美国国家科学院院刊。2002年7月23日；99(15): 10025–10030.
区域分析第53页类风湿关节炎滑膜的突变
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山下裕治
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏与免疫研究所，邮编：92093
大卫·博伊尔
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏和免疫研究所，邮编92093
桑娜·罗森格伦
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏与免疫研究所，邮编：92093
道格拉斯·R·格林
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏与免疫研究所，邮编：92093
内森·J·茨瓦伊勒（Nathan J.Zvaifler）
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏与免疫研究所，邮编：92093
加里·S·费尔斯坦
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏与免疫研究所，邮编：92093
*加利福尼亚大学圣地亚哥医学院风湿病、过敏和免疫学分部，加利福尼亚州拉霍亚，邮编92093；和†加利福尼亚州拉霍亚市拉霍亚过敏与免疫研究所，邮编：92093
由加利福尼亚州圣地亚哥加利福尼亚大学J.Edwin Seegmiller传达
收到日期：2002年3月5日；2002年6月4日接受。
摘要
p53抑癌蛋白在细胞周期调节、DNA修复和凋亡中起着核心作用。最近的研究表明，DNA损伤和体细胞突变第53页基因可能因基因毒性应激而在许多组织中出现，包括皮肤、结肠和滑膜。尽管第53页该基因已在类风湿关节炎（RA）滑膜组织和滑膜细胞中得到证实，目前还没有关于其位置或范围的信息第53页突变。使用显微解剖的RA滑膜组织切片，我们观察到大量第53页过渡突变，是氧化应激引起的典型DNA损伤。第53页突变，以及第53页mRNA表达主要位于滑膜内膜衬里而非下层(P（P）< 0.01). 集群第53页在一些微切片区域观察到突变亚克隆，表明寡克隆扩张。由于IL-6基因的表达受野生型p53调节，因此使用实时PCR定量显微解剖组织中IL-6 mRNA的表达。高发病率地区第53页与低突变样本相比，突变中IL-6 mRNA的含量显著增加(P（P）< 0.02). 显微解剖结果表明第53页炎症性氧化应激在RA滑膜组织中诱导突变。这一过程，就像暴露在阳光下的皮肤和发炎的结肠上皮一样，为一些突变克隆提供了选择性生长优势。含有第53页突变可能会影响邻近细胞，并通过产生促炎细胞因子而增强炎症反应。
p53抑癌蛋白在细胞周期调节、DNA修复和凋亡中起着核心作用(1,2). 已知该基因的突变与许多肿瘤疾病的发病机制有关(三,4). 然而，DNA损伤的机制以及异常p53对非肿瘤性疾病的作用直到最近才得到重视。例如，由于包括皮肤、结肠和滑膜在内的许多组织中的基因毒性应激，可能会发生体细胞突变(5–7). 炎症引起的氧化损伤似乎会导致第53页结肠和滑膜的突变，而紫外线会导致阳光照射皮肤的突变。体细胞突变在非肿瘤组织中的定位以及对炎症疾病发病机制的潜在影响才刚刚开始被认识到。
类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，其特征是滑膜组织过度生长和侵袭(8). 尽管RA具有许多自身免疫的特征，但非免疫因素在慢性病中也起着重要作用(9–11). 临床观察表明，关节破坏的进展与炎症无关(12–14)，成纤维细胞样滑膜细胞的自主增殖可能导致这种现象(10,11). RA滑膜细胞和滑膜组织表现出一些可能参与这一过程的转化特征，包括接触抑制丧失、癌基因表达、软骨自主侵袭和凋亡不足(10,11,15,16). 局部氧化损伤引起的遗传改变被认为是永久改变或印记RA滑膜细胞的潜在机制(7,17). 相反，在骨关节炎滑膜样本中未观察到p53突变。在炎症性肠病中观察到，类风湿性关节炎中活性氧和氮的产生显著增加了类风湿性关节炎发生突变事件的可能性。
为了研究RA滑膜细胞的攻击行为，我们将注意力集中在滑膜细胞结构和功能上第53页抑癌基因。先前的研究表明，p53在RA滑膜组织中过度表达(18). 体细胞突变第53页在RA滑膜和培养的成纤维细胞样滑膜细胞cDNA和基因组DNA中也观察到该基因，尽管研究之间存在数量差异(7,19–21). 大多数第53页RA的突变以过渡基改变为特征(7,21)以前也在人类肿瘤组织中发现(22). 此外，某些第53页RA突变为显性阴性，可抑制内源性野生型p53功能(23). p53蛋白失活可以重现RA中观察到的许多表型变化，例如滑膜细胞增殖增加和侵袭(24,25).
尽管有如此丰富的数据，但没有关于第53页滑膜组织的突变。因此，我们检查了第53页使用显微解剖的RA滑膜组织切片进行突变。这些数据表明第53页突变主要位于滑膜内膜，可能与IL-6的局部表达增加有关。即使滑膜内的细胞比例相对较小，也会增加促炎细胞因子并激活滑膜中的邻近细胞。
材料和方法
滑膜组织和显微解剖。
滑膜组织样本取自接受关节置换术的类风湿性关节炎患者（滑膜切除术样本除外）。RA的诊断符合1987年美国风湿病学会修订标准(26). 组织样品通过浸泡在甲基丁烷中嵌入TissueTek OCT化合物（Miles Diagnostics，Elkhart，in）中，并在−80°C下保存，直至使用。冷冻组织被切割成10μm的切片。每个块的第一部分用苏木精和伊红染色，组织学观察确定内膜衬里和亚衬里区域。然后使用无菌手术刀片和光学显微镜对衬里区域和亚衬里区域进行显微解剖。每个区域的面积≈0.25 mm2.
PCR扩增和测序。
使用RNA STAT-60（德克萨斯州Friendswood Tel-Test）从显微解剖的RA滑膜组织中分离出总RNA。根据制造商的协议（ProSTAR First-Strand RT-PCR试剂盒，Stratagene），使用随机引物和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶将提取的RNA反转录到cDNA中。外显子5–10第53页通过带有基因序列侧翼引物的巢式PCR从显微解剖的RA滑膜组织的cDNA中扩增出基因（外引物意义：5′-ACCTACCAGGCTACGTTTC-3′；外引物反义：5′-TTTTAGGCGAGGTAGAGGACGGACC-3′；内引物意义；内部引物反义：5′-GGATAATACGACTCACTATAGGGTTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT(7). PCR混合物由1×高保真Advantage-HF2聚合酶混合物（CLONTECH）、1×HF2 PCR缓冲液（CLONTEMCH）、一×HF2 dNTP混合物（CLON TECH），200 nM正向和反向引物以及总体积为50μl的样品cDNA组成。对于每个PCR，cDNA扩增45个周期，在94°C下变性30秒，在55°C下退火30秒，并在68°C下延伸90秒，最后在68°C下延伸3分钟。扩增的PCR产物通过含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。这个第53页用无菌刀片从凝胶中切下条带，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）进行纯化。已净化第53页在应用生物系统PRISM 3100遗传分析仪上使用应用生物系统（Applied Biosystems）PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequenting Ready Reaction Kit对PCR产物进行亚克隆和测序。
实时PCR。
使用GeneAmp 5700序列检测系统（Perkin–Elmer Applied Biosystems）进行实时逆转录酶-PCR。使用预先开发的人类IL-6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）特异性序列检测试剂（Perkin–Elmer Applied Biosystems）。在TaqMan通用PCR Master Mix中使用以下方案进行PCR：在95°C下初始激活AmpliTaq Gold DNA聚合酶10分钟，在95°C40个循环中激活15秒，在60°C下激活1分钟。绘制荧光信号与循环数和阈值循环（C吨确定了能够可靠检测到高于背景荧光增加的循环数）。
用Ficoll-Paque（Amersham Pharmacia）分离健康对照组的外周血单个核细胞，并在5×10培养过夜6在1μg/ml ConA存在下，每ml细胞数。制备外周血单个核细胞cDNA并连续稀释。在每次PCR运行中包括每种标准浓度的等分样品，IL-6和GAPDH的标准曲线使用log[C进行线性回归生成吨]与对数（单元格数）的比较。样品C吨然后用这些值计算未知样本中IL-6和GAPDH的细胞当量，数据表示为IL-6与GAPDH之间的比值吨和GAPDH C吨（电池当量比）。每次PCR运行还包括包含除cDNA以外的所有试剂的非模板对照。这些控件生成了C吨在所有实验中都大于40。
统计分析。
数据表示为平均值±SEM。两组之间的比较采用Mann-Whitney或Wilcoxon检验。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
结果
显微解剖和第53页滑膜组织中的RNA表达。
RA滑膜冷冻组织切片(n个8）显微解剖，包括65个内膜衬里区和49个亚衬里区。图。显示了用苏木精和伊红染色的滑膜组织切片的示例，显示了显微解剖区域的相对大小和位置。根据实时定量PCR在显微切割样品中检测到的GAPDH相对数量，我们估计该区域包含大约1000个细胞。可检测的产量第53页如果评估较小的区域，则mRNA显著降低。通过GAPDH表达测定的细胞数和RNA含量在从衬里和亚衬里区分离的显微解剖样品中相似。
RA滑膜组织的显微解剖。冷冻滑膜组织被切割成10μm的切片。用无菌刀片在光学显微镜下对内膜和亚衬里区进行显微解剖。显示了显微切割区域的大小和位置示例(A类：显微解剖前，B类：显微解剖后）。每个区域的面积≈0.25 mm2估计该区域的细胞数量约为1000个。（放大倍率：×100。）
然后对114个微切割区域进行逆转录酶-聚合酶链式反应，以确定是否第53页可检测到mRNA。如图所示。，表示第53页琼脂糖凝胶电泳测定的mRNA在内膜衬里区显著高于亚衬里区(P（P）< 0.01).
第53页mRNA表达和第53页显微解剖滑膜组织的突变。对8例RA患者的显微解剖区域进行分析第53页表达和突变。百分比第53页通过逆转录聚合酶链反应，衬里中的mRNA阳性区域显著高于次衬里(P（P）< 0.01). 与亚群相比，衬里中突变率高的区域的百分比（即>15%的亚群）明显更高(P（P）< 0.01).
第53页显微解剖滑膜组织的突变。
PCR扩增后，34个显微切割区域可检测到第53页评估mRNA是否存在野生型或突变型第53页.对每个区域的10到12个亚克隆进行了测序，总计392个第53页对亚克隆进行了分析。中27%的子克隆第53页mRNA阳性的显微切割区域包含错义突变。表显示错义的位置和相对频率第53页在显微解剖的滑膜组织中检测到突变。一些亚克隆包含多个突变。内膜层更有可能含有高丰度（>15%）的突变第53页子克隆比子衬里（参见图。;P（P）< 0.01).第53页错义突变广泛分布于外显子5–10中，个体的多拷贝第53页在八名患者中的三名患者（RA1、RA2和RA8）中发现了突变亚克隆。野生型PCR扩增后的序列分析第53页质粒没有证明引入了新的突变，并证实了扩增的保真度。
表1
| 病人 | 位置 | 突变株/总亚克隆 | 第53页突变 |
|---|
| RA1型 | 内衬 | 7/9 | 138 GCC>GTC（Ala>Val） |
| 内衬 | 1/11 | 316 CCC>TCC（Pro>Ser） |
| 内衬 | 8/11 | 176 TGC>CGC（Cys>Arg） |
| | 6/11 | 213 CGA>TGA（精氨酸>*停止） |
| | 2/11 | 138 GCC>GTC（Ala>Val） |
| | 1/11 | 128 CCT>ACT（Pro>Thr） |
| 划线 | 5/12 | 138 GCC>GTC（Ala>Val） |
| | 1/12 | 149 TCC>TTC（Ser>Phe） |
| | 1/12 | 202 CGT>TGT（精氨酸>半胱氨酸） |
| | 1/12 | 318 CCA>TCA（Pro>Ser） |
| RA2公司 | 内衬 | 1/11 | 365 CAC＞TAC（His＞Tyr） |
| 内衬 | 8/12 | 144 CAG>标签（Gly>*停止） |
| | 1/12 | 340自动液位计>自动液位计（Met>Thr） |
| 内衬 | 1/12 | 317 CAG>CAT（Gln>His） |
| 内衬 | 1/12 | 255 ATC>ACC（Ile>Thr） |
| | 1/12 | 282 CGG>CAG（Arg>Gln） |
| 内衬 | 1/11 | 269 AGC>GGC（Ser>Gly） |
| | 1/11 | 342 CGA>TGA（精氨酸>*停止） |
| 划线 | 1/11 | 132 AAG>GAG（赖氨酸>谷氨酸） |
| RA3公司 | 划线 | 1/12 | 138 GCC>ACC（丙氨酸>苏氨酸） |
| | 1/12 | 152 CCG>CTG（Pro>Leu） |
| 内衬 | 1/12 | 151 CCC>TCC（Pro>Ser） |
| | 1/12 | 156 CGC>CAC（Arg>His） |
| | 1/12 | 217 GTG>ATG（Val>Met） |
| | 1/12 | 342 CGA>CAA（精氨酸>Gln） |
| 划线 | 1/11 | 125 ACG>ATG（Thr>Met） |
| | 1/11 | 295 CCT>TCT（Pro>Ser） |
| RA4公司 | 内衬 | 1/11 | 189 GCC>ACC（丙氨酸>苏氨酸） |
| | 1/11 | 259 GAC>GGC（天冬氨酸>甘氨酸） |
| RA5公司 | 内衬 | 1/12 | 244 GGC>GAC（甘氨酸>天冬氨酸） |
| | 1/12 | 324 GAT>AAT（Asp>Asn） |
| 内衬 | 1/12 | 161 GCC>ACC（丙氨酸>苏氨酸） |
| | 1/12 | 362 AGC>GGC（Ser>Gly） |
| RA6公司 | 内衬 | 1/12 | 280 AGA>ACA（精氨酸>苏氨酸） |
| | 1/12 | 360 GGG>AGG（甘氨酸>精氨酸） |
| RA7公司 | 内衬 | 1/12 | 273 CGT>TGT（精氨酸>半胱氨酸） |
| 内衬 | 1/12 | 183 TCA>TTA（Ser>Leu） |
| | 1/12 | 306 CGA>TGA（精氨酸>*停止） |
| 内衬 | 1/12 | 158 CGC>CTC（精氨酸>亮氨酸） |
| RA8公司 | 内衬 | 1/12 | 121 TCT>CCT（Ser>Pro） |
| | 1/12 | 177 CCC>TCC（Pro>Ser） |
| | 1/12 | 178 CAC>*AC删除（His>*停止） |
| | 1/12 | 369 CTG>CCTG嵌件（Leu>*停止） |
| 内衬 | 1/11 | 157 GTC>ATC（Val>Ile） |
| | 1/11 | 229 TGT>TAT（Cys>Tyr） |
| | 1/11 | 250 CCC>CTC（Pro>Leu） |
| 内衬 | 12/12 | 337 CGC>AGC（Arg>Ser） |
| 内衬 | 2/12 | 300 CCC>TCC（Pro>Ser） |
| 内衬 | 12/12 | 删除143–220 |
| | 1/12 | 228 GAC>AAC（Asp>Asn） |
| 内衬 | 1/12 | 141 TGC>TAC（Cys>Tyr） |
| | 1/12 | 146 TGG>TGA（Trp>*停止） |
| | 1/12 | 221 GAG>GCG（谷氨酸>丙氨酸） |
| 划线 | 12/12 | 删除143–220 |
| | 1/12 | 345 AAT>GAT（Asn>Asp） |
先前的研究表明RA滑膜中存在大量的过渡突变，可能是由氧化应激的影响引起的(7,17). 在当前研究中检测到的突变是相似的，因为转变代表了在显微解剖样品中检测出的绝大多数替换（图。A类). 大多数第53页显微解剖滑膜组织中的突变是错义突变（图。B类).
第53页显微解剖RA滑膜组织的突变。(A类)突变类型。如前所述，大多数异常是过渡突变。(B类)错义突变的百分比。大多数第53页异常是错义突变。
的本地化第53页RA滑膜组织的突变。
大多数显微解剖区域包含相对较低的个体丰度第53页突变（≤总cDNA库的15%）。然而，一些显微切割区域包含高百分比的个体突变，表明寡克隆扩张。在某些情况下，单个突变可以在单个切片中的不同区域识别，甚至可以从同一组织块的两个切片中识别。图。A类（组织切片1）显示了患者RA1的一个例子，其中分析了六个区域（三个衬里区域和三个亚衬里区域）。第53页mRNA在三个衬里区域中的两个区域检测到，而三个次级衬里区域均未检测到第53页信使核糖核酸（用虚线表示）。令人惊讶的是，89%的第53页亚克隆在一个衬里区域（孵化区）包含密码子138 Ala（GCC）到Val（GTC）突变。相反，野生型第53页在其他地区占主导地位（虚线区域）。为了确认结果，还检查了同一组织块附近的切片（图。A类，组织切片2）。这个第53页序列切片中在相邻区域检测到密码子138 Ala-Val突变。同一区域也存在其他突变（密码子176 Cys>Arg，密码子213 Arg>stop）。
的本地化第53页RA滑膜组织中的突变。显示了几个冷冻组织切片的示意图，以说明第53页表达和突变。截面的外边缘表示衬砌区域，而内部则是次衬砌。请注意，组织中的折叠导致单个块中出现多个离散的组织块。虚线所示区域未检测到第53页通过嵌套PCR检测mRNA。占主导地位的第53页每个都显示了顺序第53页mRNA阳性区域。(A类)患者RA1。第一节（组织切片1）显微解剖了六个区域（三个衬里区域和三个亚衬里区域）。第53页mRNA在三个衬里区域中的两个区域检测到，而三个次级衬里区域均未检测到第53页mRNA。在一个衬里区域（阴影区），89%的第53页亚克隆包含密码子138 Ala（GCC）到Val（GTC）的错义突变。许多突变亚克隆包含不止一个突变，表明不同细胞的突变是连续累积的。相比之下，大多数第53页包含野生型的子克隆第53页在其他区域（虚线区域）。在同一组织块的相邻切片（组织切片2）中，还检测到密码子138 Ala到Val的突变。同一区域也有大量其他突变（密码子176 Cys>Arg，密码子213 Arg>stop）。(B类)患者RA2。对10个区域（7个衬里区域和3个亚衬里区域）进行了显微解剖。第53页在7个衬里区域中的4个区域检测到mRNA；然而，三个亚线性区域均未检测到第53页mRNA。在一个衬里区域（阴影区），67%的第53页亚克隆含有终止密码子（TAG）突变的密码子144-Gly（CAG），而其余三个衬里区域（虚线区域）主要是野生型第53页. (C类)患者RA8。对9个区域（8个衬里和1个亚衬里）进行了显微解剖。第53页在8个衬里区域中的3个区域检测到mRNA，但在亚衬里中没有检测到。在一个衬里区域（阴影区域）中，100%第53页亚克隆包含密码子337 Arg（CGC）到Ser（AGC）的突变，而其余两个衬里区域（虚线区域）主要是野生型第53页.
第二个组织示例第53页突变如图所示。B类（患者RA2）。对10个区域（7个衬里和3个亚衬里）进行了显微解剖。第53页在7个衬里区域中的4个区域检测到mRNA。然而，三个亚线性位置中没有一个包含可检测的第53页mRNA。在一个衬里区域（阴影区），67%的第53页亚克隆包含密码子144 Gly（CAG）以阻止密码子（TAG）突变，而其余三个衬里区域（虚线区域）主要是野生型第53页。
图。C类显示了第三个组织示例，其中包含第53页突变（患者RA8）。对9个区域（8个衬里和1个亚衬里）进行了显微解剖（组织切片1）。第53页在8个衬里区域中的3个区域检测到mRNA，但在亚衬里中没有检测到。在一个衬里区域（阴影区域）中，100%第53页亚克隆包含密码子337 Arg（CGC）到Ser（AGC）的突变，而其余两个衬里区域主要是野生型第53页如图所示。C类，该患者的第二个显微切片也显示，100%的亚克隆中存在一个包含143-220密码子缺失的岛。
显微解剖RA滑膜组织中IL-6 mRNA的表达。
评估频率和位置后第53页在显微解剖的滑膜组织中发生突变，我们确定突变的存在是否与细胞因子表达相关。IL-6之所以被选中，是因为它在RA滑膜中相对丰富，并且它受转录调控第53页(27). 基因突变率高或低的区域（分别为cDNA库的>15%和≤15%）第53页用实时定量逆转录酶-PCR检测cDNA中IL-6的相对表达。有6名患者的样本可供分析，其中有15个高突变区和34个低突变区。如图所示。、发病率高的地区第53页与低IL-6 mRNA相比，突变中IL-6 mRNA的含量显著增加第53页突变样本(P（P）< 0.02). 因此，RA滑膜内突变数量最多的部位也具有最高水平的IL-6基因表达。
显微解剖RA滑膜组织中IL-6 mRNA的表达。先前评估的显微解剖样品第53页随后通过实时PCR检测突变的IL-6基因表达。IL-6 mRNA表达按GAPDH标准化。高海拔地区第53页突变率（>15%）显著增加了IL-6 mRNA的含量(P（P）< 0.02).
讨论
环境中暴露于诱变剂和产生内源性基因毒性分子会损害基因组DNA。随着时间的推移，这个过程可能会压倒修复机制，并导致易感基因的永久性改变。例如，在皮肤中，长期暴露于紫外线可导致关键调控基因发生碱基替换，最终导致光化性角化病(28). 基因突变，如第53页在溃疡性结肠炎等非肿瘤性疾病中有记录(5,29,30). 最近，DNA损伤和体细胞突变也与长期RA有关(7,19–21). 然而，这种突变似乎不会导致恶性肿瘤；相反，它增强了疾病的侵袭性(24,25).
当前研究的目的不是确定这种现象对RA的独特性；相反，我们试图确定严重破坏性关节炎患者类风湿性滑膜内突变的位置和功能意义，类风湿性关节炎是迄今为止唯一发现体细胞突变的风湿性疾病。理想情况下，评估第53页其他形式关节疾病的突变；然而，唯一常见的慢性关节炎是骨关节炎，其病程和破坏程度相当，需要进行关节置换手术。由于骨关节炎中没有发现突变，显微解剖无法提供更多信息。我们考虑分析其他匹配的非RA炎症性关节病的关节组织。不幸的是，导致关节置换的破坏性关节炎在这些患者中很少见，并且无法获得具有类似病程和破坏性的滑膜组织。评估氧化DNA损伤的替代标记物，即p53总表达，表明一种慢性非RA关节炎（即反应性关节炎）中的p53蛋白水平非常低，这使得出现突变的可能性非常低(31).
无论如何，本研究的目的是确定慢性破坏性RA中突变的分布及其潜在的功能后遗症。需要对早期RA的滑膜活检进行额外研究，以确定疾病过程中何时发生突变，以及如何与早期非破坏性反应性关节炎的匹配关节镜标本进行比较。因此，目前，本研究仅限于上述主要目标。每个患者的非突变显微解剖区域作为突变位点的额外内部控制。大多数被评估的地区都含有丰富的野生型第53页基因，而突变岛包含高百分比的特定过渡突变。这项研究，连同高保真聚合酶的使用和证明模板精确控制扩增的实验，解决了PCR保真度和RA关节组织中p53结构和功能的区域变异问题。
虽然很多第53页RA滑膜标本的cDNA和基因组DNA中都有突变，其解剖位置和突变细胞的谱系很难确定。RA滑膜中观察到细胞的寡克隆扩增，但个体突变的相对低丰度表明只有一小部分细胞簇或“岛”受到影响。这种情况类似于阳光照射下的皮肤第53页细胞仅限于离散的簇(32). 这些突变不一定导致肿瘤形成，但最终可能导致癌前病变，如光化性角化病。同样，溃疡性结肠炎的长期炎症与突变细胞的寡克隆扩增有关(5,29,30). 尽管有限的克隆扩张可能不会在阳光照射下的皮肤中致病，但少量滑膜细胞增加可溶性介质的产生可能会产生重要后果。
为了解决这些问题，我们对RA滑膜组织的冰冻切片进行了显微解剖，并分析了其序列第53页cDNA库中的基因。最初的实验是使用激光捕获显微镜进行的，但获得的材料数量相对较少，且难以保持RNA的完整性，限制了该技术的实用性。取而代之的是，在光学显微镜的引导下，人工解剖内膜衬里和亚衬里区域。虽然这些区域比激光捕获技术获得的区域大，但第53页较小样本中的cDNA排除了广泛分析。此外，由于突变细胞的数量可能只占每个区域总细胞数的一小部分，因此对cDNA的分析使我们能够将注意力集中在高突变细胞上第53页基因在一个非常异质的群体中的表达。这一发现，再加上突变分布在许多外显子上的事实，使得对基因组DNA逐个外显子的评估不切实际。
显微解剖分析表明第53页该基因主要在滑膜内膜中表达。以前，用免疫组织化学方法定位p53蛋白，发现主要定位于衬里细胞和内膜衬里细胞(31,33). 技术局限性，包括抗原检索方法的有效性和不同抗体的特异性，可能是变异性的原因。通过关注基因表达，我们发现内膜是第53页基因表达。还测定了滑膜内突变细胞的位置；大多数位于内膜。个人第53页突变的丰度相对较低，通常占第53页特定位置的cDNA池。一些亚克隆还包含一个以上的突变。基于突变位置和培养的成纤维细胞样滑膜细胞中存在的类似突变(7,19–21)，突变基因可能存在于衬里内的B型成纤维细胞样滑膜细胞中。我们不能排除A型衬里细胞（巨噬细胞样滑膜细胞）也含有碱基改变，但根据显微切片数据，亚衬里T细胞没有大量的p53异常。
在显微解剖组织切片中观察到错义过渡突变，与之前关于整个滑膜的报道类似(7,21). 这一发现与DNA损伤是由局部氧化暴露引起的假设一致(7,34,35). 一位患者的一个显著例外是高度丰富的长缺失。长时间删除第53页基因并不常见，但在几种恶性组织中已有报道(36–38). 这种突变可能是由于滑膜细胞中有缺陷的错配修复机制造成的，这与RA中滑膜微卫星不稳定性的存在有关。§此外，内膜具有极高的代谢活性，可能是滑膜中活性氧和活性氮等基因毒性分子的主要来源(39). 诱导型一氧化氮合酶的局部表达以及直接暴露于有毒的滑液环境可能导致DNA损伤(39). 此外，位于内膜中的滑膜成纤维细胞可能不会在很大程度上再循环，而淋巴细胞可以从关节中移出。在这种情况下，永久锚定的子衬里细胞的数量将少于衬里中细胞随时间累积的数量。观察到T细胞在高功率放射治疗RA患者的关节和血液中都存在基因(40).
也许显微切割研究中最有趣的发现是第53页滑膜组织中的岛屿存在突变。八名患者中有三名在特定区域内有丰富的特异性突变。虽然这一结果可能是由基因表达极高的单个细胞引起的，但这些突变更有可能提供生长优势并允许有限的单克隆扩增。在另一名患者中，我们甚至在邻近组织切片的类似区域发现了相同的突变。所有形成簇的突变都是错义突变，这些突变所在的密码子是转化组织中的特征热点(22,41–45). 突变体的存在第53页岛屿与其他暴露于基因毒性刺激的组织的研究一致，包括炎症性肠病中暴露在阳光下的皮肤和结肠上皮(30,32).
要确定第53页RA滑膜组织的突变有功能性后遗症，我们评估了显微解剖区域IL-6 mRNA的表达。IL-6是RA滑膜和滑膜组织中丰富的关键促炎细胞因子(46,47)野生型p53抑制其转录(27). 我们已经证明第53页RA患者的突变干扰野生型p53抑制IL-6基因表达的能力(23). 显微切割滑膜的实时PCR分析表明，与野生型p53为主的区域相比，p53突变丰富的区域表达的IL-6 mRNA数量显著增加。IL-6产生的机制与p53对IL-6转录的直接影响或继发于炎症环境的其他变化有关。这一关键观察提供了体内丰度之间的相关性第53页突变和参与RA发病机制的基因的表达。
IL-6数据与我们最近关于p53在小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）中的作用的研究一致。虽然p53主要被认为是调节细胞增殖和存活的关键细胞内蛋白，但我们认为它也具有重要的抗炎功能(48). 当缺乏p53的易感小鼠株用II型胶原蛋白免疫时，它们比野生型小鼠获得更具攻击性、炎症性和破坏性的CIA(48). 特别值得注意的是，患有CIA的p53基因敲除小鼠滑膜IL-6表达显著增加，这在非关节炎关节（p53不表达）或关节炎小鼠的血清中未观察到。因此，p53通过抑制细胞因子的产生和协助炎症的消退，发挥局部稳态功能。RA的影响显而易见，因为p53表达缺陷可能会加重滑膜炎，即使只有相对较低比例的细胞受到影响。
总之第53页RA关节组织中的突变促使我们评估p53表达和突变丰度的区域差异。滑膜内膜是第53页基因表达和大多数突变的位置。资源丰富的地区第53页突变与IL-6的局部表达增加相关。这些发现支持了以下假设：炎症RA滑膜中的基因毒性刺激可导致致病细胞的局部单克隆扩增。此外，我们怀疑这是慢性炎症组织的一般特性，可以解释在其他慢性炎症疾病中看到的破坏。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）AR45347和AR44850的部分支持。
缩写
| 无线电高度表 | 类风湿关节炎 |
| GAPDH公司 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
| C类吨 | 循环阈值 |
脚注
§Lee，S.-H.，Chang，D.K.，Boland，C.R.，Han，Z.和Firestein，G.S.（2001）大黄性关节炎。 44,S213（弃权）。
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