生物化学杂志。2005年11月1日；391（第3部分）：503–511。
癌细胞激活p53对10-甲酰四氢叶酸脱氢酶表达的反应
, , ,和1
纳塔利亚五世。奥列尼克
美国南卡罗来纳医科大学生物化学与分子生物学系，查尔斯顿，SC 29425。
纳塔利亚一世。克鲁彭科
美国南卡罗来纳医科大学生物化学与分子生物学系，查尔斯顿，SC 29425。
大卫·G。牧师
美国南卡罗来纳医科大学生物化学与分子生物学系，查尔斯顿，SC 29425。
谢尔盖A。克鲁彭科
美国南卡罗来纳医科大学生物化学与分子生物学系，查尔斯顿，SC 29425。
美国南卡罗来纳医科大学生物化学与分子生物学系，查尔斯顿，SC 29425。
2005年3月30日收到；2005年7月8日修订；2005年7月14日接受。
摘要
叶酸酶FDH（10-甲酰四氢叶酸脱氢酶；酶代码EC1.5.1.6）不是一种典型的肿瘤抑制剂，但它具有一种酶的两个基本特征，即在肿瘤中下调，其表达对癌细胞具有选择性细胞毒性。我们最近发现，FDH在A549肺癌细胞中的异位表达可诱导G1期阻滞和凋亡，并伴有p53及其下游靶点p21的升高。然而，目前尚不清楚FDH诱导的细胞凋亡是否依赖于p53。在本研究中，我们报告了FDH诱导的抑制效应在A549细胞中严格依赖于p53。使用RNAi（RNA干扰）方法敲除p53，并使用R175H突变型p53通过显性负性抑制来禁用p53功能，这两种方法都阻止了FDH在这些细胞中诱导的细胞毒性。FDH抑制效应的消融与缺乏功能性p53时不能激活凋亡有关。我们还表明，FDH升高导致p53反式激活域中Ser-6和Ser-20的p53磷酸化，以及C末端域中的Ser-392磷酸化，但只有Ser-6被严格要求来调节FDH效应。此外，在诱导FDH表达后，还观察到p53移位到细胞核和促凋亡蛋白PUMA（Bcl2结合组分3）的表达。p53功能性HCT116细胞中FDH的升高诱导了强烈的生长抑制，而p53缺陷性HCT16细胞的生长不受影响。这意味着p53依赖性通路的激活是对p53功能性癌细胞中FDH表达诱导的一般下游机制。
关键词：细胞凋亡、叶酸、10-甲酰四氢叶酸脱氢酶、p53、RNA干扰（RNAi）、肿瘤抑制因子
缩写：行动D，放线菌素D；FDH，10-甲酰四氢叶酸脱氢酶（酶代码EC1.5.1.6）；绿色荧光蛋白；Mdm2，小鼠双分钟克隆2癌蛋白；MTT，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H（H）-溴化四唑；PI，碘化丙啶；PUMA，Bcl2结合组分3；RNA干扰；TS，胸苷酸合成酶
简介
p53抑癌蛋白的激活，通过其升高和翻译后修饰来响应各种类型的细胞应激，诱导细胞周期阻滞或凋亡[1,2]. p53蛋白通常水平较低，但在遗传毒性应激诱导的细胞中积累，导致细胞周期检查点基因和/或凋亡基因的转录激活[三,4]. 它也可以被非基因毒性应激激活[4]. 在没有DNA损伤的情况下激活p53的因素包括：癌蛋白的表达[5]、非基因毒性药物[6]，核糖核苷酸库消耗[7]和缺氧[8]. 在50%以上的肿瘤中，p53的功能因肿瘤细胞的突变而受损第53页基因[9,10]. 此外，即使在具有野生型p53表型的细胞中，p53通路也可能是不活跃的[10]. 导致p53功能失效的机制包括：通过Mdm2（小鼠双分钟克隆2癌蛋白）依赖性途径提高p53降解率[11,12]; 与p53相互作用并通过细胞质隔离阻止其功能的蛋白质的表达[10]; 以及缺乏共激活剂[13,14]. 此外，p53上游或下游通路的缺陷也可能干扰野生型p53的功能[10].
叶酸缺乏是导致基因组不稳定和凋亡的因素之一，尽管其潜在机制尚不清楚[15]. 叶酸辅酶对细胞完整性至关重要，因为它们参与核苷酸生物合成和DNA甲基化[16]. 因此，叶酸代谢缺陷可通过多种机制导致细胞凋亡，包括：细胞核苷酸库耗竭[7]，尿嘧啶错误地结合到DNA中以及DNA异常的积累[17]，以及甲基化过程的损害[18]. 几项研究表明叶酸缺乏诱导的细胞凋亡似乎依赖于p53[19]尽管目前尚不清楚这些机制中哪一种更可能触发p53依赖性凋亡级联反应以应对叶酸相关应激。叶酸也引起了人们的注意，因为它们的类似物是有效的抗癌药物[20]. 深入研究了抗叶酸对分子和细胞水平的抑制作用[20——22]包括对p53在这些影响中的作用的研究[23,24]. 这些研究得出结论，这些药物的p53相关和p53非相关反应之间的区别取决于表型/基因型背景[23,24]明显反映了不同细胞类型对叶酸代谢的不同要求。
已经证明，叶酸依赖酶TS（胸苷酸合成酶）直接结合p53 mRNA，阻止其翻译和下调p53水平[25]. TS与其生理叶酸底物5,10-亚甲基四氢叶酸的结合显著降低了RNA结合活性[26]这应该可以防止TS介导的p53 mRNA翻译抑制。这一发现表明了一种额外的机制，通过调节TS功能，叶酸可以影响p53依赖性途径。另一种叶酸酶，FDH（10-甲酰四氢叶酸脱氢酶；酶代码EC1.5.1.6），也可能是p53调节网络的一部分[27]. 我们已经证明，长期以来被视为普通代谢酶的FDH[28]具有肿瘤抑制剂的特性：在肿瘤中强烈且普遍下调，在低于生理水平的中度FDH表达对缺乏FDH的癌细胞具有选择性细胞毒性[29]. 我们还发现，FDH缺乏的人肺癌细胞系A549中野生型p53的FDH表达可诱导G1期阻滞和凋亡，并伴有p53及其下游靶点p21的升高[27]. 然而，目前尚不清楚FDH诱导的细胞凋亡是否依赖于p53[27]. 在本研究中，我们报告了FDH诱导的抑制效应在A549细胞中严格依赖于p53。我们还表明，在FDH表达后，p53的激活通过Ser-6、Ser-20和Ser-392的磷酸化发生，随后表达促凋亡蛋白PUMA（Bcl2结合组分3）。
材料和方法
试剂
除非另有规定，否则试剂和缓冲液均从西格玛采购。Bax、Bcl2和BclXL抗体是Yi-Te Hsu博士（美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗莱纳医科大学生物化学和分子生物学系）赠送的礼物。
细胞培养
除非另有说明，否则细胞培养基和试剂从Invitrogen购买。抗生素和Tet-认证血清购自Clontech。我们之前的研究中生成了用于诱导FDH表达的Tet-On A549/FDH稳定细胞系[27]. HCT116 p53+/+和p53−/−细胞[来自Bert Vogelstein博士（霍华德休斯医学研究所和西德尼·金梅尔综合癌症中心，美国马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯医学研究所）的礼物]生长在补充10%（v/v）胎牛血清的McCoy 5A培养基中。通过台盼蓝排除法或MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2评估细胞活力H（H）-我们前面描述的四唑溴化铵细胞增殖试验[27]. 根据制造商的说明，使用CellTiter 96®试剂盒（Promega）进行MTT细胞增殖试验。
瞬时转染
使用FuGENE6试剂（Roche Molecular Biochemicals）将携带R175H p53突变cDNA的pCEP4-175质粒转染Tet-On A549/FDH细胞[Jennifer Pietenpol博士（美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院生物化学系）的礼物]。通过与表达GFP（绿色荧光蛋白）的pEGFP-N3载体（Clontech）联合转染来评估转染效率。用含有FDH cDNA的pcDNA3.1瞬时转染HCT116细胞，基本上如我们之前所述[29]. 在H1299细胞的实验中，携带野生型/突变型p53 cDNA的pCEP4载体要么与pcDNA3.1（“空”载体）共同转染到细胞中，要么与携带FDH cDNA的pcDNA 3.1共同转染。使用Lipofectamine 2000进行实验。在对照实验中，将相应的pCEP4载体与pEGFP-N3载体联合转染，以确保实验之间的转染效率相似。在这些实验中，转染效率在40%到50%之间。对于每个突变型p53和野生型p53，进行了四次实验，以最小化转染效率偏差的影响。
产生具有敲除功能的稳定细胞系第53页使用RNAi（RNA干扰）方法的基因
pSUPER-p53 RNAi System™（Oligoengine）用于产生稳定的Tet-On A549/FDH细胞系第53页通过RNAi方法检测基因。约80%融合处的Tet-On A549/FDH细胞与两种载体pSUPER-p53™（Oligoengine）和pPUR（BD-Dickinson）以3:1的比例使用Superfect®转染试剂（Qiagen）联合转染。48小时后，将细胞以1:10的比例传至含有0.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基中。耐嘌呤霉素克隆的特征是第53页mRNA通过逆转录聚合酶链反应。使用RNA Easy®Protect Mini Kit（Qiagen）纯化总RNA。用寡核苷酸（dT）进行逆转录酶反应18使用BD SMART™cDNA合成试剂盒（Clontech）引物。用p53序列特异性引物、5′-TGGATTGCAGCCAGACTCTCC-3′（正）和5′-GTGGAGGCTGCAGTGGGAACAA-3′（反义）、Pfu聚合酶（Stratagene）进行PCR。对样品进行核糖体蛋白S9水平的标准化。
免疫印迹分析
约1×10的裂解物6细胞进行SDS/PAGE，然后用相应抗体进行免疫印迹。使用FDH特异性多克隆抗血清（1:2000稀释）检测FDH；使用来自Calbiochem的单克隆抗体检测p53和actin（分别为0.1μg/ml和1:5000稀释）。抗磷酸化p53的多克隆抗体来自AnaSpec（Ser-6；1.5μg/ml）、Cell Signaling（Ser-9、Ser-15、Ser-37、Ser-46和Ser-392；1:500）和Santa Cruz Biotechnology（Ser-20；1:200）。在所有实验中，根据制造商的协议使用了Hybond™-ECL®硝化纤维素膜和ECL®检测试剂盒（均来自Amersham Pharmacia Biotech）。在每一种情况下，对细胞膜进行清洗并重新检测肌动蛋白水平。
细胞凋亡检测
通过膜联蛋白V标记或caspase-9/6分析检测凋亡细胞。使用annexin-V-FLUOS染色试剂盒（Roche Molecular Biochemicals）用annexin V和PI（碘化丙啶）标记细胞。实验是根据制造商的协议进行的。所有细胞（附着细胞和漂浮细胞）均用于这些实验。细胞流式细胞术检测Annexin V和PI染色。使用ApoAlert™caspase检测试剂盒（Becton-Dickinson）检测caspase-9/6的活性。
免疫荧光
在Lab-Tek™II培养箱载玻片系统（Nalge Nunc International）中生长的细胞用强力霉素处理指定的时间段。将载玻片在−10°C下用无水甲醇固定5 min，空气干燥，并在含有10%（v/v）山羊血清的PBS中培养30 min。用初级抗p53抗体（Calbiochem，2.5μg/ml）孵育1h，然后用标记有Alexa Fluor®488（分子探针，5μg/ml。每一步后，用PBS清洗载玻片。载玻片用VECTASHIELD®HardSet™安装介质（Vector Laboratories）安装。使用徕卡TCS SP2 AOBS扫描共焦显微镜捕获并处理荧光图像。
定点突变
使用QuikChange试剂盒（Stratagene）通过定点突变产生p53突变。对突变质粒进行完全测序，以确认引入突变并确保无非特异性核苷酸变化。
核苷酸分析
根据制造商的说明，使用ATP生物发光检测试剂盒CLSII（罗氏）测量ATP水平。大约105在该测定中使用细胞。使用Sirius发光计（Berthold检测系统）测量发光。每项实验一式三份。根据公布的程序，使用Symmetry C18柱（4.6×250 mm，5μm直径颗粒；Waters）和Waters 515双泵溶剂输送系统，通过HPLC同时测量GTP、CTP和UTP水平[第29页]. 洗脱溶剂为（A）100 mM H三人事军官4pH 6.2（三乙胺）和（B）100 mM H三人事军官4，5 mM硫酸镁4pH 6.2（三乙胺），线性梯度为0–100%溶剂B。使用Waters 2487双波长吸收检测器在254 nm处检测到峰。使用从Sigma获得的NTP进行分析校准。根据[29b个]（表示约3×106细胞）用于色谱分析。使用Millenium软件（Waters）根据相应标准，通过峰面积量化核苷酸浓度。检测重复进行。根据公布的程序，采用HPLC测定dNTP水平[29美分].
结果
FDH表达对R175H突变型p53瞬时转染A549细胞的影响
为了抑制p53功能，我们用携带突变p53 cDNA的pCEP4-175载体转染Tet-On A549/FDH细胞。在这个突变型p53中，Arg-175被组氨酸取代。这种突变缺乏与靶DNA序列相互作用的能力，并且在诱导细胞周期阻滞和凋亡方面不起作用[30]. 此外，这种突变的表达以显性-阴性的方式抑制野生型p53功能[31]. 我们观察到，与“空”pCEP4载体模拟转染的细胞相比，转染pCEP4-175载体的细胞中p53蛋白水平显著升高(，上部面板），表明突变型p53表达。通过与表达GFP的载体联合转染，这些实验中的转染效率约为40%。强力霉素诱导的FDH显示，在表达p53突变的人群中，活细胞数量是仅表达野生型p53的对照细胞的四倍(). 这些实验表明，R175H p53突变体的表达抑制了FDH的抑制活性。
R175H p53突变瞬时表达对FDH生长抑制效应的影响用“空”载体转染Tet-On A549/FDH细胞，并进行（pCEP4+Dox）和（pCEP2）FDH诱导；用表达R175H p53突变体的载体转染Tet-On A549/FDH细胞，转染后有（pCEP4-175+Dox）和无（pCEP175）FDH诱导。2.5μg/ml多西环素（Dox）诱导FDH表达。转染48小时后使用台盼蓝排除法计数活细胞。上面的面板显示了通过免疫印迹技术评估的FDH和p53水平。肌动蛋白水平被用作负荷控制。
FDH表达对p53敲除的A549细胞的影响
我们使用RNAi方法产生了具有敲低p53的Tet-On A549/FDH细胞[32]使用pSUPER-p53 RNAi系统™。我们能够选择表现出p53 mRNA和p53蛋白几乎完全丢失的稳定克隆（其中一个克隆的结果显示在A和B） ●●●●。为了研究FDH对p53敲除细胞的影响，我们用2.5μg/ml多西环素在原始Tet-on A549/FDH细胞和p53敲减细胞中诱导了FDH的表达。我们观察到两种细胞系在诱导后表达的FDH水平大致相等(B） ●●●●。在FDH诱导后，p53敲低的细胞表现出稳定的增殖(C） ●●●●。相反，能够表达p53的原始细胞在FDH诱导后显示出完全抑制增殖和强烈的细胞毒性(C） ●●●●。这些结果表明，与p53产生细胞相比，p53缺乏细胞对FDH的抑制作用基本不敏感。p53被敲除的细胞对更高浓度的多西环素产生的更高的FDH水平具有抵抗力(A） 或通过瞬时转染(B） ●●●●。与诱导表达相比，这些实验中的瞬时表达允许我们产生更高的胞内FDH水平（比较A和B） ●●●●。然而，这些水平仍然不能抑制增殖。
p53基因敲除对表达FDH的A549细胞增殖的影响(A类)通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）评估p53敲除前后Tet-On A549/FDH细胞中p53 mRNA的水平。通过核糖体蛋白S9 mRNA水平（分别为第4和第5道）对样品进行标准化。车道1，标准。(B)通过免疫印迹技术评估Tet-On A549/FDH细胞中p53和FDH的水平，在（+p53）和（−p53）p53敲除之前和之后。对照（未处理细胞）+D组，开始使用50 nM D组治疗48 h后（治疗24 h）+FDH诱导48小时后。样品按肌动蛋白水平进行标准化。(C)诱导FDH（○）或50 nM Act D（●）治疗后p53高效Tet-On A549/FDH细胞的增殖，以及诱导FDH（□）或Act D治疗（■）后p53缺陷（敲除p53）Tet-On-A549/FDH细胞的增殖。通过Trypan Blue排除法评估活细胞。
FDH水平升高对p53敲除细胞增殖的影响(A类)不同浓度强力霉素（■，无强力霉素；□, 0.5μg/ml；○, 2.5μg/ml；●, 10微克/毫升）。MTT法检测活细胞。插图显示了诱导后48小时的FDH水平。Actin显示为加载控件。(B)Tet-On A549/FDH/pSUPER-p53细胞瞬时转染以表达FDH。通过台盼蓝排除法评估活细胞。转染48小时后用免疫印迹法检测FDH水平。
我们进一步用ActD（放线菌素D）（50nM）处理p53功能性和p53敲除的细胞24小时。Act D被认为通过p53依赖性途径特异性诱导细胞凋亡[33]. 在最初的Tet-On A549/FDH细胞中，Act D处理导致p53升高和强烈的细胞毒性(B和C） ●●●●。另一方面，在p53敲除的细胞中，p53的升高显著降低(B） 这些细胞没有死亡(C） ●●●●。Annexin V分析表明，与p53表达细胞相比，p53被敲除的细胞在FDH诱导或Act D治疗下不会启动凋亡(A） ●●●●。FDH诱导后48小时或Act D治疗开始时，在具有功能性p53的A549细胞中，凋亡细胞的含量分别为32%和36%，而在未经处理的细胞中为0.5%(B） ●●●●。相反，在p53被敲除的细胞中，凋亡细胞的含量处于背景水平（与未处理细胞的0.7%相比，分别为2.3%和3.4%），B） ●●●●。
p53基因敲除抑制FDH诱导A549细胞凋亡(A类)诱导FDH表达或用Act D治疗后，用FACS流式细胞仪检测Tet-On A549/FDH细胞（顶部面板，+p53）和与被敲除的p53相同的细胞（底部面板，−p53）的凋亡。左下方（双阴性）活细胞；右下角（膜联蛋白V阳性，PI阴性），早期凋亡；右上角（双阳性），晚期凋亡；左上角（膜联蛋白V阴性，PI阳性），死亡细胞。控件，非处理单元格。(B)根据(A类).
瞬时FDH表达对HCT116细胞功能性和非功能性p53的影响
我们还比较了FDH在等基因细胞系HCT116 p53+/+和p53−/-中表达的影响[34]. 我们观察到短暂的FDH表达导致p53功能细胞（p53+/+）中p53的积累，并导致强烈的生长抑制(). 相反，在p53缺陷细胞（p53−/−）中FDH的瞬时表达并不抑制增殖().
瞬时FDH表达对p53功能细胞（HCT116 p53+/+）和p53非完整细胞（HCT 116 p53−/-）增殖的影响转染48小时后通过台盼蓝排除法评估活细胞。使用Lipofectamine 2000（阴影条）将pcDNA 3.1/FDH载体转染细胞。用“空”载体（无FDH cDNA插入）模拟转染对照细胞（实心条，无FDH）。通过与表达GFP的载体联合转染评估的转染效率约为35%。添加基因素可以消除未感染的细胞，提高了这种方法的准确性[29]. 上面板：通过免疫印迹分析检测对照（−）和FDH转染（+）细胞中的FDH水平。
FDH表达后p53的细胞内分布
我们研究了在Tet-On A549/FDH细胞中诱导FDH表达后p53的细胞内重新分布。通过p53特异性第一抗体和荧光第二抗体染色监测p53蛋白。诱导后36–48小时，观察到细胞核染色强烈()提示p53从细胞质中移位。染色质特异性染料TO-PRO®-3的反染色证实了当时p53的优先核定位().
诱导A549细胞FDH表达后细胞核内p53的积累最上面一行是用单克隆抗p53抗体（克隆DO-1，Calbiochem）和与Alexa Fluor 488染料偶联的多克隆抗小鼠IgG2a抗体（分子探针）进行免疫染色来检测p53（绿色）。中间一行，细胞核（红色）通过TO-PRO-3碘化物染料（分子探针）的染色体DNA染色成像。最下面一行，覆盖黄色，表示共同定位。通过共焦激光显微镜获得图像。显示诱导FDH表达后的时间（h）。
FDH升高导致p53磷酸化和促凋亡蛋白PUMA的表达
我们检测了FDH诱导后p53的升高是否也伴随着磷酸化。p53的磷酸化发生在多个位点[35]. 在我们的实验中，评估了位于p53反式激活域的Ser-6、Ser-9、Ser-15、Ser-20、Ser-37和Ser-46以及位于调控域的Ser-392的磷酸化。FDH诱导导致p53在Ser-6、Ser-20和Ser-392处磷酸化，而反式激活域中的其他丝氨酸仍然未磷酸化(). 早在FDH诱导后18小时，就观察到Ser-392的磷酸化，而反式激活域中的丝氨酸磷酸化在FDH诱发后24小时开始。我们的实验进一步揭示了促凋亡蛋白PUMA的表达，PUMA是p53诱导凋亡的关键介质[36]，响应FDH诱导(). 我们没有观察到Bax蛋白家族的其他成员，促凋亡的Bax和Noxa以及抗凋亡的Bcl2和BclXL的蛋白水平的变化（结果未显示）。
FDH诱导A549细胞p53磷酸化和凋亡前蛋白PUMA的表达用特定磷酸化残基的抗体检测磷酸化p53。显示FDH感应后的时间（h）。肌动蛋白水平显示为负载控制。
p53的Ser-6突变保护细胞免受FDH诱导的凋亡
为了研究p53的多个Ser残基的磷酸化是否是FDH抑制作用所必需的，我们改变了每个被磷酸化的丝氨酸残基，以响应FDH对丙氨酸的诱导。相应的突变体（S6A、S20A和S392A）在缺乏p53和FDH的H1299肺癌细胞系中与FDH共同表达。野生型p53本身在这些细胞中的表达抑制了增殖，但FDH的存在增强了抑制作用(B） ●●●●。同样，在表达FDH的H1299细胞中观察到较高水平的p53(A） ●●●●。当FDH与S20A或S392A p53突变体共同表达时，这些作用没有改变()：这些突变体中观察到FDH相关的p53积累、细胞死亡增强和凋亡诱导。相反，p53的Ser-6突变为丙氨酸阻止了p53对FDH表达的反应，并完全消除了FDH的p53相关抑制作用().
瞬时表达FDH对表达野生型和突变型p53的H1299细胞的影响(A类)瞬时转染后H1299细胞中FDH和野生型p53的水平。(B)单独用p53转染的细胞的MTT测定（开放条）或与FDH组合转染的细胞的MTT测定（实心条）。(C)有无FDH时H1299细胞中突变p53的水平。(D类)野生型（wt）或突变型p53与FDH共表达后死亡细胞数量的变化（通过MTT分析评估）（显示为仅表达p53后观察到的死亡细胞百分比）。(E类)野生型或突变型p53与FDH共表达后凋亡细胞数量的变化（通过caspase-9/6分析评估）（显示为仅表达p53后观察到的凋亡细胞百分比）。每个条形代表平均值±S。四份独立实验的E.M。
Tet-On A549/FDH细胞中ATP的水平对照，未经处理的细胞+多西环素诱导细胞表达FDH；动作D，用25 nM动作D处理的细胞。显示FDH诱导或动作D处理后的时间（h）。ATP水平显示为时间0时的水平百分比。每个条形代表平均值±S。两个独立实验的E.M.，一式三份。
FDH表达降低细胞内ATP/GTP池
我们假设，FDH通过耗尽细胞内嘌呤核苷酸库对癌细胞发挥其抗增殖作用。ATP是最重要的核苷酸库之一。除了参与DNA/RNA的生物合成和修复外，还需要许多反应来提供能量。我们观察到FDH的表达导致诱导48小时后细胞内ATP水平下降2.5倍(A） ●●●●。相反，用Act D治疗不会导致ATP耗竭(A） ，表明ATP水平的降低是FDH诱导的细胞凋亡的一个特定特征。我们还观察到FDH表达后GTP显著减少，但CTP或UTP没有明显减少(). 总的来说，这些结果表明，FDH升高导致嘌呤核苷三磷酸水平降低。相反，我们没有检测到FDH表达后dNTPs水平的降低（结果未显示）。
表1
诱导FDH表达后p53阳性A549细胞中NTPs（mM）的浓度使用生物发光分析试剂盒CLSII（Roche）测量ATP。GTP、UTP和CTP通过HPLC技术测量，如材料和方法部分所述。平均值±S。ATP的两个独立实验的E.M.为一式三份。其他NTP显示了两次测量的平均值。
| 浓度（mM） |
|---|
| FDH诱导后的时间（h） | 列车自动防护系统 | 全球技术伙伴 | 大学转学分课程 | CTP公司 |
| 0 | 1.55±0.17 | 0.50 | 0.14 | 0.17 |
| 24 | 0.92±0.21 | 0.15 | 0.18 | 0.28 |
| 48 | 0.60±0.16 | 0.06 | 0.11 | 0.21 |
讨论
我们之前已经证明，在p53高产的A549细胞中FDH的表达可诱导G1阻滞和凋亡，并伴有p53及其下游靶点p21的升高[27]. 在大多数情况下，p21是细胞凋亡的负调节剂[37]. 因此，其在FDH诱导的A549细胞中的上调意味着凋亡可能通过额外的p53依赖性机制发生。事实上，据报道，在p53积聚和G1细胞周期停滞的条件下，A549细胞发生p53非依赖性凋亡[38]. 我们早期发现FDH抑制p53缺陷细胞[29]还表明，在这些细胞中，FDH诱导的细胞死亡可能不需要p53。综上所述，这些结果支持了以下可能性：不同细胞系对FDH表达的反应中存在多种细胞毒性机制。虽然在p53高产细胞和p53缺乏细胞中FDH细胞毒性机制的潜在基础尚不清楚，但在目前的研究中，我们已经表明，功能性p53需要在A549细胞中介导FDH诱导的抑制效应。使用RNAi方法敲除p53基因[39]突变型p53对p53功能的显性负性抑制[31]防止FDH在这些细胞中诱导的细胞毒性。在HCT116细胞中进一步证实了功能性p53对FDH抑制作用的需求，这是研究p53依赖性反应的常见模型[34]. 这一发现表明，p53功能性HCT116细胞中FDH的升高诱导了强烈的生长抑制，而p53缺陷性HCT116-细胞的生长不受影响，这意味着p53依赖性通路的激活可能是p53功能癌细胞中FDH-表达诱导的一般下游机制。显然，在p53缺陷细胞中消融FDH诱导的抑制效应首先与缺乏功能性p53的情况下无法激活凋亡有关。
细胞应激反应中p53的积累与Mdm2复合物的释放有关，Mdm2是参与p53泛素化和降解的蛋白质[40,41]. p53的释放和随后的稳定及其作为转录因子的激活可以通过N端反式激活结构域内几个残基的磷酸化发生[40,41]. 此外，特定残基的磷酸化可导致p53启动细胞周期检查点蛋白或凋亡蛋白的转录[1]. FDH介导的p53积累伴随着Ser-6和Ser-20的磷酸化，这两者都与细胞凋亡的激活有关。研究还表明，Ser-6的磷酸化通过增强p53的四聚体化和稳定性来激活p53[42]尽管Ser-20的磷酸化通过减弱其与Mdm2的相互作用导致p53稳定[43]. 此外，Ser-20的磷酸化与p21的诱导相关，p21是p53的转录靶点，参与G1期阻滞[44]. 这与我们的研究一致，研究表明p21的升高与FDH的表达有关[27]. p53 C末端结构域的Ser-392磷酸化，已知可增强p53四聚体的形成并增加其DNA结合能力和转录活性[45,46]在这些实验中也发现了。有人提出，由于四聚体的形成诱导了更有利的构象，Ser-392的磷酸化可能促进反式激活域的磷酸化[42,47]. 我们的研究进一步表明，Ser-6需要介导FDH的抑制作用，而另外两个Ser残基在该模型中并不重要，因此它们的磷酸化可能是一种次要效应。
虽然p53诱导凋亡的机制是靶基因的转录调控，但最近有报道称，细胞质定位的p53通过直接相互作用激活凋亡蛋白Bax，从而发挥诱导凋亡的作用[48]. 此外，p53易位到线粒体，然后抑制抗凋亡蛋白BclXL和Bcl2的凋亡保护功能，可以增加线粒体外膜的通透性，导致细胞色素c（c）释放[49]. 这提示了p53诱导细胞凋亡的潜在替代机制。然而，在我们的实验中，FDH表达后p53移位到细胞核表明，p53的作用是通过凋亡蛋白的转录激活机制发生的。事实上，PUMA的表达是p53转录活性的主要凋亡靶点之一[36]FDH诱导后可见。因此，FDH诱导的p53下游细胞反应，包括细胞周期调节蛋白p21和促凋亡蛋白PUMA的表达，与最近的发现一致，即PUMA和p21之间的平衡在决定p53介导的效应中至关重要[50].
FDH可以通过几种潜在的途径激活p53。首先，FDH可以通过影响细胞内叶酸池间接激活p53。导致p53激活的下游机制可能包括：细胞甲基化改变[18]; 核苷酸库耗竭[7]; 和DNA异常的积累[17]. 其次，FDH对p53的影响可能与其催化功能无关。事实上，越来越多的证据表明，许多酶，即所谓的“兼职”蛋白质，具有多种不相关的功能[51]. 在细胞凋亡中起作用的酶列表，可能与其催化活性无关，包括：细胞色素c（c）[52]，凋亡诱导因子[53]和甘油醛-3-磷酸脱氢酶[54]. 据报道，TS是一种叶酸依赖酶，通过与p53 mRNA的直接相互作用，在翻译水平下调p53[25]. 虽然还不清楚FDH是否可以通过类似的机制发挥作用，但最近解决的FDH N末端结构域的晶体结构表明存在潜在的RNA-结合位点[55]. 如果FDH通过与折叠相关的机制激活p53通路，那么还不清楚FDH是通过激活p53磷酸化激酶之一作用于p53本身还是p53上游。
虽然FDH对p53或其上游效应器的直接影响仍然是一种假设的可能性，但我们的实验中FDH的升高耗尽了ATP/GTP池，这意味着核苷酸相关机制在p53激活中的作用。核苷酸库耗竭对p53的激活可能通过两种机制进行：嘌呤核糖核苷酸耗竭可由p53通过一种尚不清楚的机制直接感测[7]或嘌呤脱氧核糖核苷酸浓度不足，最初可能导致DNA断裂，进而导致p53通路激活[56]. 在我们的实验中，dNTP池没有减少，这表明后一种机制并不参与p53的激活。即使在没有p53的情况下，核糖核苷酸库的耗尽也会在一定程度上影响细胞增殖。事实上，在p53缺陷细胞中观察到FDH诱导后细胞增殖减慢（约30%）。然而，在这些细胞中没有启动细胞凋亡，并且它们对FDH的细胞毒性作用没有反应。
致谢
这项工作得到了国家卫生研究院拨款DK54388的支持。我们感谢Bert Vogelstein博士提供HCT116细胞系；Jennifer Pietenpol博士提供pCEP4-175载体；Yi-Te Hsu博士提供Bax、Bcl2和BclXL抗体；Besim Ogretmen博士，感谢有益的讨论；和Margaret Kelly寻求共焦显微镜协助。共聚焦显微镜在霍林斯癌症中心分子成像核心设施中进行。
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