Gli2和Gli3定位于纤毛并需要鞭毛内转运蛋白Polaris进行加工和功能

刺猬信号通路被抑制Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体

与之前肢体和神经管的数据一致[18–20]，Shh信号的两个下游靶点没有显著表达，第1部分和Gli1，在里面Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}无效突变肢芽(图2A和​和2B）。2B） ●●●●。这些数据表明，尽管Shh在这些突变体中正常表达，但由于北极星的缺失，Shh的释放或接收受到损害。这些结果证实了我们的评估，即IFT突变体肢体表型不是由于Shh途径的异位激活Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体类似于Gli3公司^−/−;嘘^−/−胚胎[13,14].

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图2

Shh信号有缺陷Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体

（A和B）的原位杂交分析第1部分（A） 和Gli1公司（B） 表达表明它们不表达于Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变胚胎（E10.5；右面板），因为它们是野生型对照（E10.5，左面板）。

（C） 用ShhN-CM培养野生型肢芽细胞导致Gli1公司和第1部分与载体条件培养基相比，表达（左侧车道），而从Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体肢芽（右车道）。每条车道下方显示了肌动蛋白标准化诱导的相对水平。

缺乏北极星的细胞无法对ShhN做出反应

为了测试Polaris是否需要接收Shh，我们从Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体和野生型肢芽（E11.5），并在ShhN-CM中培养细胞。通过诱导第1部分和Gli1公司使用半定量逆转录PCR（RT-PCR）进行表达。虽然野生型细胞对ShhN-CM有强烈反应，但缺乏Tg737型表达量没有增加第1部分或Gli1公司相对于对照处理细胞(图2C） ●●●●。这些数据表明，在存在配体的情况下，需要在Shh反应细胞中使用Polaris来激活Shh信号通路。

北极星缺失导致Gli活性和加工发生改变

遗传研究表明，IFT功能是Shh信号下游所必需的第1部分，可能在Gli函数级别[18–20]. 为了进一步探讨Gli活性和Polaris之间的联系，我们使用了腺病毒[21]表达全长Gli蛋白Tg737型空单元格。先前的结果表明，Gli1和Gli2的异位表达可以诱导Shh靶基因的转录，而Gli3被证明可以抑制Gli1介导的转录[8,21,22]. 如野生型细胞所示Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}含有全长Gli1的原代肢体细胞导致第1部分与仅绿色荧光蛋白（GFP）病毒感染相比(图3A） ●●●●。这表明Gli1介导的通路激活不需要Polaris功能。然而，感染Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}含有表达Gli2病毒的原代肢体芽细胞未能诱导第1部分转录(图3B） 提示Gli2功能需要Polaris的活性。目前尚不清楚Gli2在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体是由于Polaris对Gli2稳定性或其他翻译后调节的要求。如之前的研究所示，当在野生型细胞中共存时，感染全长型Gli3的细胞能够抑制Gli1介导的转录[22]. 然而，在缺乏Polaris的细胞中，全长Gli3无法抑制Gli1的通路激活，这可以通过增加第1部分表达式(图3A） ●●●●。

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图3

Gli2和全长Gli3功能中断Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变细胞

（A） 用表达Gli1:：GFP的腺病毒感染原代肢体芽细胞（E11.5）诱导增加第1部分与仅感染GFP病毒（GFP）相比，野生型细胞中的转录。野生型细胞与Gli1：：GFP和Gli3：第1部分当与仅用Gli1:：GFP感染的细胞相比时的表达。如野生型细胞所示Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}Gli1:：GFP诱导的突变体第1部分表达式。然而，全长Gli3:：GFP不能抑制Gli1:：GFP-介导的第1部分在没有北极星的情况下(Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}). 在没有逆转录酶（−RT）的对照组中没有发现表达。

（B） 表达Gli2:：GFP的腺病毒诱导的野生型细胞感染第1部分表达；然而，在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}原代肢体芽细胞，与仅GFP病毒（GFP，右车道）感染相比，感染表达Gli2:：GFP的腺病毒未能诱导通路。

（C） 对整个E11.5野生型胚胎（左车道）分离的蛋白质进行Western blot分析表明，Gli3主要以加工阻遏物形式（Gli3R）存在。虽然一些Gli3R在突变样本中明显存在，但在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}变种人（右车道）。

（D） 野生型或Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}含有Gli1:：GFP和截短Gli3R:：GFP的突变细胞表明，Gli3R能够抑制Gli1介导的第1部分.

（A）、（B）和（D）中每条车道下方的数字表示第1部分相对于所示实验的肌动蛋白对照。

Polaris缺失抑制Gli3处理

上述数据增加了失去Polaris会损害全长Gli3向截断阻遏物形式转化的可能性。为了确定这种情况是否属实，我们检测了野生型和加工型Gli3的水平Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}使用Gli3抗血清（王建民的礼物）通过Western blot分析整个胚胎（E11.5）。与之前公布的结果一致[19,20]中，全长Gli3与加工型Gli3R的比率显著增加Tg737型突变体(图3C） ，尽管一些Gli3R是明显的。总之，这些数据表明Polaris是高效处理Gli3所必需的。

为了确定Gli3介导的抑制在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体是由于全长Gli3加工成阻遏物形式的缺陷所致，我们用截短形式的Gli3（Gli3R）感染原代细胞，并分析其对Gli1介导的转录的影响。在野生型和Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体细胞，Gli3R的加工形式能够作为Gli1诱导的第1部分(图3D） ●●●●。这些结果表明，用全长形式观察到的Gli3活性丧失是由于加工缺陷，而不是阻遏活性丧失或转运到细胞核。

北极星功能的部分丧失加剧了胶质细胞3杂合突变体

我们预测，如果需要Polaris进行适当的Gli3处理，那么Polaris功能的部分损失如Tg737型^奥普克低形态等位基因会加重Gli3公司杂合子小鼠并导致更令人想起的表型Gli3公司null突变体。为了评估这种可能性，我们越过了Tg737型^奥普克/+杂合小鼠Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^奥普克/+复合杂合子，并将产生的表型与胚胎的基因型相关联。杂合的Gli3公司^Xt-J公司/+小鼠是活的，并且表现出一个额外的前轴指，类似于纯合子中的数字Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}突变体[6,12,23]. 相反，纯合的Gli3公司^Xt-J/Xt-J突变体是不活动的，每个肢体有8-10个无图案的手指Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}空突变体[12]. 有趣的是，没有可行的Gli3公司^X吨-J/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}获得了后代（0/64只幼崽；7窝）。早期发育阶段的分析表明Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}小鼠在妊娠期间死亡，并伴有严重的发育异常，包括每肢6-9个手指、前脑、腹部闭合缺陷和水肿(图4A–4E；数据未显示）。这些表型不是Gli3公司^X吨-J/+杂合子或Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}纯合小鼠单独存在，但在Gli3公司^Xt-J/Xt-J纯合子突变体。

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图4

Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}胚胎很像Gli3公司^Xt-J/Xt-J空白胚胎和对ShhN-CM有反应

（A） 观察到的无脑畸形示例Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}从未在胶质细胞3^{Xt-J公司/ +}或Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}只有突变体。

（B–E）功能交互Gli3公司和Tg737型在数字发展方面。鉴于Gli3公司^X吨-J/+（C） 和Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}（D） 每个胚胎发育一个额外的轴前指（星号），Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}与野生型胚胎（B）相比，胚胎（E）发育出多个异位指。前面是顶部。

（F） 培养来自胶质细胞3^+/+;Tg737型^+/+,Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^+/+、和Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}ShhN-CM突变小鼠导致Gli1公司与用对照培养基处理过的同一胚胎的细胞进行比较，这是通过定量RT-PCR分析确定的。报告了所示基因型的四个同窝婴儿的结果。每个样品分析两次，结果以平均倍数增加的形式报告。不同于Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}（null）突变体，对ShhN-CM无反应Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}样本能够响应并激活该通路，表明Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}表型与Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}（null）突变体，但Gli3公司^Xt-J/Xt-J.

虽然两者都是Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}和Gli3公司^Xt-J公司突变小鼠具有相似的数字模式表型，Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体不表达第1部分或Gli1公司在后肢萌芽时Gli3公司^Xt-J公司突变体的表达域第1部分或Gli1公司展开。确定肢体图案缺陷是否Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^orpk或orpk突变体是由于Shh反应性丧失所致，如Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体，或更接近于Gli3公司^Xt-J公司突变体，我们测试了从这些胚胎中获得的原代细胞的诱导能力Gli1公司表达对ShhN-CM的反应。与Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体，Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}细胞对ShhN-CM的反应是Gli1公司当通过定量RT-PCR分析时，尽管与野生型细胞相比水平有所降低(图4F） ●●●●。与定量RT-PCR数据一致，Gli1公司通过原位杂交观察到所有胚胎后部的表达（数据未显示）。在Gli3公司^Xt-J公司/+或Gli3公司^X吨-J/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}胚胎与野生型相比（数据未显示）。这些数据共同表明Gli3公司^Xt-J公司/+;Tg737型^{orpk/orpk（orpk/orpk）}表型与胶质细胞3纯合子比Tg737型零突变体，对ShhN-CM无反应。

定位于纤毛的Shh信号通路的外源表达成分

众所周知，Shh信令需要IFT[18,19]目前尚不清楚这是由于在Shh通路激活中需要纤毛，纤毛产生次级信号，还是IFT的一种新的非纤毛作用。为了区分这些可能性，我们评估了参与Shh信号通路的几个关键蛋白的亚细胞定位，包括Gli1、Gli2、Gli3、Gli3R和Sufu相对于纤毛和IFT蛋白Polaris的亚细胞位置。

在Gli1、Gli2、Gli3和Gli3R蛋白的情况下，定位是通过原发性感染确定的Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}带有腺病毒载体的突变体和野生型肢芽细胞表达全长Gli蛋白或截短的Gli3R融合到GFP[21]. 进行感染，使得大于75%的细胞表达GFP。在这些研究中，我们将重点放在外源性表达水平低的细胞上，以尽量减少过度表达对蛋白质定位的影响。对于所有三种全长Gli蛋白，在表达高水平GFP的细胞的细胞核中检测到表达(图5; 数据未显示），如前所述[22]. 然而，我们也在所有表达标记蛋白的细胞中检测到GFP的一个小区域，该标记蛋白位于纤毛轴丝附近，如抗乙酰化α-微管蛋白抗体所示(图5A–5C） ●●●●。GFP信号未能与γ-微管蛋白（基底体标记物）共定位，表明Gli:：GFP蛋白不定位于纤毛基底部的基底体(图5E；数据未显示）。相反，GFP信号被发现与Polaris的一个子域共定位(图5F和​和5G；5G；数据未显示）.Gli:GFP与Polaris结构域共定位，但不与γ-微管蛋白共定位，表明全长Gli蛋白集中在纤毛顶端，但不集中在基部。用ShhN-CM治疗感染细胞并没有改变Gli1、Gli2或Gli3在纤毛远端的分布（数据未显示）。然而，由于GFP融合到Gli蛋白的C末端，因此很难评估定位的任何变化。因此，在全长Gli3的情况下发生的处理过程将移除GFP标签，并阻止被截断的N末端形式的蛋白质进入细胞核。

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图5

GFP标记的Gli蛋白在原代肢体细胞培养中定位于纤毛末端

（A–D）从E11.5野生型胚胎的肢芽中分离出细胞，并感染所示腺病毒。所有三个全长GFP标记的Gli蛋白（绿色）都定位于纤毛轴丝中的一个域，这可以通过抗乙酰化α-微管蛋白染色（红色）观察到。相反，Gli3R:：GFP仅限于细胞核，在该域（D）中未检测到。

（E） 全长Gli:：GFP蛋白（此处显示的Gli2:：GFP）不与纤毛基底部的基底体共定位，这通过抗γ-微管蛋白染色（红色）可见，表明全长Gli蛋白定位于纤毛尖端。

（F和G）Gli2:：GFP（F）和Gli3:：GFF（G）在纤毛远端与Polaris（红色）的一个亚结构域共定位。

（H–K）输入Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变肢体芽细胞、GFP标记的Gli1（H）、Gli2（I）和Gli3（J）蛋白定位于细胞核和MTOC周围稳定微管区域，以抗乙酰化α-微管蛋白标记。相反，Gli3（Gli3R:：GFP）（K）的加工形式仅在细胞核中检测到。

所有面板中的插图仅显示所示纤毛（箭头）或区域（方框）的GFP（绿色）和核（蓝色）染色。

与三种全长Gli蛋白的定位相反，Gli3R:：GFP主要在细胞核中检测到。我们在纤毛远端未检测到GFP信号，这表明经过处理后，Gli3R从纤毛中释放出来，或者纤毛靶向结构域位于Gli3的C末端(图5D） ●●●●。目前正在探索这些可能性。

在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}野生型样本中观察到，细胞核中存在缺乏纤毛的突变细胞，即Gli:：GFP融合蛋白。此外，Gli1:：GFP、Gli2:：GFP-和Gli3:：GFP.定位于MTOC周围，纤毛在那里形成(图5H–5J） ●●●●。相反，Gli3R主要存在于细胞核中，在野生型或Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变细胞(图5D和​和5K）。5K） ●●●●。Gli:：GFP蛋白的核定位Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}突变体表明，核导入Gli转录因子不需要北极星。

细胞培养。

如前所述生成ShhN-CM和仅载体对照条件培养基[30]. 对于诱导分析，细胞在条件培养基和DMEM+15%FBS的1:1混合物中培养过夜，然后进行RNA分离。

通过表型分离和鉴定胚胎(Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}或使用从卵黄囊中分离的DNA进行PCR。去除细胞培养实验用的肢芽，在室温下用0.25%胰蛋白酶在PBS中处理15分钟。在胰蛋白酶处理后，细胞被机械分离，FBS添加到10%。通过离心收集细胞并用DMEM+15%FBS电镀。

先前已经描述过编码C端GFP融合的Gli1:：GFP、Gli2:：GFP和Gli3:：GFP-腺病毒构建物[21]. Gli3R:：GFP腺病毒是通过将Gli3:：GFP载体中的全长cDNA替换为对应于氨基酸1–677的编码区而生成的。这种截短形式的Gli3（Gli3R）先前已被证明是Shh信号传导的组成型阻遏物[31]. 所有感染均经过优化，感染率超过75%，并且至少进行了三次。为了确定样本之间的表达水平是否一致，我们检查了Gli:：GFP使用GFP编码区特异性引物进行RT-PCR。在相同的感染条件下，野生型和突变型样本中的表达水平相似。所有显示的定位数据都代表了在所有实验的大多数细胞中观察到的模式。在IMCD小鼠肾细胞系中观察到相同的定位模式。仅在感染GFP对照病毒的细胞中未发现GFP的特异性定位。

RNA分离和RT-PCR。

根据制造商的说明，使用TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，California，United States）分离RNA。根据制造商的说明，使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）进行逆转录。根据制造商的说明，使用等量的cDNA作为Taq聚合酶PCR的模板（Brinkman Instruments，Westbury，New York，United States）。相对表达水平通过比较第1部分或Gli1公司PCR产品到肌动蛋白使用LabWorks 4.0软件（UVP，Upland，California，United States）在相同反应中PCR产物。可根据要求提供引物序列。

使用SmartCycler机器（美国加利福尼亚州森尼维尔Cepheid）进行定量RT-PCR测量。TaqMan引物和探针组，用于Gli1公司和18S rRNA（TaqMan按需分析产品），购自Applied Biosystems（美国加利福尼亚州福斯特市）。这个18S rRNA基因被用作内部控制。阈值周期(C类 _T型)的Gli1公司首先规范化为相应的18S rRNA C _T型。然后使用2^{(–Δ,Δ[C类} _T型 ^])方法[32]通过比较ShhN-CM诱导的细胞与其载体条件培养基对照的表达水平。基础无显著差异Gli1公司在载体条件培养基处理的细胞中，野生型和Gli3公司^Xt-J公司/+样品。

免疫荧光。

为了进行体内纤毛分析，从野生型胚胎（E10.5）中解剖肢体芽，将其嵌入OCT中，然后快速冷冻。如前所述切割并染色20μm的切片[33]使用0.2%Triton X-100进行渗透。培养的原代细胞被固定、渗透并用相同的程序染色。抗Polaris多克隆抗体由Sigma-Genosys（美国德克萨斯州伍德兰市）产生，并通过Western blot分析和免疫荧光筛选特异性。通过Western blot分析，抗血清在野生型样本中识别出正确大小的单一条带；这个乐队在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}样品。在Tg737型 ^{Δ2–3β-加仑}免疫荧光法检测原代细胞，而在野生型标本中还观察到纤毛定位。Sufu抗体和阻断肽来自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。在IMCD小鼠肾细胞系中可以看到与Sufu抗体相同的染色。亲和纯化的抗Gli3抗血清由B.Wang提供，如前所述使用[9]. 乙酰化α-微管蛋白和γ-微管素抗体来自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。使用腺病毒构建物编码的GFP标签显示Gli:：GFP融合蛋白。细胞核用Hoechst 33258（Sigma）染色。

所有荧光成像均在配备CoolSnap HQ冷却CCD相机（Roper Scientific，Trenton，New Jersey，US）和MetaMorph成像软件（Molecular Devices，Downington，Pennsylvania，US）的尼康（日本东京）TE200 Eclipse倒置荧光显微镜上进行。所有过滤器和百叶窗都由计算机驱动。

我们感谢C.Chang、G.Marqués和s.Nozell对原稿的批判性阅读，感谢B.Wang对Gli3抗血清的批判式阅读，感谢D.Robbins对ShhN表达结构的批判，感谢C.M.Fan对Gli:：GFP腺病毒结构的批改式阅读，谢谢M.Croyle对我们的技术援助，感谢我们实验室成员的有益讨论。我们感谢阿拉巴马大学伯明翰分校高分辨率成像设备在电子显微镜样品制备和分析方面提供的帮助。这项工作得到了向BKY提供的March of Dimes Grant（1-FY04-95）的支持。通过向D.Benos提供的国立卫生研究院T32培训拨款（DK07545），向CJH提供了额外支持。根据与UT-Battelle签订的合同DE-AC05-00OR22725，YAS和EJM获得了美国能源部生物与环境研究办公室的支持。