第二周将少量SD chow与KD chow混合，然后在第三周取出，见方法。

KD饮食提高血清β-羟丁酸水平

为了测量食物诱导生酮状态的有效性，每周采集血液样本并检查β-羟基丁酸（BHB）水平。与SD组相比，KD组的喂食动物在换食8天后，BHB水平显著升高（SD 0.26±0.023 mM vs.KD 8.94+1.8 mM，p<0.0001，图​图2），2)可能是因为一些动物不吃东西。正如预期的那样，在第16-28天喂食混合食物会减少血清酮体（图​（图2）。2). 然而，在第0天之后检查的所有时间点，KD喂养组的酮类水平均显著高于SD组（图​（图2）。2). 与SD组相比，KD组在实验过程中的平均血清BHB浓度升高（SD 0.29±0.06 mM vs.KD 3.85±1.1 mM，p<0.0078）。KD组的酮水平升高表明这些动物发生了向脂肪利用的代谢转变。

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生酮饮食诱导酮体生成。标准饮食（SD）组显示为蓝色，生酮饮食（KD）组显示为红色，误差条表示平均值的标准误差。血清β-羟基丁酸（BHB）水平（单位：mM.*）表明KD组和SD组之间存在p<0.05。天数表示从饮食改变开始的天数。KD组在0天后的所有时间点血清β-羟丁酸水平均显著升高。条形表示KD组混合进食的时间。

认知测试

饮食38天后，按照前面所述，使用物体识别测试对动物进行行为缺陷测试[20]，请参见方法。尽管在饮食、BHB水平和体重减轻方面存在差异，但各组之间的行为测量没有差异（表​（表22).

表2

认可指数

测试标准偏差杜兰特p值
RI（按时间）56.2 ± 5.756.7 ± 8.20.963
好奇心随时间变化10.0±2.711.6 ± 6.50.803
RI（按频率）49.3 ± 3.654.6 ± 9.70.628
好奇度（按频率）14.4 ± 2.311.9 ± 3.90.530
平均速度3.8 ± 0.44.5 ± 0.80.447

Aβ水平

四个月大的APP/V717I小鼠没有Aβ阳性斑块，所有Aβ都存在于可溶性部分[19]. 因此，在饮食改变后43天，对两组动物的大脑中的可溶性Aβ水平进行了测量。如前所述分离脑匀浆[20]，请参见方法。使用淀粉样蛋白Aβ40或Aβ42 ELISA高灵敏度试剂盒（瑞士苏黎世遗传公司）对每只动物的一个半球的Aβ40和42水平进行分析。KD喂养组的可溶性Aβ40和42水平均显著降低（图​（图3）。三). 在家族性AD的情况下，相对于Aβ40产生过量的Aβ42，从而增加Aβ42/40的比率。我们检查了Aβ42与Aβ40的比率，发现各组之间没有差异（SD 0.51±0.024 vs.KD 0.56±0.026，p=0.2872），这表明饮食没有改变APP上的卵裂位点，反而促进了Aβ物种的普遍降低。

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生酮饮食可降低Aβ40和Aβ42。Aβ水平为脑组织的纳克/克。标准饮食（SD）组用蓝色表示，生酮饮食（KD）组用红色表示，误差条代表平均值的标准误差。SD chow Aβ40 1.72±0.12 ng/g vs.KD chow Aα40 1.28±0.09 ng/g，p=0.012。SD chow Aβ42 0.88±0.05 ng/g vs.KD chow Aα42 0.71±0.0.4 ng/g，p=0.016。

检测总蛋白水平，以确定KD组大脑蛋白的总体下降是否可以解释aβ水平的下降。然而，以mg/ml脑匀浆测定的蛋白质水平在两组之间没有差异（SD 0.56±0.035 mg/ml vs.KD 0.51±0.017 mg/ml，p=0.213）。由于KD组中的大多数（尽管不是全部）动物体重减轻，因此体重减轻最大的动物的Aβ水平可能会最低。然而，Aβ40或Aβ42的水平与所有组（Aβ40 r=0.16，p=0.20；Aβ42 r=0.05，p=0.49）或仅KD组的体重变化无关（Aβ40r<0.0001，p=0.96；Aβ42r=0.09，p=0.62）。这两项措施都表明，降低Aβ的效果并不是由于体重减轻导致蛋白质水平普遍降低的结果。

由于KD组所有动物的BHB水平均升高，因此血清BHB水平是衡量生酮饮食有效性的较好指标。当实验过程中所有动物的Aβ40和42水平与平均血清BHB相关时，观察到显著相关性（Aβ40 r=0.42，p=0.016；Aβ42 r=0.42、p=0.015）。然而，这种相关性很可能是由两组之间BHB和Aβ水平的巨大差异驱动的，因为单独在KD组中Aβ和BHB水平之间没有显著相关性（Aβ40 r=0.083，p=0.58；Aβ42 r=0.15，p=0.46）。

讨论

这项研究证明了一个意想不到的结果，即在阿尔茨海默病小鼠模型中，用低碳水化合物/高饱和脂肪饮食进行短暂治疗可降低总aβ水平。先前的研究表明，富含饱和脂肪或胆固醇的饮食增加了AD小鼠模型中Aβ的生成和沉积，从而表明富含脂质的饮食是AD的一个因素[10，12-14]. 然而，这些饮食并不是低碳水化合物饮食。在高胆固醇饮食中，饮食中添加了胆固醇，而没有减少其他成分[10，14]. 在高脂肪饮食的研究中，碳水化合物含量仍然相对较高。例如，Ho等使用60%脂肪，20%碳水化合物，20%蛋白质的饮食。这种饮食中碳水化合物含量足够高，导致动物体重大幅增加[11]。

众所周知，不同的大量营养素，特别是脂肪和碳水化合物的相互作用会影响动物的代谢状态。例如，Marsset-Baglieri等检查饮食中的脂肪是否足以将能量平衡转向脂肪储存。然而，老鼠喂食随意不含碳水化合物的高脂肪（50%）饮食不会增加能量摄入，也不会增加体脂，而在含有碳水化合物（56%）的情况下喂食高脂肪饮食（30%）的动物会增加能量摄入并增加体脂[21]. 这些研究支持这样的观点，即当脂肪和碳水化合物同时摄入时，碳水化合物刺激胰岛素分泌，从而促进脂肪的储存（最近的综述见[22]). 因此，在检查膳食脂肪对生物过程的影响时，重要的是要考虑膳食的宏观营养素状况。

在本研究中，转基因动物被喂食随意几乎没有碳水化合物（0.76%）的高脂肪（79%）饮食。KD导致酮体生成、体重减轻和Aβ水平降低。因此，这里的数据表明，增加Aβ水平的可能不是饮食中的脂肪，而是总热量、碳水化合物水平或动物的代谢状态。

人类流行病学研究表明，饮食中的饱和脂肪是阿尔茨海默病的危险因素。例如，Kalmijn等在荷兰鹿特丹对5386名受试者进行了为期两年的随访研究，发现饮食习惯与痴呆发病率相关。该分析的结果使作者认为，富含饱和脂肪和胆固醇的饮食增加了几种类型痴呆的风险[5]. 然而，在对同一人群进行6年的随访后，无法确定痴呆症与脂肪摄入之间的相关性，导致作者得出结论：“总脂肪、饱和脂肪和反式脂肪及胆固醇的高摄入量以及MUFA、PUFA、n-6 PUFA和n-3 PUFA的低摄入量与痴呆症或其亚型的风险增加无关。”[9]. 最近的研究也检验了饮食脂肪和认知能力下降之间的联系。在芝加哥健康与老龄化项目中，对2560名年龄在65岁及以上的参与者进行了一项研究，通过食物问卷测量脂肪摄入，并在3年和6年的随访后进行认知测试。这项大型研究发现，饱和脂肪和胆固醇摄入与认知能力下降之间只有微弱的趋势[7]. 啮齿动物和人类的研究都强调了试图将复杂的环境因素（如饮食习惯或大量营养素摄入）与痴呆症和阿尔茨海默病联系起来的复杂性。尤其是，人类研究中的一个复杂因素是现代饮食中大量碳水化合物的正常摄入。

本研究表明，与预期相反，转基因小鼠自由意志仅在饮食改变43天后，极低碳水化合物/高饱和脂肪饮食的aβ水平较低。KD组的Aβ40和淀粉样蛋白Aβ42水平均较低，表明KD饮食没有改变或提高APP内卵裂位点的效率。相反，数据表明KD机制要么减少了APP的处理，要么增加了Aβ物种的降解。大多数喂食生酮饮食的动物体重减轻，Aβ水平降低。然而，Aβ水平的降低可能不是由于蛋白质含量的普遍降低。各组之间的大脑总蛋白水平没有差异，Aβ水平与体重减轻无关。有趣的是，尽管饮食、体重减轻和Aβ水平发生了变化，但认知能力没有变化（表​（表2）。2). 这一观察结果与KD饮食对小鼠无害的一般发现相一致[23]. 此外，Aβ的减少并没有改善认知能力的发现可能是由于在这些条件下，Aβ水平适度降低，可能需要更长时间的治疗。

KD饮食的开发是为了模拟动物的饥饿反应，而不会将热量降低到有害水平[15]. 通过这种方式，KD类似于许多物种使用的热量限制（CR）机制，以改变老化并增加某些形式的抗应激性。与对照组相比，CR通常可减少30-40%的热量随意喂养动物，对动物健康有许多积极影响[24]. 在本研究中，我们没有试图以任何方式限制卡路里的摄入，动物在任何时候都可以自由食用生酮食物，并且摄入量是自我限制的。然而，由于动物起初不愿意吃KD食物，并且我们观察到KD组的体重减轻，我们不能排除Aβ降低作用是由于CR引起的可能性。

然而，CR和KD可能通过类似的机制发挥作用。众所周知，KD可以减少胰岛素信号并模拟饥饿，从而增加脂肪酸氧化并促进分解代谢状态[17]. 同样，众所周知，CR可以降低血清胰岛素和IGF水平，CR的大部分益处可能来自胰岛素/IGF信号的减少（有关综述，请参阅[25]). 例如，胰岛素/IGF-样信号减少抑制蛋白质合成并促进蛋白质降解，这可能导致降解敏感性蛋白质的清除，例如淀粉样肽。

越来越多的证据表明胰岛素/IGF-1在调节APP和调节aβ水平中发挥作用。胰岛素和IGF-1的受体在大脑中高度表达，特别是在海马体和皮层，它们可能影响学习和记忆[26]. 大脑中的胰岛素信号通过促进分泌增加细胞外Aβ水平[27]并通过胰岛素降解酶抑制降解[28]. 这一观点最近也得到了人类的支持。菲舍尔等证明健康老年受试者诱导的高胰岛素血症升高了血清和脊髓液Aβ水平，表明胰岛素在升高Aβ中起作用，尤其是在II型糖尿病等情况下[29]。

这种解释与最近的研究一致，这些研究表明，在表达“瑞典”形式APP的小鼠（Tg2576小鼠）中，低碳水化合物热量限制（CR）方案具有类似的Aβ降低作用。在这些动物中，摄入碳水化合物少于30%的动物中检测到Aβ40和42的水平较低随意喂食动物。降低Aβ的作用可能是由于CR动物的α-分泌酶和胰岛素降解酶活性增加所致[30]。

另外，本研究中的其他生理变化可能降低了Aβ水平。高水平的酮体可能单独导致蛋白质周转增加。添加到细胞培养中的酮体已被证明会导致易于氧化损伤的蛋白质氧化增加。受损蛋白的存在通过伴侣介导的自噬触发正常长寿蛋白的蛋白水解[31]. 这种机制可能在喂食生酮食物并接触高水平酮体的动物中起作用。这一模型的一些支持来自以下观察结果：酮体水平升高与Aβ物种降低的相关性比体重减轻的相关性更好。此外，酮体可能是神经元代谢的有效底物。先前的研究表明，酮体的急性升高可能会改善一些轻度至中度AD患者的认知能力[32]。

结论

随着发达国家人口老龄化，预计AD发病率将急剧增加，并将给卫生服务带来巨大负担[2]. 饮食干预是一种相对安全且现成的对抗AD的方法。然而，关键的饮食联系仍不清楚。早期的许多工作都集中在高脂肪或高胆固醇饮食的作用及其对AD的贡献上。然而，有证据表明，晚发性AD的主要遗传危险因素，载脂蛋白E的ε4等位基因，可能在长期接触农业的人群中被选择为对照[33]. 此外，富含碳水化合物的食物是人类饮食中较新添加的食物，可能比高脂肪饮食在进化上更不协调[34]. 因此，最近向高碳水化合物（HC）饮食的转变可能在AD的发展中起着重要作用。众所周知，高碳水化合物饮食可以刺激胰岛素信号传导并导致脂代谢抑制[22]. 因此，这种饮食可能会导致神经元中不适当的脂质环境、APP的错误清除以及由此导致的细胞贩运的抑制，并最终增加AD的发病风险（有关概述，请参阅[35]).

方法

动物

本研究使用16只3个月大的APP[V717I]C57Bl×FVB雌性小鼠。小鼠以相反的昼夜节律饲养：从晚上7点开始，14小时光照/10小时黑暗，饲养在RVS T2型标准金属笼中（面积540 cm2）。根据动物福利立法，每个笼子的老鼠数量是有限的。所有小鼠在3周龄时通过聚合酶链反应（PCR）进行基因分型。小鼠是盲随机的，年龄匹配，可以自由使用预过滤的无菌水（UV-lamp）。小鼠可以自由食用生酮（KD）（代码F3666，Bio-Serv，Frenchtown，US）或标准（SD）chow（Muracon-G，Trouw Nutrition，Gent）。F3666是一种流质糊状食物，由专门设计的液态食品供应商提供，每天都会进行刷新。F3666是一种液态食物，动物经常将食物洒在笼子里。此外，由于给定组中的所有动物都被关在一个笼子里，因此不可能测量每只动物的进食量，也没有记录。由于KD组动物的体重减轻存在一些问题，从第16天开始到第20天，这些动物被喂食混合的1（SD）:3（KD）。从第21天到第27天，SD食物的量减少到洒在KD食物上的一些面包屑。第28天之后，这些动物只被送回KD chow。然而，KD组中的一只老鼠拒绝进食，尽管尝试通过灌胃进食，但仍死亡。一只对照动物在抽血过程中死亡。

血液采集和分析

从麻醉小鼠的眶丛或心脏穿刺处采集血液。使用Stanbio液色β-羟基丁酸盐试剂盒（Stanbio Inc.，德克萨斯州博恩）分光光度法测量β-羟基丁酸盐水平。

新型物体识别测试

使用Dewachter描述的方法，在治疗38天后进行新的物体识别测试等[20]. 简单地说，让小鼠熟悉一个Plexiglas露天盒子（52×52×40厘米）一个小时，盒子下面放着一盏灯，光线昏暗，盒子有黑色垂直墙壁和半透明地板。第二天，这些动物被放在同一个盒子里，并接受了10分钟的采集试验。在本试验中，将小鼠单独置于开阔地，有2×物体A（橙色桶或绿色立方体，大小相似，为±4 cm），持续时间（时间AA）和频率（频率AA）探测对象A（当动物的鼻子朝向距离小于1厘米的物体，并且老鼠正向物体的方向主动嗅探时）由计算机系统（Ethovision，Noldus information Technology，Wageningen，Netherlands）记录。在3小时后进行的10分钟保留试验（第二次试验）中，将一个新物体（物体B、绿色立方体或橙色桶）与熟悉的物体（物体a）放在开阔的场地中。（分别为频率A和频率B以及时间A和时间B）。识别指数（RI）被定义为探索新事物的持续时间与探索两个物体的持续时间之比（时间B/（时间A+时间B）×100），用于测量非空间记忆。在采集试验期间探索了持续时间和频率对象A（时间AA和频率AA），以测量好奇心。

分析技术

用酮咯酸混合物麻醉小鼠®（氯胺酮），龙本®（二甲苯嗪2%）和阿托品（2:1:1），并在4°C下用生理血清经心冲洗。这是为了清除脑血管中的血液，这一过程对器官完整性没有影响。通过心脏穿刺和1毫升注射器在肝素化Eppendorf管中采集血液。大脑从头盖骨上切除，后脑和前脑用冠状面/额面上的切口分开。通过中线矢状切口，前脑被均匀地分为左右半球。用波特玻璃管（无洗涤剂，2 cm）将每只动物的一个半球均质化三)和机械均质机（650 rpm）。使用体积为6.5×1/2脑重的新制备的20 mM Tris/HCl缓冲液（pH 8.5）和蛋白酶抑制剂（每50 ml Tris/HCl缓冲液1片，CompleteTM，Roche，Mannheim，Germany）作为均质缓冲液。匀浆在Beckman离心管TLX中收集，并在离心前在冰上收集。在离心样品之前，10%的样品用于测定匀浆的总蛋白浓度，而90%的样品被离心以进一步进行生物化学处理。通过离心将上清液（含有分泌APP和淀粉样肽的可溶性部分）从颗粒中分离出来（含有膜结合APP-片段的膜部分）。通过柱色谱进一步处理上清液，以使用小型反相柱（C18-Sep-Pack Vac 3cc卡式瓶，马萨诸塞州沃特斯）浓缩淀粉样肽。淀粉样肽用75%A-TFA洗脱，洗脱液收集在2 ml冰管中。将洗脱液在speedvac浓缩器（Savant，Farmingdale，NY）中冻干过夜，并在配备ELISA试剂盒的240μl样品稀释剂中溶解。为了量化脑匀浆可溶部分中人类Aβ40和人类Aβ42的含量，使用了市售酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（h淀粉样蛋白Aβ40或Aβ42 ELISA高度敏感，瑞士苏黎世遗传公司）。通过将吸光度与合成Aβ40或Aβ42制成的标准曲线进行比较，得出样品中Aβ含量的定量。使用Bradford溶液（Pierce Inc.）测量脑匀浆中的总蛋白浓度。

缩略语清单

阿尔茨海默病；淀粉样前体蛋白；Aβ，淀粉样β；SD，标准饮食；KD，生酮饮食；CR，热量限制；BHB，β-羟基丁酸。

竞争性利益

作为Accera，Inc.的联合创始人，STH持有一个组织的股份，可能会从本手稿的出版中获得或损失财务收益。此外，STH已经申请了与手稿内容相关的专利，并且可能会从本手稿的出版中获得或损失经济利益。

致谢

我们感谢Accera，Inc.的员工批判性地阅读了这份手稿并进行了有益的讨论。

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