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EMBO J。2002年7月15日；21(14): 3575–3581.
数字对象标识：10.1093/emboj/cdf380
预防性维修识别码：PMC126125型
PMID：12110570

24Å分辨率下1型肌醇1,4,5-三磷酸受体的三维结构

蒋秋兴,1,2 埃德温·C·飞人,三 大卫·W·切斯特,1 芭芭拉·埃利希,1,三和弗雷德·西格沃思1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们在这里报道了1型肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP）的第一个三维结构三R） ●●●●。通过玻璃冰中纯化受体的冷冻电子显微图像，利用标准的单粒子重建技术确定了三维结构。尽管这两个钙释放通道之间存在分子相似性，但其结构与分辨率相似的ryanodine受体的结构有显著不同。IP的24Å分辨率结构三R呈不均匀哑铃形状，高约170Å。其大端笨重，四条手臂侧向突出约50Å，与受体拓扑结构相比，可能对应于受体的细胞质域。突出臂高度处的横向尺寸为～155Å。较小端的横向尺寸是～100 \8491»，具有表明膜跨域的结构特征。该结构域中的一个中央开口（位于细胞质的一半上）概述了通道开放状态下钙流的途径。

关键词：通道/低温电子显微镜/IP三受体/单粒子重建

介绍

肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP三Rs）是许多真核细胞内钙储存的配体门控钙释放通道(Berridge，1993年;吉田等., 1997;帕特尔等., 1999). 它们介导大量钙调节的信号转导事件(波赞等., 1994;威尔科克斯等., 1998;Gailly和Colson-Van Shoor，2001年)从上皮细胞颗粒的分泌到基因表达、细胞增殖和细胞死亡的控制(马克，1997)，导致神经系统长期抑郁(井上等., 1998).

三种类型的IP三Rs已克隆(古文市等., 1989;Mignery公司等., 1989;苏霍夫等., 1991;布隆德尔等., 1993;马兰托，1994年)和在不同组织中以不同的丰度表达(牛顿等., 1994)，包括平滑肌、心肌细胞(Moschella and Marks，1993年;佩雷斯等., 1997;利普等., 2000)，肾脏(布隆德尔等., 1993)、内皮细胞(去吧等., 1995)和神经元。IP（IP）三Rs是约300kDa亚基的四聚体。疏水性分析预测每个亚单位中有6-8个疏水区域，且>85%的受体位于细胞质侧。生物化学和分子生物学研究(帕特尔等., 1999)已找到IP三-结合域靠近受体亚单位的N末端，发现序列中间的长调控域包含磷酸化位点、剪接位点和各种辅助蛋白的结合位点。此外，已有证据支持该受体的六跨膜结构域（TM）模型，该模型在拟议的孔环中具有GXRXGGGXGD基序，其中包含两个短疏水序列(拉莫斯·弗兰科等., 1999;威廉姆斯等., 2001).

从平滑肌中纯化的洗涤剂固体化受体的早期负染电子显微镜（EM）研究(查德威克等., 1990)和小脑(前田等., 1990)揭示了蛋白质颗粒在大小和形状方面的显著变化。部分有序IP的EM图像三小脑浦肯野神经元内质网膜中的受体(片山等., 1996)提供了12–16 nm细胞质侧受体横向尺寸的估计。这些研究未能提供足够的信息来推断受体的三维结构。

IP的三维结构三R可以为将各种结构-功能研究同化为相干分子图像提供基础。由于大多数组织中受体蛋白的数量有限，且单个受体分子的尺寸较大，因此用于溶解受体的X射线衍射或核磁共振研究的三维晶体的生长对于IP的结构测定是有问题的三R.分离受体EM图像的单粒子重建（SPR）(弗兰克，1996)然而，可以从皮摩尔数量的蛋白质中进行。为了避免在阴性染色图像中看到伪影(查德威克等., 1990;前田等., 1990;弗兰克，1996年)，我们选择直接从纯化受体的冷冻电镜图像开始SPR。用低温电子显微镜（cryo-EM）获得了数千个随机冻结在玻璃冰中的洗涤剂固体受体图像，并通过SPR将其组合在一起，形成了一个24Å分辨率的结构。该结构与预测的受体拓扑结构一致，并预测了钙流经膜的可能途径。

结果

小鼠1型IP的纯化和功能表征三R（右）

小脑是1型IP最丰富的来源三R、 使该组织成为纯化受体的最佳来源(费里斯等., 1989;前田等., 1990;辛戈拉尼和阿格纽，1992年). 我们从冷冻小鼠小脑中纯化了受体，按照标准的程序[三H] IP（IP）三结合试验(投掷器等., 2000). 肝素和伴刀豆球蛋白A（Con A）亲和层析后，纯化的受体通过尺寸排除FPLC柱（图1A） ●●●●。受体峰在2.0 MDa-右旋糖酐峰后立即洗脱，与纯化的受体为四聚体一致。

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图1。纯化IP的生化分析三卢比(A类)加载样品的SDS–PAGE和IP周围的FPLC部分三R峰值。凝胶用考马斯蓝染色。在通道1中，施加5.0µg加载样品。通道2–12对应于洗脱体积为6.0–15 ml的部分。每条车道使用20µl等分的每部分。与泳道4-6对应的级分中的蛋白质浓度为-0.1 mg/ml。所有其他实验中都使用了与这些泳道对应的级分。高分子量标准品的对照运行显示，右旋糖酐2000在7.8毫升时出现，铁蛋白（437 kDa）在14.5毫升时出现，这分别对应于泳道4和12。(B类)纯化IP的免疫印迹三具有针对1型、2型和3型IP的特异性抗体的Rs三Rs和RyRs抗体（1型和2型）。2型IP的阳性对照三R抗体是由小鼠心肌制成的微粒体，用于3型IP三R抗体由肾细胞制成（数据未显示）。RyR抗体的阳性对照（CTL）是由小鼠骨骼肌制成的微粒体。

检查它是否包含任何类型2或3 IP三Rs或ryanodine受体（RyRs），受体制剂用针对各种类型IP的抗体进行检测三Rs和RyRs（图1B） ●●●●。任何此类污染都低于检测限值。此外，免疫印迹法还表明，纯化后的受体在纯化过程中未发生可检测到的降解。

功能分析表明，纯化的受体具有天然IP的特性三Rs.IP三-纯化受体的结合亲和力为～40 nM（图2A） ●●●●。表观比活性为100–150 pmol/mg，与之前使用该试验的研究一致(查德威克等., 1990;投掷器等., 2000). 单通道记录（图2B） 结果表明，一旦重组成脂质双层，纯化的受体呈现出预期的IP三-～85 pS-Ba的门控通道活性2+电导、4%最大开放概率和肝素阻断。为了进一步验证其功能完整性，将纯化的受体重组为钙载脂小泡和IP三-特定钙流出（图2C） 用钙测定2+-敏感染料。结果表明，囊泡中的大多数受体可以形成功能性钙释放通道。此外，如图的插图所示2C、 受体的药理学特性通过对d日但不是我IP亚型三.

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图2。纯化IP的功能分析三卢比(A类) [三H] IP（IP）三竞争分析中的结合。这里显示的是Scatchard图，它与束缚与自由之比的方程相拟合[三H] 知识产权三:

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产生了一个K（K）D类40 nM。在这里，T型c（c）是总冷IP三和T型小时总数[三H] IP（IP）三.术语((T型c（c）+T型小时)/T型小时)[绑定]表示总绑定IP三. (B类)重组IP的单通道录音三脂双层中的R。在2.0µM IP存在下记录通道活性三在中顺式-侧面。单通道电导（Ba2+)为83 pS，最大开放概率～4%。(C)IP的钙流出三用Indo-1监测R小泡。逐步添加IP三导致Ca2+从囊泡释放最多50%。最大Ca2+通过添加离子载体，钙霉素A23187，可用于流出。插图表示小脑微粒体（虚线）和重组IP之间的比较三R囊泡（实线）d日-或我-IP（IP）三.轻微上升我-IP（IP）三添加量与污染钙的存在一致2+.

低温电磁图像和三维重建

隔离IP三将嵌入玻璃冰中的R粒子置于液氮温度下进行成像。图三A显示了一些粒子图像。受体颗粒大小规则（～150Å），相互隔离。大约4500个粒子图像是从数字化显微照片中交互选择的。使用软件包EMAN执行图像处理(卢特克等., 1999). 首先使用400个粒子图像的子集来生成起始模型。然后，通过从模型重新投影、多参考比对、分类和三维重建的迭代循环，对剩余的粒子图像进行细化。经过10次迭代，得到了稳定收敛的模型。聚合模型的重投影与相同方向上的类平均值非常匹配（图三B） ●●●●。为了测试三维重建的稳健性，使用了四种不同的起始模型进行细化；在每种情况下，都可以收敛到相同的三维结构。

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图3。IP的Cryo-EM图像三Rs和图像处理。(A类)IP领域三R颗粒，此处可见直径约150Å的黑点。使用在120 kV下操作的Tecnai 12显微镜，在1.2µm散焦、42000×下拍摄图像。每次暴露的电子剂量为～10 e/Å2. (B类)CTF校正前收敛模型的投影（每对中的左侧）与原始数据的相应类别平均值（对中的右侧）进行比较。显示的方位角是从不对称三角形中采样的。每对的两个方位角（β和γ）显示在它们旁边。良好的匹配表明该模型与数据集是一致的。

通过维纳滤波对模型中的对比度传递函数进行校正(霍克斯，1980年;格里戈里夫，1998年). 图中显示了垂直于其4倍对称轴（C4轴）的平面中合成密度图的截面4A.基于典型蛋白质密度（0.81 Da/Å三)，确定阈值密度值，以解释每个IP的1.2 MDa质量三R粒子。该模型在两个不同方向上的表面渲染如图所示4B.结构的横向尺寸沿C4轴变化，一端比另一端小，呈现出不均匀哑铃的外观。在图中4A、 结构底部的前五个切片显示了一个封闭在中心的开口，它对应于小头底部的深凹痕，如图所示4B（面板II）。

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图4。IP的三维结构三R及其在膜中的预测方向。(A类)IP的水平切片三R型垂直于4倍对称轴，从小端到大端运行。每片厚5.0Å。受体结构的高度为～170Å。在腰部区域的一个切片中，一个黄色箭头指向其中一个支柱，形成跨膜结构域和细胞质结构域之间的连接。(B类)面板I和II给出了IP三维结构的表面表示三R从两个视角观察：从上侧面（I）和从底部沿C4轴（II）。假设平均蛋白质密度为1.35克/厘米三，确定了CTF校正后收敛模型的阈值，以给出1.21 MDa的估计分子质量，并将其定义为1.0δ。该阈值定义了所示的曲面。粒子的大小两端在结构的最窄部分即腰部连接。大端有四个侧面突出约50Å的臂。小端（II）的底部在中心有一个凹痕（约25 \8491；深）。在面板III和IV中，沿着C4轴和两个相邻凸出臂之间穿过模型的矢状切片与IP的预测拓扑进行了比较三膜中的R亚单位。等高线的相对密度设置为1、1.5、2.0、2.5、3–18和18.8δ，并在光谱中从蓝色（1.0δ）到红色（18.8δ）进行着色。假设大端为细胞质结构域，小端为膜跨结构域。这种排列与预测的受体拓扑结构一致（第四组）。假设为六跨膜结构域模型，孔环（P-loop）包含两个短疏水序列。配体结合域（紫色）被IP占据三分子。图中还显示了钙结合位点（橙色圆圈）、三个剪接位点（SI、SII和SIII，绿线）、钙调素（CaM）锚定位点、磷酸化位点（青色圆圈）和两个N个-糖基化位点（Y）。

讨论

在本研究中，我们首次提出了1型IP的三维结构三R。结构是从纯化受体的图像中获得的，IP也显示其具有功能三绑定、单通道记录和IP三-特定钙流出分析。IP三R结构与RyR的22Å分辨率结构显著不同(塞雷舍娃等., 1995,1999;奥尔洛瓦等., 1996)另一种类型的细胞内钙释放通道。在当前分辨率（24Å）下，该结构不仅揭示了受体的分子形态，还定义了其亚结构域的空间排列。以前，通过负染和冷冻蚀刻EM只能获得受体的二维投影图像(查德威克等., 1990;前田等., 1990;片山，1996年)提供了有关受体形状和大小的有限信息。通过使用低温电子显微镜，我们克服了以往研究的局限性。我们获得的受体图像大小规则，形状保存完好，可以从SPR生成可靠的三维结构。

IP三R通道呈不均匀哑铃形状，一端明显大于另一端（图4B、 面板I和II）。纯化受体的开放概率很低，最大激活时只有4%(投掷器等., 2002). 考虑到受体是在没有激动剂的情况下成像的，我们假设该结构反映了IP三R处于关闭状态。鉴于已知的受体拓扑结构，小端可能呈现跨膜结构域（TM；图中的面板III和IV4B） 和大端胞质结构域（CD）。这两个区域在低密度区域（以下称为腰部；图4A） ●●●●。这种分配给出了TM与整个结构14%的密度比；这与根据一级序列和预测拓扑估计的TM与整个受体的质量比～11%一致。TM底部有一个开口，即管腔侧，沿C4轴在其半高处直径逐渐变细至～20Å，并在其细胞质半部分完全闭塞。TM开口的闭塞表示离子通量的假定中央通路被阻断。即使在当前分辨率下，通道的栅极和选择性过滤器不可见，考虑到封闭栅极对离子通量的阻挡以及选择性过滤器中中央开口的允许尺寸，表明它们位于TM的细胞质一半。这与根据KcsA钾通道建模的拟议孔隙区域结构形成对比威廉姆斯等. (2001)从管腔侧穿过膜，TM密度向C4轴倾斜约35–45°（图4B、 图III），使管腔表面的TM的横向尺寸几乎是细胞质表面的2倍。TM的横向和纵向尺寸与电压门控钠和钾通道的膜积分部分的尺寸相似(佐藤等., 1998;索科洛娃等., 2001).

腰部密度（图4A） 除四个高密度支柱外，其他支柱均较低。这些支柱对应于四聚体受体的CD和TM之间的主要连接。支柱之间的缝隙（图中的黄色箭头4指向一根柱子）可能会使离子流动，这让人想起T1和膜整体部分之间的四个横向“窗口”所暗示的横向流动路径振动筛钾离子通道(Kobertz等人，2000年;Sokolova等人，2001年). 此外，通道门位于TM管腔一半的腰部和中央开口之间，是控制离子流的理想位置。

CD类似于一个灯泡，四个小臂侧向突出约50Å（图4B、 面板I和II）。四个臂使得受体沿C4轴的投影视图与早期阴性染色EM研究中观察到的视图类似(查德威克等., 1990). 该结构域的尺寸与牛小脑IP快速冷冻深度比赛EM研究的估计一致三卢比(片山等., 1996). 目前，四个突出臂没有相关功能，尽管它们可以被假设为调控域或特定的配体结合位点。

IP的各个域三R结构与IP的预测拓扑吻合良好三R亚单位（图4B、 第四组；Michikawa等人，1994年;Ramos Franco等人，1999年). 六TM模型将受体的N端和C端放在细胞质侧，以及一个长环（106个氨基酸残基，包括两个短疏水序列和两个N个-糖基化位点）。这个长回路的短序列被认为是孔回路(Ramos-Franco等人，1999年;威廉姆斯，2001). 受体每个亚单位的总质量的这种排列很好地符合IP的电子密度分布三R结构。

IP中TM的形状三R结构使我们相信IP信道部分的结构三R与RyR不同(塞雷舍娃等., 1995,1999;奥尔洛瓦等., 1996). 尽管GXRXGGGXGD基序保守三R与RyR有显著不同。在三维重建中，RyR在闭合状态下的通道部分在管腔侧没有明显的开口，尽管其管腔侧（～120Å）的横向尺寸接近IP三R（右）(奥尔洛瓦等., 1996;Samsó和Wagenknecht，1998年). RyR结构的跨膜密度向管腔侧略微变小，而IP的跨膜浓度则相反三R.RyR（四个TM）和IP的不同拓扑三R（六个TM）可能是结构差异的基础。球面重建(江等., 2001)具有在脂质环境中解决膜蛋白的TM的优点，并可能在未来适用于解决这两个密切相关的钙释放通道之间的差异。

IP的当前描述三R结构将在钙信号领域有价值，作为这一重要通道未来结构-功能研究的模板。它构成了将结构改进到更好分辨率的基础，并通过追踪受体复合物的整体构象变化，为研究特定配体和各种辅助蛋白结合后的结构变化奠定了基础。例如，嗜铬粒蛋白与受体的腔面结合，显著增加了其在IP存在下的开放概率三(投掷器等., 2002)，可以让我们观察处于开放状态的受体通道。类型1 IP的结构三R可能代表所有三种类型IP的通用模型三Rs，因为它们在氨基酸序列中具有60-70%的同源性(苏霍夫等., 1991)，并根据疏水性分析共享相同的拓扑。

材料和方法

1型IP的净化三小鼠小脑Rs

该准备工作遵循了已公布的程序，并进行了许多小的修改(Ferris等人，1989年;辛戈拉尼和阿格纽，1992年;Thrower等人，2000年). 在纯化过程中，通过尽可能缩短程序并在每个阶段使用蛋白酶抑制剂，特别注意将受体的降解降到最低。简单地说，每种制剂使用30只冷冻小鼠小脑（平均约2.3克；Pel Freez Biologicals，Rogers，AK）。将小脑放入30 ml冷缓冲液A中（50 mM Tris–HCl pH 8.0，1.0 mM EGTA和1.0 mMβ-巯基乙醇，补充蛋白酶抑制剂）。在40 ml Knotes玻璃均质器中手动均质组织15次。然后将匀浆在100 000下离心克（Beckman L8-70M超离心机中的SW28转子）30分钟。将颗粒再次在缓冲液A中均质，得到微粒体制剂，并使用缓冲液A将最终体积调整为70 ml。用于钙通量实验的微粒体（图2C） 在无EGTA的缓冲液A加1.0mM Ca中制备2+.

对于洗涤剂提取，CHAPS以1.2%的比例添加到微粒体制剂中。将提取物混合物用间歇倒置培养25分钟，然后在45000℃下离心克（Sorvall RC 5+离心机中的SS34转子）10分钟。上清液含有可溶性受体，与10 ml肝素-琼脂糖珠（Sigma）混合培养15分钟，并进行端对端旋转。此后，收集珠子，用50 ml缓冲液B（缓冲液A+0.25 M NaCl+1.0%CHAPS）洗涤，然后用10 ml缓冲液C（缓冲液A+0.6 M NaCl+0.5%CHAPS）洗脱。收集洗脱液并与1.0 ml Con A–Sepharose珠（Sigma）孵育1.5 h。最后，收集珠子，用10 ml缓冲液D（缓冲液A+0.5%CHAPS+1.0 mM Ca）清洗2++1.0 mM镁2+)并用8 ml缓冲液E洗脱（缓冲液A+0.5%CHAPS+1.0 M甲基-α-d日-甘露吡喃苷+4.0 mM EGTA）。

为了去除小尺寸杂质，将制剂在Vivaspin G-100浓缩器（英国林肯Binbrook Vivascience）中浓缩至2.0 mg/ml，然后注入KTA系统中的Superose 6 HR10/30 FPLC凝胶过滤柱（新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech Inc.），并用缓冲液G（0.4%CHAPS、5 mM Tris–HCl pH 8.0、50 mM NaCl、50 m M KCl、1.0 mM EGTA和蛋白酶抑制剂）以0.3 ml/min的流速洗脱。IP三R峰在8.1 ml时作为第一峰洗脱（图1A） ●●●●。

IP重组三Rs进入脂质小泡

在透析缓冲液（10 mM Tris–HCl pH 8.0、50 mM NaCl、50 mmM KCl、1.0 mM EGTA、10µM蛋白酶抑制剂）中制备鸡蛋磷脂酰胆碱（PC；Avanti Polar Lipid、Alabaster、AL）的小单层囊泡（SUV）。将纯化的受体浓缩至0.4–0.5 mg/ml，并用2.0 ml缓冲液G清洗一次。然后将浓缩的受体与等量的SUV悬浮液（1.0 mg/ml脂质）混合。CHAPS对蛋用PC SUV的溶解特性如所述Rigaud等人（1995年）将混合物搅拌30分钟，然后装入一块预先清洁的膜管中（10 mm宽，分子量截止值12000-14000，Spectrum Laboratories，Inc.，Rancho Dominguez，CA），用2000 vols透析缓冲液透析24小时，中间换两次缓冲液。收集囊泡。随后将Nycodenz（Sigma）添加到囊泡悬浮液中的15%。将混合物装入离心管中，并用少量（～50µl）透析缓冲液覆盖。200 000离心克在2小时内（SW55S转子在Sorvall M150GX中，Kendro Laboratory Products，Newtown，CT）将囊泡浓缩到顶部缓冲层，留下未结合的IP三Rs在底部。收集囊泡并用于双层记录。对于钙通量测定，除了透析缓冲液中含有1.0 mM Ca外，囊泡的制备方法相同2+没有EGTA。

IP特征三卢比

SDS–PAGE/免疫印迹。以标准方式对受体进行凝胶分析(Bollag等人，1996年). 对于IP三Rs和RyRs，使用7%分辨率的凝胶和3%堆积凝胶。对于蛋白质印迹，将蛋白质从凝胶转移到迷你反式印迹细胞（Bio-Rad，Hercules，CA）中的Millipore Immobilion-P转移膜片（马萨诸塞州贝德福德）上。然后在缓冲液TBS-T（150 mM NaCl、10 mM Tris–HCl pH 7.4和0.1%吐温-20）中用5%的非脂肪干乳隔夜封闭膜。对于类型1 IP三R、 初级抗体是一种针对受体C末端20氨基酸残基的实验室制备的兔抗鼠单克隆抗体，在TBS-T+0.5%牛奶中与膜孵育1h。然后在相同的缓冲液中清洗膜并与辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔IgG（Amersham Bio Sciences，Piscataway，NJ）孵育。HRP的最终检测采用Pierce ECL plus试剂盒（伊利诺伊州罗克福德）。抗2型IP的多克隆兔抗鼠抗体三R从Chemicon International（加利福尼亚州特梅库拉）购买。类型3 IP三用小鼠单克隆抗体检测Rs（英国列克星敦转导实验室）。RyRs（1型和2型）的小鼠单克隆抗体来自亲和生物试剂（Golden，CO）。用HRP偶联的马抗鼠IgG（Amersham）检测小鼠抗体。

[三H] IP（IP）三 结合试验[三H] IP（IP）三根据标准聚乙二醇（PEG）沉淀程序进行结合分析(Thrower等人，2000年). 简言之，可溶性受体或重组IP三R小泡与[三H] IP（IP）三在存在或不存在1.0µM IP的情况下保持15分钟三然后依次添加0.5%γ球蛋白（Sigma）和30%聚乙二醇8000以沉淀IP三具有绑定IP的Rs三.混合物在14000下离心克持续5分钟。将颗粒冲洗一次，重新悬浮并在闪烁计数器中计数。对于竞争测试，不同浓度的冷IP三使用了。

双层录音。使用一个由薄的特氟隆薄膜隔开的特氟龙室，中间有一个小孔（～100µm），用于录制。为了形成双层，特氟龙膜上的孔预先涂上1,2-二植酸癸烷溶液-锡-甘油-3-PC/1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸-我-丝氨酸（DOPS）重量比为6:1。一旦溶剂干燥，将缓冲溶液填充到两侧。这个顺式-侧缓冲液含有250 mM HEPES–Tris pH 7.35加0.5 mM EGTA反式-一方有250 mM HEPES–Tris pH 5.5加上53 mM Ba2+.用1,2-二油酰基癸烷溶液再次油漆孔-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）/DOPS，重量比为6:1。一旦形成双层，重组IP三R小泡被添加到顺式通常，在5分钟内，受体就会插入双层膜。用2µM IP在0 mV下记录通道活性三已添加到顺式-侧面。

IP的钙流出三R囊泡。钙2+-如上所述制备负载囊泡或微粒体。防渗钙膜2+-在无钙水中制备了敏感荧光染料Indo-1（分子探针，Eugene，OR），以及IP三这些实验中使用的异构体。基于时间的荧光测量是在SPEX FluoroMax-3荧光分光光度计（新泽西州爱迪生市Jobin Yvon Inc.）中进行的，该仪器带有一个温度控制单元（马里兰州波兹曼市Wavelength Electronics Inc.），以将试管保持在10°C，从而最大限度地减少非特异性钙泄漏。每次运行时，40µl Ca2+-加载的囊泡快速通过在分析缓冲液（40 mM HEPES，100 mM NaCl，5 mM KCl pH 7.6，8 G/100 ml Chelex-100）中平衡的1.0 ml G-50自旋柱，以去除所有Ca2+在小泡外面。然后将囊泡添加到含有3.3µM Indo-1的分析缓冲液中以开始实验。在特定时刻，将激动剂或拮抗剂添加到试管中，并记录基于时间的Indo-1荧光强度变化。

低温电磁成像和三维重建

冷冻电子显微镜。冷冻电镜样品的冷冻过程如下所述Jiang等人（2001）除了使用具有1.2–2.0µm孔的Quantifoil栅格（Quantifoil Micro Tools GmbH，Jena，Germany）。在这些格栅的穿孔碳膜上放置一层薄的（～10 nm）碳膜。溶解、纯化IP三将Rs在缓冲液G中浓缩至～1.5 mg/ml，并将3µl加载到格栅的碳膜上，在4°C的大气中吸干，然后在液态乙烷中冷冻。将网格在液氮下转移到Gatan 626低温容器（Gatan Inc.，Pleasanton，CA），并在Tecnai 12电子显微镜下用LaB进行观察6灯丝在120 kV下工作。使用低剂量模式在40000×1.2µm离焦下采集图像。使用光学衍射仪筛选显微照片。在蔡司SCAI扫描仪中以7.0µm/像素的速度扫描好的底片（Z/I成像，亚利桑那州亨茨维尔），然后平均得到5Å/像素的物体水平。

单粒子重建。IP（IP）三使用EMAN软件包交互式选择R粒子(Ludtke等人，1999年)或Web(Frank等人，1995年). 在进行任何处理之前，在EMAN中使用CTFIT对每个粒子图像执行相位翻转。图像也经过了带通滤波。400个粒子组成的亚组根据其总和进行中心对齐，然后通过多元统计分析进行迭代分类，并通过多参考对齐进行对齐，以生成稳定的类平均值。两类平均值具有不同的对称性(卢特克，1999; EMAN文档位于http://ncmi.bcm.tmc。edu/～stevel/EMAN/doc/index.html）用于在MATLAB软件环境（Mathworks，Natick，MA）中构建4倍对称的初始模型（模型A）。该模型针对另一组4100个粒子进行了迭代改进，以获得24Å分辨率结构。改进遵循标准程序。该模型首先在不对称三角形中的190个不同方向上投影，以生成重投影集。然后通过多参考比对将每个原始图像与重投影集进行比较，以找到最佳的方向角。将具有相同方向的原始图像分组为一个类。对于每个类别，采用分类来发现异常值（10-20%）；然后从大多数班级成员中产生了一个新的班级平均数。通过直接傅里叶空间重建，将所有方位角的类平均值组合起来生成新的三维模型(Ludtke等人，1999年). 然后将新模型用作下一次迭代的初始模型。经过8-10次迭代，最终模型收敛得很好。有效分辨率由傅里叶壳相关（FSC；van Heel，1987年;伯特彻，1997年;Zhou等人，2001年)在从数据集的两半重建的两个模型之间(弗兰克，1996年).

为了测试模型的稳健性，对四个不同的初始模型重复进行了改进。第一个模型（模型B）是通过用最大密度填充模型A的中心获得的。第二个模型（模型C）是通过在模型B中引入螺旋扭转，沿C4轴每5Å切片1°导出的。图形的结构4使用比图中所用阈值高三倍的阈值进行阈值操作后4B成为第三个起步车型（车型D）。最后，模型D沿着其C4轴螺旋扭转，每片扭转1°，得到模型E。这四个初始模型根据相同的数据集进行了改进，并发现收敛到相同的结构。同样来自相同的数据集，使用替代软件包IMAGIC进行分类和对齐分析(货车跟等., 1996)产生了类似的结果。通过这些测试，我们认为图中的结构4A是数据集的无偏表示。

鸣谢

我们感谢布伦达·德格雷女士的技术援助，感谢赫尔达·米歇尔女士的颗粒采摘。这项工作的结果基于提交的一篇论文（Q.-X.J.），该论文部分满足了耶鲁大学哲学博士学位的要求。这项工作得到了国家卫生研究院对B.E.E（GM63496）和F.J.S.（NS21501）的资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团