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EMBO J。2004年1月28日；23(2): 450–459.
2004年1月8日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7600038
PMCID公司：项目编号1271748
PMID：14713950

造血、血管生成和眼部缺陷梅斯1突变动物

Tomoyuki Hisa先生,1,* 莎莉·E·斯彭斯,1,* 瑞夫卡·A·瑞秋,1 藤田正美,1,† 中村拓郎,2 杰罗尔德·M·沃德,三 黛博拉·德沃·亨内曼,三 佐木由纪子,2 Haruo Kutsuna公司,4 利诺·特萨罗洛,1 南希·A·詹金斯,1和尼尔·G·科普兰1,一
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补充资料

摘要

梅斯1和霍克萨9逆转录病毒整合在小鼠髓系白血病和携带白血病的人中上调表达MLL公司易位。在小鼠白血病加速试验中，这两个基因也可以协同诱导白血病，这部分可以通过它们之间的物理相互作用以及同源域蛋白的PBX家族来解释。这里我们展示一下梅斯1-缺陷胚胎的视网膜部分复制，晶状体比正常胚胎小。它们也不能产生巨核细胞，表现出大量出血，并在胚胎第14.5天死亡。此外，梅斯1-缺陷胚胎缺乏形态良好的毛细血管，尽管较大的血管是正常的。突变胚胎中存在明确的髓系红细胞谱系，但集落形成细胞的总数显著减少。突变的胎肝细胞也不能对受到致命辐射的动物起到放射保护作用，即使它们可以重新繁殖所有造血谱系，但在重新繁殖分析中，它们的竞争力很差。这些和其他研究表明梅斯1在造血干细胞（HSC）中高水平表达表明梅斯1HSC的增殖/自我更新也可能需要。

关键词：血管生成、眼睛发育、造血、，梅斯1

介绍

梅斯1在～15%的BXH2髓性白血病中，逆转录病毒整合上调表达(莫斯科等, 1995;中村等，1996年c).梅斯1编码同源域蛋白的三个氨基酸环延伸（TALE）家族的一个成员。在同源域中，MEIS1与同源域蛋白的PBX家族关系最密切。这个家族的创始成员，PBX1型，被确定为TCF3公司(E2A公司)携带t（1；19）（q23；p13.3）易位的人类前B细胞白血病(坎普斯等, 1990;努斯语等, 1990). 此后又发现了三个与PBX1相关的基因(莫妮卡等, 1991;瓦格纳等, 2001)，还有另外三个梅斯1-相关基因(中村等，1996年a;贝特尔森等, 1998). 逆转录病毒整合的大多数白血病梅斯1也有逆转录病毒整合霍克萨7或霍克萨9(中村等，1996年c)，伴随激活霍克萨7或霍克萨9表达式。这一引人注目的集成和激活选择梅斯1与…一致霍克萨7/霍克萨9强烈提示这些基因协同诱导白血病。索瓦戈及其同事提供了更多合作证据(克罗恩等, 1998)他证明小鼠骨髓细胞被设计成过度表达梅斯1和霍克萨9将生长因子依赖性寡克隆急性髓细胞白血病（AML）移植到同基因小鼠体内，诱导时间<3个月。相反，梅斯1过度表达不能单独转化这些细胞，而霍克萨9过度表达诱导AML，但潜伏期较长(托尔斯坦斯多蒂尔等, 2001).

在人类中，HOXA9型熔合到NUP98型携带t（7；11）（p15；p15）易位的AML(借款等, 1996;中村等，1996年b).中小企业1和HOXA9型在人类AML中也经常共存(劳伦斯等, 1999;阿丰贾等, 2000)并且在携带急性淋巴细胞白血病时上调MLL公司易位(罗佐夫斯卡亚等, 2001).中小企业1因此也可能是人类白血病基因。

HOX蛋白与PBX的相互作用增强了DNA结合的亲和力和特异性。体外研究表明，MEIS1还可以通过在含有MEIS1位点和AbdB-like HOX位点的DNA靶上形成异二聚体结合复合物，与HOX蛋白（HOXA9）进行物理相互作用(沈等, 1997). MEIS蛋白也是主要的体内PBX蛋白的DNA结合伴侣(张等, 1997)并能与PBX和HOX形成异三聚体络合物(雅各布斯等, 1999;尚穆加姆等, 1999;沈等, 1999;施纳贝尔等, 2000). 因此，MEIS1和HOX之间合作的基础可能很复杂，可能由异三聚体、异二聚体和/或涉及这些不同蛋白质的同二聚体介导。

的正交对数梅斯1在里面果蝇属在同胸(高温高压)轨迹(里克霍夫等, 1997;派等, 1998). HTH作用于超大陆（EXD）上游，即果蝇属PBX的正交谱，是EXD核定位所必需的。在果蝇属，HTH和EXD具有多种功能，包括调节眼睛发育(派等, 1998)，模仿胚胎周围神经系统(库兰特等, 1998)和近端-远端肢体发育(梅卡德尔等, 1999).

虽然同源异型盒基因最初因其在模式形成中的作用而被确认，但近年来越来越清楚的是，同源异型框基因在造血中也具有重要功能（由，千叶，1998). 考虑到MEIS1作为HOX和PBX DNA结合辅因子的作用及其参与白血病的发生，如果正常造血也需要MEIS1也就不足为奇了。在这里，我们证实了这一预测，并表明携带种系突变的小鼠梅斯1有多种造血功能缺陷。我们也证明了这一点梅斯1是微血管和哺乳动物眼睛发育所必需的，这一作用与最近的一份报告一致，该报告表明MEIS1调节第6页脊椎动物晶状体发育过程中的表达(张等, 2002).

结果

Meis1的定向破坏

这个梅斯1通过用pSAβ基因捕获盒替换部分同源结构域（外显子8）进行敲除突变(图1A). pSAβgeo包含一个剪接受体位点，在所有三个阅读框中都有终止密码子，一个由内部AUG启动的β-半乳糖苷酶-新霉素融合基因，以及一个牛生长激素多聚腺苷化信号序列(弗里德里希和索里亚诺，1991年). 因此，βgeo将从梅斯1突变动物中的启动子。携带该突变的雄性嵌合体与C57BL6/NCr（B6）雌性配对，产生混合B6；129系和129S3/SvImJ雌性产生129系。随后杂合突变动物的杂交未能在297 B6中产生任何纯合突变幼崽；129个杂合杂交后代或239个杂合129个杂交后代，表明梅斯1是胚胎发育所必需的。可行梅斯1−/−B6；在性交后14.5天（dpc）观察到129个胚胎(表I,图1B)，尽管在13.5dpc之后，许多胚胎苍白并出现出血（见下文）。梅斯1−/−129个胚胎在12.5dpc后未被确认，尽管它们有类似的出血。因此，B6和129只动物在一种或多种梅斯1.在随后的实验中，只有来自B6的动物；由于胚胎早期死亡，使用了129个背景梅斯1−/−129个胚胎。

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梅斯1-瞄准磁带。(A类)梅斯1外显子8替换为pSAβ基因陷阱靶向盒。靶向盒还包含由PGK启动子驱动的胸苷激酶基因，用于阴性选择错误靶向的ES细胞。位于第8外显子和第9外显子的同源密码子由黑盒表示。用于Southern blot分析的5′和3′探针显示为条纹盒；的大小囊还显示了I-杂交片段。在靶外显子两侧的内含子和同源重组体的诊断性限制性片段中显示了限制性位点（A，阿帕一、 C、，克拉一、 K、，千磅一、 S、，囊I、 X中，Xho公司一） ●●●●。(B类)B6胚胎E13.5卵黄囊DNA的Southern blot分析；129梅斯1+/−交叉和消化囊一、野生型梅斯1等位基因为6.5kb，而突变的等位基因大小为2.2kb。

表1

梅斯1突变对胚胎致命

 +/++/−活动−/−死亡
B6；129梅斯1−/− 杂交后代
 dpc 10.577三0
 dpc 11.5三216三
 dpc 12.551351
 dpc 13.54771246
 dpc 14.542162
     
129梅斯1−/− 杂交后代
 dpc 10.5212三2
 dpc 11.51三三三
 dpc 12.52331910
 dpc 13.5821021
 dpc 14.541205

正如预期的那样，RT-PCR分析表明梅斯1外显子1-7与突变胚胎中的pSAβgeo序列融合（数据未显示）。相反，当使用外显子7和9的引物进行扩增时，没有检测到扩增产物，这表明梅斯1转录物终止于pSAβ基因序列。使用MEIS1特异性抗体对野生型E13.5胚胎进行Western blot分析，确定了一种野生型46 kDa MEIS1蛋白，该蛋白在突变胚胎中几乎无法检测到。杂合和纯合突变胚胎也表达较小、较微弱的33 kDa MEIS1蛋白(补充图1). 该蛋白的大小与外显子1-7产生的截短蛋白的预测大小大致相同。该蛋白质将包含MEIS homology（MH）结构域，该结构域与PBX相互作用。仅MH结构域在苍蝇体内外表达时会导致表型(颚板等, 2000)，对HTH的突变分析表明，缺少同源结构域的截短形式的蛋白质保留了部分活性(库兰特等, 2001). 因此，这种截短的MEIS1蛋白可能会作为显性阴性，或者说，空表型与我们这里描述的突变动物的表型略有不同。然而，在我们的任何研究中都没有检测到杂合型和野生型同窝出生者之间的差异（见下文），这表明这种蛋白质并不是一种强显性阴性。

Meis1表达式

β-半乳糖苷酶染色，lacZ公司表达式梅斯1发起人（以下简称Meis1-lacZ公司)从胚胎第11天（E11）到第13天，在整个胚胎的特定和离散位置检测到(图2A-D).Meis1-lacZ公司染色与就地使用梅斯1cDNA探针（未显示），但显示了中枢神经系统小区域和头部感觉结构（包括耳朵、眼睛和鼻子）的不同表达模式(图2A和C). 在头部，眼睛有强烈的染色（白色箭头位于图2A和C)和外耳原基（ea-in图2C)在E11处可见，耳蜗神经上皮中也有微弱的表达带（如箭头所示图2E). 其他染色强烈的区域是纵隔（m）和中肠（mg）的软组织(图2A、B和D)脊髓，显示出几条强烈的纵向条纹（黑色箭头；图2B和D). 强烈表达的内脏器官包括所有四个心腔和肺部。这种模式在E13时被重述，并在大脑中进行了一些标记扩展。在E13，在耳蜗管的神经上皮中也观察到一条薄的染色带（如箭头所示图2E). 到了这个年龄，很明显，随着嗅觉上皮的成熟梯度，嗅觉上皮中的标记在背侧到腹侧和内侧到外侧的进展中短暂出现Meis1-lacZ公司仅在上皮的最新部分表达（如箭头所示图2F).

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梅斯1β-半乳糖苷酶染色显示其表达。整体安装(A类,C类,G公司,H（H）)，矢状(B类,D类,我,J)、和横向(E类,F类,K（K）,L（左）)杂合子切片梅斯1+/−（A、C、G、I、K）和纯合子梅斯1−/−E11.5（A，B）和E13.5（C–L）天胚胎发育时的（B，D，E，F，H，J，L）突变胚胎Meis1-lacZ公司表达式。标记了前腹（AP）和背腹（DV）轴。

一般来说，染色梅斯1−/−动物比梅斯1+/−这可能反映出报告基因的剂量较高。然而，有几个明显的差异。在E13，在纯合子（白色星号图2C、F和H)杂合子中完全没有这种表达(图2G). 在杂合子中，Meis1-lacZ公司在E11和E13的肝脏散在细胞中也表达；在纯合子中，E11只在肝脏的少数细胞中观察到表达，E13没有细胞表达。这些细胞是巨核细胞，在缺乏梅斯1活动（见下文）。仅在纯合子（黑箭头位于图2H和L). 相比之下，在杂合子中，但在纯合子中没有，Meis1-lacZ公司在后晶状体中表达（如箭头所示图2K)和表面外胚层（箭头位于图2K).

β-半乳糖苷酶反应阳性的一些结构梅斯1−/−胚胎在E13.5时保持正常的形态和结构。眼睛是一个惊人的例外。在纯合子中，晶状体较小（星号在图2J和I)，但晶状体和表面外胚层之间保持接触（白色箭头图2L). 视网膜也异常（相比之下图2G、I和K到图2H、J和L)并且可能部分重复，尽管这种可能性需要通过额外的标记分析来确认。这些异常在E11（A）处不可见，仅在E13处可见(图2F、H、J和L). 除眼睛外，还观察到大脑、心脏、肺部和肾脏等部位的异常，表明该基因在器官发生中具有多效性作用。虽然这些异常的确切性质尚待阐明，但大脑中的缺陷与已知的梅斯后脑模式中的基因(迪布纳等, 2001;雀等, 2002). 相比之下，在早期阶段，我们没有发现任何明显的近端或远端肢体缺陷果蝇胚胎(梅卡德尔等, 1999). 这令人惊讶，因为MEIS1相关蛋白在两种苍蝇四肢的近轴形成中起着关键作用(Wu和Cohen，1999年)还有鸡肉(梅卡德尔等, 1999). 该基因也在小鼠的近端肢芽中表达(萨利赫等, 2000)和a第1页基因敲除证明了该基因在肢体模式中的强制性作用(塞莱里等, 2001).

Meis1中没有巨核细胞−/−胚胎

显微镜检查显示E13.5的大脑和躯干有大量出血梅斯1−/−胚胎，尽管出血程度在突变胚胎中有所不同(图3A). 对卵黄囊进行详细的显微镜分析，除了卵黄囊血管内失血和出血外，未发现突变和对照窝友之间存在显著的形态学差异梅斯1−/−胚胎似乎与胚胎死亡的时间一致。由于出血可能导致部分（但不完全是，见下文）巨核细胞/血小板缺陷，我们用苏木精和伊红对E13.5杂合和纯合突变胚胎的肝脏进行染色，并对其进行巨核细胞检查。巨核细胞在梅斯1+/−肝脏但不在梅斯1−/−肝脏(图4A和B). 同样，β-半乳糖苷酶阳性巨核细胞也见于梅斯+/−肝脏但不在梅斯1−/−肝脏(图4C和D). 表达巨核细胞标记CD41的细胞(沙蒂尔等, 1985;Gewirtz，1995年)，也缺席了梅斯1−/−肝脏(图4E和F). 这些结果表明梅斯1在巨核细胞中表达，对其发育至关重要。

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的表型梅斯1突变胚胎和移植受体。(A类)一个野生型E13.5和两个梅斯1−/−突变体B6；129个室友。在这个阶段，大多数梅斯1−/−胚胎脑和躯干出血。不同突变胚胎的出血程度不同，大多数胚胎在右侧胚胎中表现出非常广泛的出血。(B类)2×10移植后130天及以上骨髓细胞的FACS分析6 赖氨酸5.1+来自（A）所示胚胎的胎肝细胞与5×10混合5野生型C57BL/6-赖氨酸5.2+成人骨髓细胞移植到致命照射的C57BL/6-赖氨酸5.2+主机。移植受者用FITC-标记的抗体染色赖氨酸5.1+或赖氨酸5.2+区分供体和宿主造血细胞的细胞。

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巨核细胞缺陷梅斯1突变胚胎。E13.5肝脏石蜡切片苏木精和伊红染色梅斯1+/−或梅斯1+/+胚胎(A类,C类,E类)与相比梅斯1−/−(B类,D类,F类)胚胎中的大细胞与巨核细胞一致梅斯1+/−和梅斯1+/+胚胎（箭头（A））。这些细胞在梅斯1−/−E11（B）的胚胎。同样，β-半乳糖苷酶染色在大肝细胞（即巨核细胞）亚群中发现梅斯1+/−胚胎（箭头（C）），但该细胞群在梅斯1−/−胚胎（D）。巨核细胞标志物CD41的免疫反应性(Gewirtz，1995年;沙蒂尔等, 1985)通常出现在E13.5的肝细胞亚群上（（E）中的褐斑），也缺乏梅斯1−/−胚胎（F）。

为了证实这些观察结果，我们培养了E13.5胎肝细胞体外在血小板生成素、白介素-3（IL-3）和白介素-6的存在下。这些培养条件刺激造血巨核细胞祖细胞，即集落形成单位-巨核细胞（CFU-Meg）生长体外(考珊斯基，1995年;Broudy和Kaushansky，1998年). 6-8天后，对培养物进行乙酰胆碱酯酶活性染色，并对乙酰胆碱酶阳性的CFU-Meg数量进行评分。在一个实验中，从5×10的培养基中获得的CFU-Meg菌落平均得分为7.2±2.44野生型胎肝细胞(n个=4），而在梅斯1+/−文化(n个=4). 相反，在来源于梅斯1−/−胚胎(n个=4，数据未显示）。在其他两个实验中也观察到类似的结果。

最近的研究表明，MEIS1/PBX复合物可以协同反式激活血小板因子4(第4页)与GATA1和ETS1结合的基因(冈田等, 2003).第4页是巨核细胞分化后期出现的谱系特异性标记(Breton-Gorius和Vainchenker，1986年). 维甲酸，一种上游激活剂梅斯1在脊椎动物肢体发育中，在血小板生成素或IL-3和GM-CSF的存在下也刺激巨核细胞生成(维萨尼等, 1999). 这些结果增加了MEIS1可能是巨核细胞基因表达的主调节器的可能性。

Meis1骨髓红细胞集落形成细胞减少−/−胎儿肝脏

确定其他造血谱系是否受到影响梅斯1−/−突变胚胎，2×104来自E13.5胚胎的胎肝细胞在甲基纤维素中在SCF、GM-CSF、G-CSF和EPO中生长6-8天，并根据BFU-E、CFU-E、GM-CFU和CFU-mix菌落的形态学标准对菌落进行评分。双侧t吨-总细胞数的测试梅斯1−/−胎肝（4.3×106±3.1 × 105,n个=40例肝脏）（平均值和标准误差）显示减少(P（P）<0.001,t吨=6.361，68自由度）与野生型（7.5×106±4.1 × 105,n个=30肝脏）或梅斯1+/−(5.9 × 106±3.3 × 105,n个=61) (P（P）=0008,t吨=3.472，99自由度）胎肝。年每个肝脏的大肠杆菌总数梅斯1−/−与野生型肝脏相比，胚胎也减少了2到5倍(图5). CFU混合菌落受影响最大（五倍），而受影响最小的是GM-CFU菌落（两倍）。中的造血缺陷梅斯1−/−因此，胚胎并不局限于巨核细胞。

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骨髓红细胞集落形成细胞减少梅斯1−/−胎儿肝脏。从E13.5野生型和梅斯1突变胚胎和骨髓红细胞集落形成细胞的存在评分。所示数据表示与野生型重复镀层的平均值和标准偏差(n个=3，交叉阴影条），梅斯1+/−(n个=5，水平阴影条）和梅斯1−/−(n个=2，实心棒材）胎儿肝脏，是两个独立实验的代表。

梅斯1−/−胎儿肝细胞在重组分析中竞争很差

确定是否梅斯1−/−胎肝细胞能重建2×10致死照射小鼠的造血系统6将E13.5胚胎的胎肝细胞转移到致死性辐射宿主。所有老鼠接受梅斯1−/−单元格(n个=5）移植后10天内死亡，而接受野生型(n个=4）或梅斯1+/−(n个=7）细胞存活40天（数据未显示）。梅斯1−/−因此，胎儿肝细胞无法对致命辐射小鼠进行辐射防护。这些数据与观察到的髓系红细胞集落形成细胞减少相一致体外在里面梅斯1−/−胎儿肝脏。

确定确定多潜能造血祖细胞在梅斯1−/−胚胎，2×106E13.5突变胚胎的胎肝细胞与5×10混合5野生型C57BL/6NCr-赖氨酸5.2+成人骨髓细胞并注射到致命照射的C57BL/6NCr中-赖氨酸5.2+主机。梅斯1突变胚胎是赖氨酸5.1+因此，该细胞表面标记可用于跟踪梅斯1移植宿主中的突变细胞。所有接受突变和野生型细胞混合的小鼠在移植后130天存活，只有一只动物死于与移植无关的原因（数据未显示）。突变体Ly5.1版本+然后通过FACS分析对长期重建受体的造血细胞进行评分。小鼠骨髓移植梅斯1−/−细胞含18.1±7.7%赖氨酸5.1+细胞，而85.3±5.2或85.9±2.2%赖氨酸5.1+收件人中的单元格接收梅斯1+/+或梅斯1+/−单元格，分别(图6). 然而，移植过程中有一些变化，因为有三个受体接受了梅斯1−/−细胞的植入率分别为30%、48%和72%赖氨酸5.1+细胞。这些移植受者总是植入从减少出血的胚胎中提取的细胞(图3B). 这些胚胎可能携带一个或多个梅斯1保护它们免受梅斯1损失，或者，与梅斯1−/−大量出血的胚胎赖氨酸5.1+造血干细胞（HSCs）能够重新填充受照射宿主的造血系统。

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梅斯1突变胎儿肝细胞在造血重建测定中竞争较差。从N7 C57BL/6产生的E13.5胚胎中分离出200万胎肝细胞-赖氨酸5.1+ 梅斯1+/−交叉加4×105来自C57BL/6的成人骨髓细胞-赖氨酸5.2+将小鼠移植到照射过的C57BL/6-赖氨酸5.2+主机。通过卵黄囊DNA的Southern blot分析确定每个胚胎的基因型。移植后130天或更长时间，来自野生型胎儿肝细胞的受体（闭合方块，n个=3),梅斯1+/−（闭合圆，n个=11），或梅斯1−/−胚胎（闭合三角形，n个=10）进行供体植入分析(赖氨酸5.1+细胞）。水平线表示植入的平均水平。

脾脏中的植入水平与骨髓中观察到的植入水平相似。在脾脏中，接受梅斯1−/−个单元格赖氨酸5.1+相比之下，接受治疗的受试者为86.0±3.2或82.9±2.7%梅斯1+/+或梅斯1+/−单元格，分别(图6). 在胸腺中，接受梅斯1−/−个单元格赖氨酸5.1+相比之下，接受治疗的受试者为93.6±0.3或79.9±5.2%梅斯1+/+或梅斯1+/−单元格，分别(图6). 在三只小鼠中，显示>30%的梅斯1−/−骨髓中的细胞，增加梅斯1−/−所有小鼠的脾脏（25%、25%、29%）和一只小鼠的胸腺（21%）也可见细胞。

进一步分析骨髓中植入率>30%的小鼠的骨髓、脾脏和胸腺中是否存在赖氨酸5.1+表达原始祖细胞（CD117、CD34）或更多承诺谱系受限细胞（Mac-1、Gr-1、CD61、Ter119、B220、CD3、DX5）特征的细胞表面标记的细胞（数据未显示）。这些研究表明梅斯1−/−在移植宿主中，细胞能够分化为粒细胞、中性粒细胞、红细胞、B细胞和T细胞以及NK细胞，尽管与移植的动物相比，每种细胞类型的移植整体水平严重降低梅斯1+/+或梅斯1+/−细胞。

Meis1中的血管生成缺陷−/−胚胎

尽管梅斯1−/−胚胎不能生成巨核细胞/血小板，这不太可能单独导致梅斯1−/−胚胎自氮铁合金2−/−由于巨核细胞成熟受阻而导致血小板缺陷的突变胚胎(希夫达萨尼等, 1995)，出生时人数正常，没有出血子宫内.确定出血是否发生在梅斯1−/−突变胚胎可能由血管生成缺陷（中胚层衍生内皮细胞前体分化为血管通道）或血管生成（小血管和微血管的形成）引起梅斯1−/−E13.5的突变胚胎和对照幼崽(图7). 在梅斯1−/−胚胎α-平滑肌肌动蛋白（SMA）和内皮细胞标志物PECAM（CD31）的表达异常。与正常胚胎不同，这些分子的抗体勾勒出具有清晰管腔和一致大小的分支毛细血管(图7A和C)在突变胚胎中，这些标记紧密结合，但未能描绘出清晰的管腔(图7B和D). 此外，血管的分支模式和大小也异常。在正常胚胎中，毛细血管刚好大到可以容纳红细胞（RBC）(图7C)，在中时梅斯1−/−胚胎——小血管太窄，不能容纳红细胞(图7B和D)或在红细胞聚集处形成较大的窦。在周围组织的微血管外也发现了大量游离红细胞梅斯1−/−胚胎。相反，主要血管在梅斯1−/−胚胎(图7E和F).

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梅斯1突变胚胎有血管生成缺陷。共焦图像(A类–F类)获得PECAM/CD31（红色）和SAM（绿色）从正常（A、C、E）和梅斯1−/−突变（B，D，F）E13.5胚胎。Nuclei标有DAPI（蓝色）。将一组15–20μm的图像组合在一起，生成一个三维投影（A，B），显示正常（A）的毛细血管分支，管腔清晰，但突变（B）缺乏这种结构。正常毛细血管大小一致，而梅斯1−/−组织没有（A、B箭头所示）。在1μm共聚焦图像中，红细胞通常充满毛细血管的管腔（C中的箭头）。在中缺少此功能梅斯1−/−胚胎，形成不规则和紊乱的微血管（D）。主要血管显示PECAM（红色）和SMA（绿色）的精确共定位，产生黄色信号（E，F）。大血管（如离开胸腔的大动脉）存在于梅斯1−/−胚胎和显示正常管腔形成（F）。共焦图像(G公司–我)用MEIS1（红色）和PECAM/CD31（绿色，G，H）或SMA（绿色，I）抗体染色的野生型E13.5胚胎切片。Nuclei标有DAPI（蓝色）。胚胎的不同区域显示MEIS1和PECAM接近但不重叠（G）。其他血管生成区域表达PECAM而不表达MEIS1（H）。然而，其他区域的血管生成标记物（SAM）和MEIS1均为阳性。原始放大倍数，100×。

确定是否在梅斯1−/−胚胎是细胞自主的或非细胞自主的，我们分别用MEIS1和PECAM或SMA抗体（血管内皮和血管平滑肌标记物）对E13.5野生型胚胎的组织切片进行染色。虽然我们有时观察到MEIS1在PECAM和SMA附近的表达，但我们没有发现MEIS1和PECAM的位点与SMA表达之间存在直接相关性(图7G–I). 此外，PECAM-1和SMA通常在缺乏MEIS1表达的区域中发现，反之亦然。我们还观察了个人Meis1-lacZ公司-脊髓背侧出血区的阳性细胞梅斯1−/−胚胎，但不是毛细血管模式（数据未显示）。此外，我们在任何地区都无法检测到Meis1-lacZ公司以血管特异性模式表达。综上所述，这些结果表明梅斯1−/−胚胎在MEIS1表达方面是细胞非自主的，尽管需要有条件的基因敲除来确认这些结果。

讨论

这里我们展示一下梅斯1是同源异型盒基因TALE家族的成员，是胚胎生存、眼睛发育和维持最终造血所必需的。梅斯1-缺陷胚胎也缺乏巨核细胞，大脑和躯干出现广泛出血，血管生成缺陷。观察到的眼部缺陷梅斯1−/−胚胎与最近的研究表明一致梅斯1是的调节器第6页前瞻性晶状体外胚层的表达(张等, 2002).第6页是后生动物眼睛发育的关键调节器第6页一直难以捉摸。强烈的前后条纹梅斯1从眼睛到鼻子的面部表情也在梅斯1−/−胚胎。此表达式在中缺失梅斯1+/−胚胎。这种异位表达的原因尚待确定，但有一种可能是它代表了额外的眼原基的存在。这一假说的证据来自苍蝇，其中HTH和EXD作为眼睛的负调节因子发挥作用，并划定视野(派等, 1998).

未发现原始造血缺陷梅斯1−/−胚胎。然而，最终造血始于梅斯1−/−胚胎肝定向祖细胞集落形成和辐射宿主移植后多系重组证明了突变胚胎梅斯1−/−突变胎儿肝细胞(巴利语等, 1999). 与野生型和杂合突变细胞相比，E13.5梅斯1−/−在重组分析中，细胞竞争很差，这表明HSC的数量可能减少和/或更多承诺祖细胞的增殖或分化缺陷。梅斯1在胚胎发育中似乎比其他转录因子（如GATA3）作用较晚(潘多尔菲等, 1995)，运行NX1(奥田等, 1996;王等，1996年a)或CBFB(王等，1996年b)在最终造血中产生更严重的缺陷。这些突变胚胎的出血和死亡发生在11.5至12.5 dpc之间。

铅x1和梅斯1突变动物有几个共同的表型，包括最终造血缺陷(迪马蒂诺等, 2001). 这很有趣，因为PBX1是一个专业体内MEIS1的DNA-binding合作伙伴。明确的骨髓红细胞系存在于第1页和梅斯1突变体动物，并且两种动物中的克隆形成细胞数量都显著减少(迪马蒂诺等, 2001).第1页−/−胎肝细胞在竞争性再填充分析中也表现不佳梅斯1−/−胎儿肝细胞。这两个突变体也显示肾脏发育缺陷(施纳贝尔等, 2003以及我们未发表的观察结果）。然而，这两种突变表型存在一些差异。梅斯1突变动物不会出现骨骼异常第1页−/−老鼠(塞莱里等, 2001). 它们也不能制造巨核细胞/血小板，并且表现出广泛的出血，这与第1页−/−变异动物，能产生血小板，不会出血。第1页−/−胚胎发育较晚死亡梅斯1−/−胚胎（15.5-16.5 dpc与12.5-14.5 dpc）。第1页−/−尽管胎肝细胞的辐射防护效果只有致死辐射小鼠的一半第1页+/+单元格(张等, 1997)，相比之下梅斯1−/−这些细胞无法对受到致命辐射的小鼠进行辐射防护。也许其他能与MEIS1相互作用的PBX蛋白可以部分补偿第1页在基因敲除小鼠中。

梅斯1以Sca-1中的最高水平表示+林−成人骨髓和E14.5胎儿肝脏的分数(皮诺等, 2002). 该部分在HSC中高度富集(叛军等, 1996). 相反梅斯1在更坚定的祖先中，几乎无法检测到或无法检测到。发病与梅斯1胚胎体发育中的表达和造血细胞的出现(皮诺等, 2002). 许多霍克斯基因在Sca1中的表达水平最高+林−分数和在造血分化过程中迅速下调(皮诺等, 2002)，研究结果与MEIS1作为HOX辅助因子在正常造血中的主要作用一致。梅斯1因此，可能需要HSC的增殖/自我更新，这一假设得到了本文研究的支持，并且梅斯1−/−胎儿肝细胞可有效促进致命辐射受者移植后的多个造血谱系。

HSC产生血管生成素（AGPT），这是一种对血管生成至关重要的分子(高椋等, 2000). 胚胎缺乏HSC(高椋等, 2000)，或在以下方面存在缺陷Agpt公司(萨里等, 1996)或AGPT受体第1级和第2级(普里等, 1995;佐藤等, 1995)在E9.5和E13.5之间表现出微血管化缺陷和广泛出血和死亡。这些结果表明梅斯1−/−胚胎在MEIS1表达方面是细胞非自主的，为HSC缺陷提供了进一步证据梅斯1−/−胚胎和暗示出血梅斯1−/−动物是由于AGPT分泌减少和无法形成正常微血管通道导致HSC缺陷所致。

材料和方法

Meis1突变动物

梅斯1外显子8被pSAβ基因盒替换(图1A). 使用0.5 kb的Southern印迹法鉴定同源靶向事件囊我-千磅I（5′）或1.9 kb囊我-Xho公司I（3′）探头(图1A)，使用Megaprime DNA试剂盒进行标记（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。分离出几个携带敲除等位基因的独立ES细胞克隆，并通过标准技术将突变引入种系。在美国国家癌症研究所（Frederick），小鼠在有限的接触条件下进行饲养，并根据批准的动物护理和使用委员会协议，按照《实验动物护理和应用指南》中概述的程序提供动物护理。

免疫组织化学和共聚焦分析

胚胎采集时间为12.5–13.5 dpc，阴道塞检测早上为0.5 dpc。从子宫中分离胚胎，并将其固定在PBS中4%的多聚甲醛中。在一些研究中，胚胎被石蜡包埋。脱蜡后，将嵌入的胚胎切片与大鼠抗小鼠CD41抗体（MWReg30，BD Pharmingen，San Diego，CA）一起孵育，然后与用抗生物素/生物素化酶复合物标记的针对大鼠IgG抗体的生物素化抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA）一起孵育。用3，3′-二氨基联苯胺（Vector Laboratories）作为显色剂检测到信号。在其他研究中，胚胎被嵌入3%琼脂糖中，经振动体切割，并用DAPI（分子探针，Eugene，OR）和PECAM/CD31抗体（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥）和SMA（Dako，Glustrup，丹麦）进行免疫染色。二级抗体是Cy2-和Cy3-结合的山羊抗鼠或山羊抗鼠IgG（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch）。图像是在蔡司510共焦激光扫描显微镜（德国卡尔蔡司）上采集的。为了对血管进行三维分析，采集了大量图像，并将其转换为最大强度投影。

X-gal染色

用1 mg/ml X-gal（US Biological，Swampscott，MA）、4 mM K、4铁（CN）63小时2O、 4毫微米K三铁（CN）6，2 mM氯化镁2在PBS中检测β-半乳糖苷酶（β-gal）活性。

骨髓红细胞集落分析

巨核细胞集落形成单位用5×10平板测定4在含有50ng/ml人血小板生成素（R&D Systems，Minneapolis，MN）、10ng/ml鼠白细胞介素-3（IL-3）和20ng/ml鼠白细胞介素-6（PeproTech，Rocky Hill，NJ）的基于胶原的培养基（干细胞技术公司，温哥华，BC）中的室培养玻片上的胎儿肝细胞。培养6-8天后，根据制造商的说明对载玻片进行乙酰胆碱酯酶活性染色，并对细胞中存在的红棕色至棕黑色颗粒进行评分。BFU-e、CFU-e、CFRU-GM和CFU-mix通过电镀2×10进行分析4胎肝细胞置于甲基纤维素培养基（M3334，干细胞技术）中的35 mm培养皿中，含有3单位/ml的EPO，并补充20 ng/ml的SCF、5 ng/ml小鼠GM-CSF和5 ng/ml小鼠G-CSF（PeproTech）。菜肴在加湿的5%CO中孵化2电镀后3-8天，在37°C的环境下对菌落进行计数。

胎儿肝移植

8至12周龄雌性C57BL/6-赖氨酸5.2。小鼠接受1100 rads的辐射137铯源以每分钟167拉德的速率产生。4小时后，2×106E13.5 B6.129产生的胎肝细胞梅斯1+/−通过尾静脉注射将杂交种移植到受照宿主体内。在一些实验中，4–5×1058至12周龄雌性C57BL/6Ncr的骨髓细胞-第5.2页小鼠与胎肝细胞一起注射。从移植受者的造血器官和红细胞中提取单细胞悬浮液，并将其在冷冻ACK裂解缓冲液（Quality Biological，Gaithersburg，MD）中培养10分钟。细胞在DPBS、1%胎牛血清（FCS，Atlanta Biologicals，Norcross，GA）中洗涤两次，然后用2μg/10培养6细胞-大鼠抗鼠CD16/CD32抗体（2.4G2，BD Pharmingen，加州圣地亚哥）在冰上30分钟，在DPBS、1%FCS中洗涤两次，并在冰上与异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）结合抗体（BD Pharmingen）孵育30分钟：0.5μg/106大鼠抗鼠CD3（17A2）、CD4（GK1.5）、CD8a（53-6.7）、CD19（1D3）、CD23（B3B4）、CD25（PC61）、CD34（RAM34）、CD45/B220（RA3-6B2）、CD62P（RB40.34）、CD117（ACK45）、Gr-1（RB6-8C5）、Ly-76（Ter119）细胞和同型对照（R35-95和MWReg30）细胞0.125μg/106大鼠抗小鼠CD11b细胞（M1/70）和0.25μg/106细胞小鼠抗小鼠CD45.2(赖氨酸5.1，104）和CD45.1(赖氨酸5.2，A20）。然后将细胞在DPBS（1%FCS）中清洗两次，固定在1%多聚甲醛/PBS中，并在FACS卡介仪流式细胞仪上进行分析（加利福尼亚州圣何塞市Becton Dickinson）。与同种对照抗体相比，测定植入百分比。

补充材料

补充图1。野生型蛋白质印迹分析，梅斯1+/−和梅斯1−/−使用MEIS1特异性抗体在E13.5的胚胎。标记区分别含有30、40、50和60kDa的蛋白质。在其他通道中，每孔装载100μg蛋白质。MEIS1抗体识别野生型（WT）小鼠中约46 kDa的蛋白质。杂合突变胚胎(让开/+)表达46kDa的蛋白质和较弱的33kDa的蛋白质。纯合突变胚胎(让开/让开)几乎只表达33kDa蛋白。

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鸣谢

我们感谢Deborah Swing、Holly Morris和Sandra Grimm对动物的处理，感谢Debra Gilbert、Norene O'Sullivan、Deborah-Householder、Anna Trivett和Tukari Yamazaki的技术帮助，感谢Linda Cleveland的测序，感谢Eileen Southon的ES操作，感谢Mary Ellen Palko提供引物，感谢Ed Cho的共焦显微镜协助，基思·罗杰斯（Keith Rogers）负责病理咨询，琳达·布鲁贝克（Linda Brubaker）和玛德琳·诺贝尔（Madeline Knoebel）负责秘书助理，迈克尔·克利里（Michael Cleary）负责批判性阅读这份手稿。这项研究得到了日本教育、科学、体育和文化部和美国DHHS国家癌症研究所对优先领域C科学研究的资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由提供自然出版集团