美国国家科学院院刊。2005年10月25日；102(43): 15551–15556.
伤口修复反应控制皮肤利什曼病的预后
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Anuratha Sakthianandeswaren公司
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
科琳·M·埃尔索
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
肯·辛普森
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，澳大利亚
琼·M·柯蒂斯
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
比娜·库马尔
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
Terence P.速度
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伊曼纽拉·汉德曼
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
西蒙·富特
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔1G皇家游行中心Walter and Eliza Hall Institute感染与免疫部，邮编3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系，邮编：3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
†遗传学和生物信息学司§澳大利亚维多利亚州帕克维尔皇家游行1G号沃尔特和伊丽莎霍尔研究所感染和免疫系3050；‡澳大利亚维多利亚州帕克维尔墨尔本大学医学生物学系3010；和∥孟席斯研究所，17 Liverpool Street，Hobart，Tasmania 7000，Australia
¶E.H.和S.J.F.对这项工作做出了同等贡献。
由马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院Louis H.Miller编辑，2005年8月5日批准
摘要
慢性微生物感染与称为肉芽肿的纤维化和炎症反应有关，与伤口愈合和组织修复过程相似。我们之前已经绘制了三个利什曼病易感基因座1百万分之一, -2、和-三，其作用独立于T细胞免疫反应。在这里，我们表明伤口修复反应对于快速治愈由以下原因引起的小鼠皮肤利什曼病至关重要：大型利什曼原虫与利什曼病抗性基因座相似的小鼠比易感父母更快治愈病变，也表达参与组织修复的差异基因，形成更有序的胶原纤维，更快治愈穿孔活检伤口。这些小鼠的成纤维细胞单层修复在体外伤口愈合更快，感染巨噬细胞的上清液加速了这一过程。由于这些效应独立于T细胞介导的免疫，我们得出结论，伤口愈合率可能是抵抗皮肤利什曼病的先天免疫的重要组成部分。
关键词：成纤维细胞、利什曼病、巨噬细胞、耐药性、伤口愈合
许多病原微生物的感染导致受感染组织的广泛重塑和肉芽肿的产生。血吸虫病已被用作肉芽肿生物学研究的模型曼氏血吸虫卵子刺激细胞外基质的产生和保护性肉芽肿的形成(1,2). 感染者结核分枝杆菌结果产生肉芽肿，同时抑制微生物的传播，并为微生物的持续生存提供安全的环境。同样，许多利什曼原虫属导致皮肤肉芽肿，导致慢性无痛溃疡，愈合后会重塑为正常结构或疤痕组织。为了应对感染，宿主细胞通过产生胶原蛋白和基质金属蛋白酶广泛重塑组织(三,4). 成纤维细胞迁移到该区域，导致正常组织结构的破坏和新生结缔组织基质的沉积(5–7). 疾病的严重程度通常取决于宿主形成肉芽肿的能力；在没有它们的情况下，这些微生物会传播，导致结核病或弥漫性皮肤利什曼病。
抵抗结核分枝杆菌利什曼病的严重程度被归因于适应性免疫反应(8,9). 尽管有人认为局部过度的愈合反应可能导致个体体内的有机体被根除，但这种反应尚未得到证实(10). 然而，有证据表明，组织修复和重塑以及强有力的适应性免疫反应等因素都与此有关(11). 我们使用了大型利什曼原虫小鼠模型，以探索皮肤利什曼病肉芽肿性溃疡的愈合率对宿主先天抵抗的机制有显著贡献的假设。我们证明，对于控制疾病严重程度的宿主反应位点同源的小鼠，它们对感染性损伤和外科损伤的愈合反应不同，在这两种情况下，抗性动物具有更强大的伤口愈合反应。
皮肤利什曼病是由强制性细胞内原生动物引起的利什曼原虫并通过吸血的白蛉传播。皮肤巨噬细胞受到感染，感染部位出现肉芽肿性溃疡。人类皮肤利什曼病的严重程度从自愈性溃疡到持续多年的损害不等(12). 尽管宿主遗传学的重要性已经得到承认，但尚未在人类中确定疾病严重程度的相关性(13,14). 使用人类病原体的利什曼病小鼠模型L.主要已经进行了广泛的研究，并且描述了介导疾病严重性的位点(15–18). 与人类疾病一样，耐药性等同于皮肤溃疡的快速愈合，而易感性则以疾病的慢性性为特征。在这里，我们使用这些小鼠来证明耐药性与皮肤伤口愈合能力密切相关1百万分之一-三基因座控制伤口愈合的速度。重要的是，我们表明感染是由L.主要以宿主特定的方式调节这种反应，动物产生强烈的创伤愈合反应，也表现出对L.主要病变发展。
小鼠17号染色体上的位点(1百万分之一), 9 (1平方米)、和X(直线电机3)调节功能差异L.主要在耐药C57BL/6和敏感BALB/c小鼠之间观察到的敏感性。供者抵抗间隔的同源小鼠系1百万分之一和-2从C57BL/6培育到BALB/c并称为c.B6-(1平方毫米)（C.lmr1/2），对称同源携带BALB/C供体敏感区间，称为B6.C-(1平方毫米)（B6.lmr1/2），创建了两行互反同源物，按两个施主间隔合成(19). 两条同源线都保留了适当的lmr3型因为易感等位基因来自C57BL/6，而抗性来自BALB/c(16). 这些小鼠的易感性与其亲本系不同，表现出一种统计上显著的倾向，即捐赠者的表型与受体菌株的表型不同(19). 抗药性位点同源的小鼠1百万分之一-三T细胞对易感性表型的调节没有作用(19,20)表明T细胞反应可能在该过程的其他地方发挥作用(9).
方法
老鼠。BALB/cAn布莱德雷，C57BL/6J，B6.c-(lmr1、lmr2）和c.B6-(lmr1、lmr2)在Walter and Eliza Hall Institute的特定无病原设施中繁殖。同源间隔位于第9和17号染色体上。在同源间隔内发现的最近端和远端标记如下：B6.c-(lmr1、lmr2)，D17Mit57–D17Mit129，D9Mit89–D9Mit11.c.B6-(lmr1、lmr2)、D17Mit57–D17Mit 39和D9Mit89–D9Mit 329。
穿孔活检。用二甲苯齐尔/克他米尔（0.013 g/0.1 g/kg体重）麻醉2个月大的雌性小鼠，并制作4-mm厚的穿孔伤口。通过测量第3天、第5天和第7天损伤的直径，以及在苏木精/伊红染色后对每组两只小鼠的皮肤活检进行组织病理学检查，来监测伤口修复情况。在损伤第7天进行Masson三色染色，以评估伤口部位的胶原沉积。用于比较穿孔活检和L.主要-诱导损伤描述为http://bioinf.wehi.edu.au/software/russell/perm/help.html.
寄生虫和感染。毒力克隆株V121，来源于L.主要如前所述，分离物LRC-L137（MHOM/IL/67/JerichoII）以每细胞五种寄生虫的比率感染骨髓源性巨噬细胞(21). 小鼠感染了L.主要如前所述(19,20).
RNA的制备和微阵列数据分析。感染后24 h用胰蛋白酶收集细胞，用RNeasy（奇亚根，巴伦西亚，CA）制备RNA。按照制造商的建议，生产了15微克生物素标记的cRNA，并将其与小鼠U74Av2基因芯片（Affymetrix，Santa Clara，CA）杂交。使用稳健的多阵列分析（RMA）方法对数据进行分析(22). 简言之，为了评估基因的差异表达，将线性模型拟合到背景校正的标准化探针水平数据。小鼠U74Av2基因芯片上通常有16-20个探针。此分析返回日志的估计值2每个芯片的表达式以及表达式中的估计误差。对于每次比较，对数比(M（M）)计算，并通过构建“调节”来考虑表达测量的可变性吨统计的，t吨* =/SE公司*，其中东南方*是稍微充气的东南方(23).
为了确定哪些基因是差异表达的，使用了分位数-分位数图，该图将数据的分位数与正态分布的期望值绘制成图表。大多数数据沿直线分布，而差异表达的基因位于分位数图的末端。阈值的分配是任意的，所以在检测尽可能多的真正差异表达的基因和不产生如此大的列表以致于后续工作变得不切实际之间做出了折衷。基因的功能是通过Unigene和国家生物技术信息中心基因座链接数据库指定的(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov).
原发性皮肤成纤维细胞的分离。成纤维细胞是从亲代和同源小鼠品系的4天龄小鼠的皮肤中获得的(24). 允许皮肤成纤维细胞迁移到DMEM、10%FBS和50μg/ml我-抗坏血酸。在37°C，10%CO下2周后2取下外植体，加入新鲜培养基，将细胞生长到汇合处，并重新种植两次，以耗尽无法存活的残余角质形成细胞。用抗潜在污染角质形成细胞、上皮细胞和内皮细胞抗体的免疫荧光法检测成纤维细胞培养物的纯度，并在第4-10代使用细胞。
体外伤口愈合。成纤维细胞接种在24孔板（4×10）中5每个孔的细胞数），并在含有10%FBS和50μg/ml的DMEM中生长过夜我-抗坏血酸。使用1ml移液管尖端划痕，清除细胞碎片，添加新鲜培养基，并在37°C、10%CO下培养受伤的单层2(24). 在不同的时间点测量划痕宽度。为了研究成纤维细胞迁移与增殖对伤口愈合的贡献，如上所述，用或不用2μg/ml丝裂霉素C（Sigma）制备皮肤成纤维细胞单层。在一些实验中，用上述感染巨噬细胞培养物的上清液替换培养上清液。所有实验均一式三份。
结果
同源系感染巨噬细胞的微阵列分析。从互惠同源系（C.lmr1/2和B6.lmr1/2）及其亲本菌株（BALB/C和C57BL/6）中分离出骨髓源性巨噬细胞，并感染L.主要寄生虫在体外从亲本菌株和同源菌株的感染和未感染巨噬细胞中提取RNA，并根据Affymetrix协议将cRNA与Affymetix微阵列载玻片杂交。使用稳健的多阵列分析计算每个探针集的表达水平(22). 适度t吨统计学，t吨*，并通过使用t吨*. 感染和未感染巨噬细胞之间有许多基因表达差异，与BALB/c小鼠相比，C57BL/6中有更多基因表达差异(). 本实验的互惠臂之间通常有20多个基因差异表达（BALB/c对c.lmr1/2，C57BL/6对B6.lmr1/2）。其中17个基因表现出高度一致的表达模式(). 那些在易感小鼠中高表达的基因在耐药小鼠中低，反之亦然，这增加了对表达数据准确性的信心。实时PCR证实了关键表达差异（数据未显示）。在同源株和它们的亲代系之间以及在感染和未感染的细胞之间进行了比较，还注意到了这些差异表达基因之间的差异。从这些分析中发现了细胞外基质沉积相关基因的丰富性(). 这些基因包括许多参与细胞外基质重塑和组成的分子，包括几种胶原蛋白、基质金属蛋白酶和分泌的磷酸多糖Sparc。Tgfb1和Ctgf也有差异表达，这些基因参与控制伤口愈合。这些基因在伤口愈合和组织重塑中起着重要作用，这表明伤口愈合的差异可能在同类及其受体亲本系之间的易感性功能差异中起作用。毕竟，由L.主要是一种慢性溃疡，根据定义，它是伤口愈合正常过程中的一种异常。
表1。
同源系和亲本系感染巨噬细胞中差异表达的基因，在相互同源系中也很常见
| 基因符号 | 基因名称 | 染色体，位置 | 折叠更改BALB/c v.c.lmr1/2 | 向上或向下 | 折叠更改C57BL/6 v.B6.lmr1/2 | 向上或向下 |
|---|
| 1110008E19瑞克 | RIKEN cDNA | 17，A3.3 | 1.48 | D类 | 1.48 | U型 |
| Tmsb10型 | 胸腺肽，β10 | 2，18.0厘米 | 1.32 | U型 | 1.38 | D类 |
| Cxcl2公司 | 趋化因子（C-X-C基序）配体2 | 51.0立方厘米 | 3.25 | D类 | 1.57 | U型 |
| 2010100O12瑞克 | RIKEN cDNA | 2，H1 | 1.34 | U型 | 1.34 | D类 |
| H2-D1型 | 组织相容性2，D区基因座1 | 17、19.09厘米 | 3.99 | D类 | 3.83 | U型 |
| 斯里兰卡 | 琥珀酸脱氢酶复合物，亚单位A，黄蛋白 | 13，C1 | 1.44 | U型 | 1.50 | D类 |
| 像素1 | 临时整合站点1 | 17.16.4厘米 | 1.77 | D类 | 1.50 | U型 |
| Rpo1-1号机组 | RNA聚合酶1-1（40kDa亚单位） | 17、B3 | 1.81 | U型 | 1.85 | D类 |
| — | 图像：4192122，mRNA | — | 2.39 | D类 | 1.80 | U型 |
| 学报2 | 肌动蛋白，α2， | 19，C3 | 1.97 | U型 | 1.59 | D类 |
| 7卢比 | 视网膜母细胞瘤结合蛋白7 | 十、 四层 | 1.47 | U型 | 1.51 | D类 |
| 氢-环氧乙烷 | 组织相容性2，II类抗原Eα | 17.18.7厘米 | 14.34 | D类 | 6.08 | U型 |
| Ltb公司 | 淋巴毒素B | 17、19.06厘米 | 1.67 | D类 | 1.70 | U型 |
| — | RIKEN克隆 | — | 1.69 | U型 | 1.60 | D类 |
| 5730403E06瑞克 | RIKEN cDNA | 十、 答1.1 | 1.49 | U型 | 1.37 | D类 |
| qk（平方公里） | 颤抖 | 17.5.9厘米 | 1.41 | U型 | 1.78 | D类 |
| 第1a1列 | 前胶原，I型，α1 | 11.56.0立方厘米 | 1.48 | U型 | 1.72 | D类 |
| 分1 | 皮瓣结构特异性核酸内切酶1 | 19，A | 1.89 | U型 | 1.50 | D类 |
| 2310015挪威克朗 | RIKEN cDNA | 7, | 1.46 | U型 | 1.50 | D类 |
| 细胞生长因子 | 结缔组织生长因子 | 10、17.0厘米 | 2.17 | U型 | 1.56 | D类 |
| 1110008E19瑞克 | RIKEN cDNA | 17，A3.3 | 1.63 | D类 | 1.61 | U型 |
| 2610003J05Rik（瑞克） | RIKEN cDNA | 4、D3 | 1.38 | U型 | 1.36 | D类 |
| 第3页 | 前B细胞白血病转录因子3 | 22.0厘米 | 1.44 | U型 | 1.45 | D类 |
| Zfp36型 | 锌指蛋白36 | 7.10.2厘米 | 2.08 | D类 | 1.43 | D类 |
| H2-Aa | 组织相容性2，II类抗原A，α | 17.18.65立方厘米 | 1.36 | D类 | 1.50 | D类 |
| Mapkapk2号机组 | MAP激酶活化蛋白激酶2 | 1、E4 | 1.4 | D类 | 1.48 | D类 |
表2。
同源菌株及其亲本系感染/未感染巨噬细胞中差异表达的基因
| 符号 | 姓名 | 染色体 | 位置 | 折叠更改 | 向上/向下 |
|---|
| C57BL/6感染与B6.lmr1/2感染 |
| 第1a2列 | 前胶原，I型，α2 | 6 | 0.68立方厘米 | 1.46 | D类 |
| 第18a1列 | 前胶原，XVIII型，α1 | 10 | 41.3立方厘米 | 1.43 | U型 |
| 玻璃纤维蛋白1 | 转化生长因子β1 | 7 | 6.5立方厘米 | 1.51 | D类 |
| 发布 | 成骨细胞特异性因子2（类筋膜素） | 三 | 54.5兆字节 | 1.91 | D类 |
| Ctgf公司 | 结缔组织生长因子 | 10 | 17.0厘米 | 1.56 | D类 |
| 第1a1列 | 前胶原，I型，α1 | 11 | 56.0立方厘米 | 1.72 | D类 |
| BALB/c感染v c.lmr1/2感染 |
| 第5a2列 | 前胶原，V型，α2 | 1 | 45.8兆字节 | 1.50 | U型 |
| 细胞生长因子 | 结缔组织生长因子 | 10 | 17.0厘米 | 2.17 | U型 |
| 第1a1列 | 前胶原，I型，α1 | 11 | 56.0立方厘米 | 1.48 | U型 |
| 斯巴达克 | 分泌的酸性富含半胱氨酸糖蛋白 | 11 | 29.9立方厘米 | 1.61 | U型 |
| C57BL/6未感染v B6.lmr1/2未感染 |
| 第1a2列 | 前胶原，I型，α2 | 6 | 0.68立方厘米 | 1.90 | D类 |
| 第5a2列 | 前胶原，V型，α2 | 1 | 45.8兆字节 | 2 | D类 |
| 发布 | 成骨细胞特异性因子2（类筋膜素） | 三 | 54.5兆字节 | 2.40 | D类 |
| 细胞生长因子 | 结缔组织生长因子 | 10 | 17.0立方厘米 | 2.30 | D类 |
| 第1a1列 | 前胶原，I型，α1 | 11 | 56.0立方厘米 | 2 | D类 |
| Bgn公司 | 比格利坎 | X（X） | 29.3立方厘米 | 1.80 | D类 |
| Sparc公司 | 分泌的酸性富含半胱氨酸糖蛋白 | 11 | 29.9立方厘米 | 2.70 | D类 |
| BALB/c未感染与c.lmr1/2未感染 |
| 第18a1列 | 前胶原，XVIII型，α1 | 10 | 41.3立方厘米 | 1.70 | D类 |
| 细胞生长因子 | 结缔组织生长因子 | 10 | 17.0厘米 | 2.20 | U型 |
| 第1a1列 | 前胶原，I型，α1 | 11 | 56.0立方厘米 | 1.75 | U型 |
| 斯巴达克 | 分泌的酸性富含半胱氨酸糖蛋白 | 11 | 29.9立方厘米 | 1.95 | U型 |
携带C57BL/6 lmr耐药基因座的小鼠胶原束更丰富且有序。我们通过组织学检查对由4-mm全厚穿刺活检或感染引起的皮肤损伤进行了创伤愈合假设测试L.主要强毒力克隆株V121。Masson’s三色（MT）染色切片显示胶原纤维沉积有明显的菌株特异性差异(). C57BL/6穿刺活检病灶显示胶原沉积有序排列()而BALB/c小鼠沉积了更稀疏、更无序的胶原蛋白基质(). 同源小鼠的胶原蛋白沉积模式与同源区间的供体菌株比受体菌株更为相似，表明同源区间内的基因控制着这一过程(). 这种菌株特异性表型在由L.主要()，证实在由L.少校在感染性病变中，同源系与其亲本之间的差异得以保留。
穿孔活检组织切片和L（左）.专业用Masson三色染色的病变显示胶原纤维的应变依赖性沉积。(A类–D类)穿刺活检病变。(E类–H（H）)L（左）.专业损伤。(A类和E类)-C57BL/6。(B类和F类)-B6.lmr1/2。(C类和G公司)-BALB/c(D类和H（H）)–C.lmr1/2。
携带C57BL/6 lmr耐药基因的小鼠伤口愈合更快。穿孔活检的愈合率用于将伤口修复的数量差异与组织学和微阵列观察相关联。在同源系和亲本系上进行的穿孔活检的愈合动力学表明，在供者间隔期存在抗性C57BL/6单倍型导致更快的愈合。每隔一天测量一次病灶的直径，并计算伤口闭合率(). C57BL/6和BALB/c之间存在统计显著性差异(对=0.0001），BALB/c和c.lmr1/2(对=0.006），以及C57BL/6和B6.lmr1/2(对= 0.025). 最快愈合者到最慢愈合者的顺序是C57BL/6、B6.lmr1/2、C.lmr1/2和BALB/C，这表明供体间隔的存在显著影响两个同源方向的伤口闭合速度。敏感BALB/c直线电机基因座在C57BL/6背景下减缓伤口闭合，而抗性基因座在BALB/c背景下加速伤口闭合，这意味着在同源区间内存在控制基因。伤口愈合率的这些差异与宿主对感染的不同反应中的一个因素相一致L.主要在这些小鼠品系中。
皮肤穿孔活检病变和成纤维细胞单层划痕的闭合动力学显示应变依赖性闭合时间。(A类)C57BL/6、B6.lmr1/2、C.lmr1/2和BALB/C手术诱导皮肤损伤的闭合动力学(B类和C类)成纤维细胞单层划痕闭合动力学。
lmr位点控制创伤愈合体外模型中成纤维细胞的运动。我们使用了在体外创伤愈合模型测量成纤维细胞在划痕上的流动性，以确定这些细胞在上述小鼠观察中是否具有重要功能(24). 从亲代和同源小鼠的皮肤中分离出成纤维细胞，进行电镀，并生长到汇合处。有趣的是，由于这些成纤维细胞生长较慢，从B6.lmr1/2系中获得成纤维细胞培养物一直比较困难。在有无丝裂霉素C的情况下测量关闭时间，丝裂霉素可以阻止细胞分裂，但不会影响细胞运动。成纤维细胞单层划痕的闭合显示出高度可重复的菌株特异性动力学(). 与体内愈合数据，C57BL/6小鼠的细胞比BALB/c更快地闭合抓痕(对= 0.007). 这种表型由耐药区间上的基因控制，因为C.lmr1/2比受体亲本BALB/C更快地闭合伤口(对=0.031）（图。和)，其闭合率与C57BL/6相似(对=0.117），它们仅共享电阻间隔。在C57BL/6背景下，易感BALB/c同源供体间隔的存在显著减缓了闭合(). 向培养物中加入丝裂霉素不会影响划痕的闭合率（结果未显示），这表明闭合率的差异是由于细胞运动性的差异，而不是增殖的差异。
Giemsa染色的皮肤成纤维细胞单层显示BALB/c之间划痕闭合的差异(A类)和C.lmr1/2成纤维细胞(B类)伤后32和48小时（0）。
C57BL/6感染巨噬细胞的上清液加速划痕闭合动力学。我们希望研究寄生虫和巨噬细胞对伤口愈合过程的潜在贡献。用感染或未感染C57BL/6和BALB/c骨髓源巨噬细胞的上清液作为擦伤模型的替代培养基，比较感染和未感染条件培养基中生长的成纤维细胞的擦伤闭合动力学。令人惊讶的是，感染但未感染的C57BL/6巨噬细胞的上清液能够加速C.lmr1/2成纤维细胞单层划痕的闭合(对= 0.007) (). 虽然C57BL/6感染的巨噬细胞上清液对C57BL-6成纤维细胞没有明显的总体影响，但在24小时时，它似乎加速了细胞的闭合()如果成纤维细胞是从敏感的BALB/c或携带BALB/c.同源间隔的B6.lmr1/2小鼠中分离出来的，则闭合率没有差异().感染或未感染BALB/c巨噬细胞的上清液对任何细胞造成的闭合动力学也没有差异（数据未显示），表明成纤维细胞对感染巨噬细胞的反应能力也依赖于同源间隔。
来自C57BL/6、BALB/c、c.lmr1/2和B6.lmr1/2的成纤维细胞在由感染（填充圆圈）、未感染（开放圆圈和虚线）C57BL/6巨噬细胞或对照介质（灰色圆圈）调节的培养基中生长的抓痕闭合动力学，以原始抓痕宽度的百分比表示。
讨论
我们早期的工作表明直线电机基因座介导对L.主要小鼠感染(15,16,19,20)并表明这种效应不是由于T细胞介导的反应，这表明它们必须在宿主反应途径的其他地方发挥作用。本文提供的数据表明，这些相同的同源区间也调节了不同的创伤愈合反应。当从同源系分离出的感染和未感染巨噬细胞中发现组织修复基因差异表达时，首次怀疑这种反应。手术引起的损伤或感染性损伤的组织学检查表明，这些伤口中沉积的胶原蛋白的数量和结构取决于同源供体间隔。抗C57BL/6的动物直线电机单倍型沉积了更多的胶原蛋白，胶原蛋白排列成一致的定向束，与BALB/c或B6.lmr1/2同源物伤口沉积的胶原蛋白相反。动力学的差异体内在成纤维细胞单层的划痕愈合过程中也观察到了伤口愈合，这暗示了一种共同的机制。
只有从具有抵抗间隔的小鼠中分离出来的成纤维细胞对C57BL/6感染的巨噬细胞产生的分子有反应，这一观察结果将成纤维细胞单层划痕的愈合与微阵列实验中的原始观察结果紧密联系在一起，显示参与组织修复和伤口愈合的基因在巨噬细胞中的差异表达。来自易感BALB/c小鼠的巨噬细胞直线电机基因座不产生刺激因子，其成纤维细胞对C57BL/6感染的巨噬细胞产生的刺激因子没有反应。这种反应的完全协同性意味着一种锁键式机制，例如，配体/受体相互作用，配体和受体的等位基因相互作用。
创伤愈合表型与疾病表型严重程度的遗传关联强烈表明前者是其机制利什曼原虫抵抗是由lmr1型-三基因座。因此，假设的抵抗机制通过1百万分之一-三是一种增强的创伤愈合反应，由受感染巨噬细胞产生的分子刺激，作用于基因启动反应的成纤维细胞，导致加速愈合L.主要-诱导损伤。这种效应可能是由于一个或多个基因在。不一定存在于同源区间的基因可能会被激活，例如结缔组织生长因子，其在具有C57BL/6抗性区间的菌株中表达增加。结缔组织生长因子在1型胶原的表达以及成纤维细胞的动员和增殖中起作用(25). 培育和使用无差异T细胞反应的同类动物(19,20)使肉芽肿反应的“愈合”部分得以剥离，而不受对肉芽肿发展如此重要的T细胞反应的大量研究影响。类似的机制可能在人类中发挥作用。利什曼病早期病变中有一个涉及成纤维细胞和巨噬细胞的广泛重塑过程(11). 此外，皮肤利什曼病患者的伤口愈合出现异常(26).
这种涉及先天免疫系统细胞的抵抗机制也可能在其他肉芽肿性疾病中常见(27). 确实，抵抗结核分枝杆菌在小鼠中已映射到覆盖的基因座1百万分之一和-2(28,29)这表明这两种肉芽肿性疾病之间存在共同的耐药机制。
致谢
我们感谢安妮·沃斯和伊恩·达比的建议，感谢林恩·白金汉的技术援助。我们特别感谢菲奥娜·米切尔和特蕾西·鲍德温的帮助。这项工作得到了国家卫生研究院、澳大利亚国家卫生和医学研究委员会、霍华德·休斯医学研究所和世界卫生组织热带病研究和培训特别方案（TDR）的资助。
笔记
作者贡献：A.S.、C.M.E.、E.H.和S.J.F.设计的研究；A.S.、C.M.E.、J.M.C.和B.K.进行了研究；A.S.、C.M.E.、K.S.、T.P.S.、E.H.和S.J.F.分析数据；E.H.和S.J.F.撰写了这篇论文。
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