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EMBO J。2002年7月15日；21(14): 3643–3651.
数字对象标识：10.1093/emboj/cdf377
预防性维修识别码：PMC126122项目
PMID：12110577

盲人和无钟突变体的光接收和昼夜行为粗糙脉孢菌

兹德拉夫科·德拉戈维奇,鹰潭,马吉特·戈尔,1,2 内伯格,三和玛莎·梅罗
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

丝状真菌粗糙脉孢菌是蓝光光感受和昼夜节律遗传解剖的模型生物。白领-1（WC-1）和WC-2被认为是所有光响应所必需的，而频率（FRQ）是光调节无性发育（分生孢子形成）所必需的；如果没有这三者中的任何一个，在恒定的条件下，自我维持（昼夜节律）的节律就会失效。这里我们显示，个体或突变体中发生了光调节和自我维持的发育白领菌株。这些菌株在每天的光控分生组织中类似于野生型。光诱导基因的分子图谱表明白领-1和白领-2突变体利用不同的途径，尽管它们在各个方面的外观相似。通量率的滴定也表明了两种菌株之间的光敏性不同。这些数据要求存在一个经身份验证的光感受器。此外，这些突变株中现存的生物钟机制支持这样一种观点，即生物钟系统神经孢子菌属涉及WC–FRQ回路以外的组件。

关键词：昼夜节律/频率/光/神经孢子菌属/白领

介绍

生物体在日常生活中接收到的最可靠的环境信号是光和暗，它们来来往往都非常精确。光为光合作用提供能量，为生长和新陈代谢产生热量，并促进视觉。它还履行复杂的信号传递功能，将一天中的时间传递给称为昼夜节律系统或时钟的内源性分子网络。昼夜节律系统可以通过释放到恒定条件（自由运行节律）后持续～24小时的节律来识别。在许多实验系统中，似乎许多（如果不是大多数）分子、酶和过程都是这种振荡的昼夜节律时间线的一部分，所有这些都最终受光的调节。这项任务所涉及的光环境特征（例如强度或光谱组成）尚不清楚，细胞级的光处理组件也不清楚。简单的丝状真菌是定义昼夜节律系统和光输入途径的一个极好的模型系统粗糙脉孢菌对光和昼夜节律调节的分子机制的理解与更复杂的生物体的类似。

定性而言，在神经孢子菌属似乎仅限于光谱中的蓝色和UV部分(De Fabo等人，1976年;西部，1976年;达尔曼达，1980年;Linden等人，1999年). 从数量上讲，分生孢子（无性孢子）的形成受到接近月光的光照水平的调节，而胡萝卜素生成的光诱导需要大约两个对数级以上。这表明神经孢子菌属反映不同光感受器或信号通路的光输入途径(Merrow等人，2001年). 许多光接收缺陷的突变屏幕只显示了两个光感受器候选；白色项圈-1（WC-1）和WC-2。这两个突变体对许多光反应都是盲的，包括菌丝体类胡萝卜素的产生(哈丁和特纳，1981年)性结构的形成及其向光性(Degli-Innocenti和Russo，1984年;哈丁和梅勒，1984年)，基因表达(Sommer等人，1989年;Arpaia等人，1993年;Li和Schmidhauser，1995年;Crosthwaite等人，1997年;Collett等人，2002年)以及分生孢子（无性孢子）形成的时间调控(俄罗斯，1988年)和分生孢子的总体水平(Lauter等人，1997年).

WC蛋白部分通过与光调节启动子结合并允许转录来传递光信号(Ballario等人，1996年;林登和马西诺，1997年). WC-1和WC-2相互形成复合物，并与第三种蛋白质（称为FRQ）形成复合物(Talora等人，1999年;Denault等人，2001年;Merrow等人，2001年)，是神经孢子菌属昼夜节律系统。光和昼夜节律通路之间的功能联系的证据是，一方面，在没有WC-1或WC-2的情况下，昼夜节制质量（例如自由运行的能力）的丧失，另一方面，没有FRQ的光调节分生孢子带形成(Chang和Nakashima，1997年;Merrow等人，1999年;Lakin-Thomas和Brody，2000年). 其他生物也有类似的特征。在植物中，职业光感受器Phy和Cry物理上相互作用，也影响自由运转的昼夜节律周期(Ahmad和Cashmore，1998年;Somers等人，1998年). 在蓝藻中，SasA也调节自由运行的节奏(岩崎等人，2000年). 最后，在动物体内，Per蛋白控制光诱导的时钟重置(Albrecht等人，2001年). 在神经孢子菌属昼夜节律和光输入途径的组成部分通过功能、蛋白质复合物的形成以及相互依赖的表达调控紧密相连(Crosthwaite等人，1997年;Lee等人，2000年;Merrow等人，2001年;Cheng等人，2002年). 无FRQ菌株的分生盲目性是有选择性的，因为频率q突变体保留了产生光诱导类胡萝卜素的能力。再一次，我们定义了一条分叉的光输入途径，这次是在遗传水平上，以胡萝卜素生成和分生作为读数(Merrow等人，2001年).

分生孢子受昼夜节律系统以及包括光在内的环境因素调节。在持续的黑暗中，分生孢子大约每22小时以离散带形式积累一次，即它是一种自由运行的昼夜节律的输出(Pittendrigh等人，1959年). 黑暗中该带形成的时间随光的照射而改变（相移）。相移量(达尔曼达，1980年)和光感应的量频率qRNA表达(Crosthwaite等人，1995年)与光传输量相关，表明两者之间的关系。在恒定光照下，不存在离散带中的分生孢子固结，分生孢子几乎是连续产生的(Pittendrigh等人，1959年). 在24小时的光和暗交替循环中，分生孢子在一个精确的时间窗口内产生(Chang和Nakashima，1997年;Merrow等人，1999年;Lakin-Thomas和Brody，2000年)这是与周期系统相关的，作为特定相位同步。

这是我们采用的最后一个协议，以进一步描述与分生孢子调节有关的光输入成分：利用释放到恒定条件的分析依赖于自我维持的节奏，以随后显示光的影响，而在24小时周期中，光诱导效应不依赖于持续的振荡。在这些光-暗（LD）循环中，我们发现厕所突变体，单独或组合在同一菌株中，调节对光的反应。对潜在分子事件的研究表明，这两个突变株具有不同的基因激活谱，尽管它们在所有水平的光反应性或非反应性上具有表型相似性。荧光滴定实验揭示了突变体对光的不同敏感性。数据支持存在一种尚未在神经孢子虫。在白领突变体是理解光输入的分子和遗传方面的关键步骤神经孢子菌属以及它们如何与昼夜节律系统相互作用。为此，一旦对LD循环的竞赛管条件进行了优化，就使用它们来测定厕所自由奔跑条件下的突变体，表现出自我维持的节奏。我们的结论是，尽管FRQ和WC蛋白对昼夜节律和光输入系统有很大影响，但它们的缺失会导致选择性而非全局性失明和心律失常。

结果

wc突变体同步分生以响应光

这个厕所突变体未能通过一组光诱导生理反应的分析。然而，在从恒定光线或短暂曝光到恒定黑暗的转换过程中，可以看到与转换时间相关的细微变化，尽管这种转换没有明显的持续影响(Ninneman，1991年;Crosthwaite等人，1997年). 这个结果要么反映了厕所突变株或可能是由于它们无法支持持续的、自我维持的节律。

在这里描述的实验中，最初通过提交厕所突变为24小时LD周期。在这些方案中，两种药物都具有强健的光调节生理学厕所突变体，分生孢子的产生巩固到LD循环的离散阶段，类似于野生型菌株（图1A–C和E）；这个频率q正如先前报道的那样，突变体对相同的光循环没有反应(Chang和Nakashima，1997年;Merrow等人，1999年;Lakin-Thomas和Brody，2000年). 然而，与野生型相比，突变株的分生阶段延迟了2.8小时（Δwc-1型在Δ中增加3小时wc-2型).

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图1。Δ中的锥度wc-1型和Δwc-2型在LD循环中同步。将24小时LD循环1周的数据进行双重绘制（每条线2天，图右侧的日期在下一条线的左侧重复）。暗期由灰色阴影表示。图中的峰值表示分生孢子的合并，以及相应的神经孢子菌属座圈管如（E）所示。(A类)野生型(重量); (B类) Δwc-1型; (C) Δwc-2型; (D类) Δwc-2型Δwc-1型; 和(E类)上述图表和Δ的竞赛管频率q（对于这种菌株，只显示了一个竞赛管，因为它无法同步光的照射）(Chang和Nakashima，1997年;Lakin-Thomas和Brody，2000年;Merrow等人，2001年). （A–C）、（D）和（E）的流速分别为4和35µE/m2/s、 分别是。显示的野生型赛道的运行时间超过图表上显示的7天；在图（C）的最后一天中看到的同步性损失反映了从实验条件下提前移除了竞赛管。

营养已被证明在光接收中起作用(中岛和藤村，1982年;Sokolovsky等人，1992年)并且时钟突变体没有野生型菌株所具有的营养补偿(Loros和Feldman，1986年). 因此，比较了几种培养基配方在突变菌株中的分生孢子带外观。含有葡萄糖、奎宁酸（自然界中的碳源神经孢子菌属)或未检测碳源。尽管在所有三种条件下的循环中都可以清楚地看到光的反应（数据未显示），但在含有奎宁酸或无碳源的介质中，谱带最为离散。滴定实验表明，较低的葡萄糖水平会减少背景分生孢子，从而增强分生孢子带的外观，而不一定会增加光敏感性。在为期一周的竞赛管实验过程中，突变菌株产生的条带密度增加，与无FRQ菌株的自由运行节奏相似(Loros等人，1986年). 因此，使用长颈管来提高数据采集的可能性。

双突变体Δwc-2Δwc-1通过光同步

Δwc-1型对于与Δ相同的大多数输出是盲的wc-2型。有几个场景符合这些观察结果，包括一种或两种蛋白质产物作为光感受器的可能性。考虑到单个突变体中的任何一个都可以同步光合作用，双突变体Δwc-2型Δwc-1型生成并提交至24小时LD循环。与单个突变体一样，双突变体菌株在光照阶段巩固了分生孢子的产生（图1D和E），具有与单个突变体相似的阶段（相对于野生型延迟2.8小时）。

考虑到Δwc-1型和Δwc-2型突变体，验证菌株身份至关重要。光诱导菌丝体胡萝卜素生成被用作WC蛋白的功能测定。如前所述(哈丁和特纳，1981年),厕所突变体在持续黑暗和光照条件下都不能在菌丝组织中产生类胡萝卜素（图2A） 而野生型菌株对光反应强烈，基础菌丝类胡萝卜素增加了3倍以上。

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图2。验证厕所突变菌株。(A类)在单突变株和双突变株中，光诱导菌丝体胡萝卜素生成失败。对野生型菌株的光密度（OD）值进行稀释校正。(B类)WC-1蛋白的Western blot显示在Δwc-1型RIP突变体（两个左车道）与野生型（两个右车道，重量). 顶部面板曝光5秒，中间面板曝光过度（30秒）。为了定量目的，用Ponceau S对印迹进行染色（底部面板）。(C)WC-2蛋白的Western blot，左边的箭头显示全长蛋白，与该突变株中截短的蛋白（ΔWC-2）进行比较(林登和马西诺，1997年). 背景带表明油井的负载均匀。(D类)假定翻译起始站点周围的区域（灰色框）wc-1型从Δ中克隆并测序wc-1型应变。顶行中的序列对应于野生型wc-1型DNA序列，突变序列就在它的正下方。星号表示点突变的位置，序列的最后一行对应于序列到蛋白质的假定翻译，这反映了沉默突变直到终止密码子。

评估突变菌株是否存在WC-1或WC-2蛋白。Δwc-1型该菌株是一个“RIP”突变体(Talora等人，1999年)由一个基因的甲基化和随后的突变产生，当存在两个拷贝时(Selker和Garrett，1988年). 在这种情况下，启动子区域也被RIPed，导致没有检测到RNA（L.Franchi，个人通信；数据未显示）。在突变菌株中未发现WC-1蛋白（图2B） ●●●●。作为菌株身份的进一步分子验证wc-1型Δwc-1型对菌株进行克隆和测序（图2D） ●●●●。结果表明，如果RIPed启动子产生任何RNA，翻译将在15个氨基酸后停止。随后会出现许多额外的终止密码子（未显示数据）。Δwc-2型突变体产生一个截短的WC-2蛋白，缺少锌指(林登和马西诺，1997年). 结果如图所示2C确认Δ中不存在全长WC-2蛋白wc-2型突变体，而截短的较小形式是可检测的。由于存在截断的WC-2蛋白，尽管缺乏光诱导类胡萝卜素，但Δwc-2型突变可能是由于蛋白质N末端的残余活性所致。为了确认Δwc-2型突变体不是从这个蛋白质片段衍生而来的wc-2型独立来源的淘汰赛(Collett等人，2002年)在相同的实验中进行了测试，发现根据LD循环调节分生（数据未显示）。

我们用几种方法验证了双突变菌株：即不能产生光诱导类胡萝卜素（图2A） 、缺乏WC-1蛋白（数据未显示）和截短WC-2蛋白的产生（图2C） ●●●●。最后，我们在光周期中测试了来自同一个杂交组合的兄弟姐妹。在六个双突变体中，所有菌株都同步。综上所述，这些观察结果证实了突变菌株的身份，并证实了在完全不能产生类胡萝卜素的菌株中，会形成强健的、受光调节的分生孢子带。WC-1和WC-2对光的分生调节都不是必需的。

Δwc-1中的光诱导RNA和蛋白质，但Δwc-2中没有

关于光对分生孢子的调节，已经描述了几个分子事件(Corrochano等人，1995年;Crosthwaite等人，1995年;Li和Schmidhauser，1995年;Heintzen等人，2001年). 其中包括快速诱导频率q和虚拟虚拟现实RNA和蛋白质（见图三分别为A和D）。为了阐明光诱导分生孢子带形成的分子途径，在突变菌株中研究了这些输出。在Δ中wc-1型突变体，频率qRNA在光照10分钟内被诱导，并在整个光培养6小时内保持升高（图三B和G）。一般来说，诱导动力学与野生型相似（图三A和G）。低基础水平的频率qΔ中的RNAwc-1型菌株在DD34时间点特别明显，此时野生型菌株的昼夜节律系统正在促进增加频率qRNA水平。这与以前的报告一致，反映了这些分子之间的相互依赖调节(Crosthwaite等人，1997年;Lee等人，2000年;Merrow等人，2001年). 在6小时光培养结束时频率qΔ中的RNAwc-1型野生型菌株大致相等，表明在光照下长期培养过程中，频率qΔ中的RNA水平wc-1型可以接近野生型菌株。

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图3。通过northern blot分析测定光诱导RNA。(A类–C) 频率qRNA水平；(D类–F类) 虚拟虚拟现实RNA水平。（A） 和（D）是来自野生型培养物的样本；（B） 和（E）来自Δwc-1型; （C）和（F）来自Δwc-2型面板曝光过度。通过探测rRNA（未显示）来控制RNA的负载，这些值用于量化。(G公司)量化频率qRNA诱导如（A）和（B）所示。指示采收时间，在灯亮后6小时内，DD28（DD表示恒定黑暗，例如28小时）和DD34表示在光照开始和结束时采收的黑暗对照。

Δ中光诱导FRQ蛋白产生的动力学wc-1型（图4A） 再次与野生型菌株相似，首次出现在30分钟内，在2小时内大量积累（图4). 当比较这两种菌株时，FRQ蛋白诱导的定性方面也相似：在DD28中流行的高分子量形式在光照2小时后被新制备的低分子量（磷酸化程度低）蛋白取代。

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图4。光诱导FRQ蛋白。(A类)Δ中的FRQwc-1型以及在放射自显影胶片上短时间（顶面，1s）和长时间（底面，30s）暴露western blots的野生型蛋白提取物。两种野生型左侧的对照样品(重量)和Δwc-1型在DD28收获系列；恒光（LL）来自于在恒光下生长的野生型菌丝体。收割时间显示在顶部，从DD28的灯亮起。(B类)FRQ蛋白是在Δwc-1型但不是Δwc-2型应变，如这里在延长的胶片曝光（30s）中所示。Δ左右两侧的对照样品wc-1型和Δwc-2型在DD28和DD34，即每次光培养的开始和结束时收获系列。收割时间显示在顶部，从DD28的灯亮起。

与Δ的结果相比wc-1型应变，也不是频率qRNA（图三C） nor FRQ蛋白（图4B） 由Δ中的光感应wc-2型应变，应变(Collett等人，2002年). 两者都不是厕所突变菌株产生光诱导虚拟虚拟现实RNA（图三C和F），与之前关于光诱导基因在厕所突变体(Sommer等人，1989年;Arpaia等人，1993年;Li和Schmidhauser，1995年). 因此，频率q感应强度（Δ）wc-1型定义了不同的信号转导途径。

我们之前已经证明，光调控分生孢子只需要FRQ的存在，而不需要其急性诱导(Merrow等人，2001年). 最多wc-2型突变体，低水平频率q观察到FRQ(Crosthwaite等人，1997年;Merrow等人，2001年;Collett等人，2002年)，这是一个先决条件，显然允许此处所示的光调节射出（图1C和D）。但是，FRQ可能会在延长的光培养过程中发生定量或定性变化，例如，在这些周期中使用的12小时的光有助于带形成，而在图的光诱导实验中使用的6小时的光三和​和4。4为了研究这种可能性，在延长光培养（～44 h；图5). 在两个Δ中wc-1型和野生型，FRQ在恒定光照下积累到相对较高的水平，在黑暗中降解，直到内源性或外源性信号重新诱导其产生。在Δ中wc-2型突变，FRQ水平无定量或定性变化。因此，光对分生孢子的调节虽然依赖于FRQ，但不需要对其进行明显的修改。

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图5。荧光标记转移后FRQ蛋白水平。菌丝体在LL中生长，然后在释放到DD中后收获10小时（顶部显示）；提取蛋白质进行western印迹。野生型(重量), Δwc-1型和Δwc-2型比较菌株的FRQ蛋白。曝光时间显示在右侧。对照样品为Δ频率q生长在LL中，在所有三个面板的右侧车道上。背景带的外观差异源于替代开发协议，该协议用于底部面板，以降低长时间曝光的背景水平。

光诱导分生的荧光滴定

分子发现（图三​344–5)为细胞内不同的光传导途径提供证据wc-1型和wc-2型突变体，尽管LD循环中的分生阶段相似（图1B和C）。值得注意的是，这两种菌株的差异在于FRQ的表达：wc-2型突变株，尽管有强健的、光调节的分生作用。这与之前的观察结果形成了对比，这些观察结果似乎与频率q相移感应(Crosthwaite等人，1997年)、和频率q分生带形成时间的等位基因(Chang和Nakashima，1997年;Merrow等人，1999年). 因此，对于不同程度的光诱导FRQ表达，人们可能会认为在wc-1型和wc-2型菌株；然而，这个预测失败了。

我们使用通量率滴定法来确定突变体是否使用相同的途径来同步分生（即在两种情况下都独立于FRQ）。对24小时LD循环中的光通量率进行滴定，试图从功能上剖析这些途径。野生型菌株50%同步的通量阈值（图6A） 与之前公布的数据一致(Merrow等人，1999年). Δwc-1型突变体也能有效地同步，尽管它需要的光大约是野生型的两倍。Δ的同步wc-2型突变体需要比野生型多20倍的光照，而双突变体Δwc-2型Δwc-1型是野生型的200倍。两个单一突变体同步分生的光敏性差异很大，这表明菌株在一定程度上使用不同的分子机制。

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图6。分生孢子带同步荧光滴定法。(A类)在24小时LD循环中以分级注量率保持赛车管。绘制了每个应变的不同注量率的同步相对强度（见材料和方法）。（B和C）FRQ诱导在DD28开始的4小时光培养后测定。滴定通量率，野生型(B类,重量)和Δwc-1型(C)对菌株进行了比较。

利用FRQ蛋白作为野生型和Δwc-1型突变菌株（图6B和C）。在野生型中可以看到FRQ诱导，光照强度仅为0.002µE/m2/s、 在这两种菌株中，0.02µE/m时几乎完全诱导2/第条。野生型和Δ型FRQ的光诱导敏感性wc-1型与光同步分生密切相关，例如敏感性相似，突变株中有轻微缺陷。

wc突变体中的自持昼夜节律

光调控分生孢子小种管实验的优化厕所菌株显著增强了条带外观。在使用24小时LD循环的实验中，昼夜节律时间和直接光反应都会对每日的分生事件产生影响。虽然厕所突变体反复被证明是无节律的(俄罗斯，1988年;Ninneman，1991年;Crosthwaite等人，1997年)，我们研究了介质和长跑管的组合是否能在这些时钟突变体中显示自持节律。null频率q突变体是有节奏的，但只在长跑管上(Loros等人，1986年;Aronson等人，1994年). 当厕所突变体在无葡萄糖的恒定黑暗中生长，并在长尾管上生长，它们在分生孢子形成过程中形成了一种自我维持的节律（图7). 在这些条件下，周期比野生型长。具体而言，单个实验中的管子产生的Δ周期分别为21.5、22.2、23.3和29.3 hwc-1型标准偏差（SD）分别为1.6、2.8、2.6和2.4小时。相比之下，两个野生型对照竞赛管的周期分别为22.9±1.2和22.8±1.7小时。Δ的座圈管wc-2型周期分别为24.8、30.5、33.8和34.7小时，SDs分别为1.3、5.7、0.5和1.2小时。一般来说，突变的小种管有三到四个分生孢子带用于这些计算，而野生型有七到八个。这些数据只揭示了部分的昼夜节律功能丧失厕所突变体；虽然自给自足仍完好无损，但精度似乎有所下降。

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图7。在厕所突变体。在持续黑暗中培养的试管也会将分生孢子固结到一天中的离散时间，这表明还有一个剩余的时钟装置。

讨论

神经孢子虫具有感光性，不含两种WC蛋白

这个厕所在光接收缺陷的屏幕上发现了突变体(哈丁和特纳，1981年;Degli Innocenti和Russo，1984年). 人们一再发现它们对光无反应，从而得出结论：它们是盲人(Sommer等人，1989年;Ballario等人，1996年;林登和马西诺，1997年;Cheng等人，2001b;Schwerdtfeger和Linden，2001年). 这里，我们报告说厕所突变体，单独或组合为双突变体时，在远低于自然白天条件下的光照水平下，容易同步分生孢子带的形成（图1和​和6）。6). 这一观察的关键是使用夹带协议（24小时LD循环）。以前的实验研究了光对植物种子萌发的影响厕所突变体（例如。Lauter等人，1997年)只使用恒亮或恒暗与含有高浓度碳源的介质结合使用。在其他实验中，在持续的黑暗中传递的光脉冲揭示了对光的反应，这种反应无法评估，因为条件不利于自我维持的节律(Ninneman，1991年;Crosthwaite等人，1997年). 这里使用的夹带协议清楚地证明了一种新的光输入路径神经孢子菌属.

报告的第二个缺陷厕所紧张是他们缺乏昼夜节律(Crosthwaite等人，1997年). 然而，考虑到其他时钟突变体频率q轨迹，在限制条件下有节奏(Loros等人，1986年;Aronson等人，1994年)，我们测试了厕所利用周期协议中使用的介质和种族管实现自我维持节律的突变体。在持续的黑暗中wc-1型和wc-2型突变体表现出自我维持的昼夜节律。根据报告频率q突变体，节律性缺乏昼夜节律性，在这种情况下是精确的，并且周期往往比野生型更长。这一观察有助于建立昼夜节律系统的模型；有一个昼夜节律机制玻璃钢/碳化钨转录-翻译反馈回路，随昼夜节律周期振荡。这个frq/wc公司反馈循环附加了某些特性(Roenneberg和Merrow，1998年).

神经孢子虫的感光细胞是什么？

蓝光感光器的当前候选神经孢子菌属即WC-1和WC-2。它们都是PAS和/或LOV的转录因子(我好的，o个氧气或v（v）电压）域(Ballario等人，1996年;林登和马西诺，1997年)，这些特征有时参与异源二聚，但也与黄素作为蓝光发色团结合有关(Christie等人，1999年). WC-1中的LOV结构域与植物光感受器NPH1相似，其中的突变导致光诱导菌丝体胡萝卜素生成失明(Ballario等人，1998年). 我们的结果并没有排除WC蛋白作为光受体候选蛋白的可能性，而是引入了第三种蛋白的可能性。基于与WC蛋白的功能比较，FRQ可能被提议用于这一作用。然而，鉴于FRQ没有表示感光细胞功能的特征序列，这是不太可能的(McClung等人，1989年). 其生化特性包括通过CAM激酶或酪蛋白激酶Iε物种进行磷酸化(Goerl等人，2001年;Yang等人，2001年)昼夜节律背景下的定时出现和退化(Garceau等人，1997年)以及对自订的负反馈效应(Aronson等人，1994年b)通过未知机制。FRQ序列具有一个螺旋结构域，它介导与自身和WC蛋白的结合(Cheng等人，2001a)从而形成蛋白质复合物(Denault等人，2001年;Merrow等人，2001年)这是光感受后转录反应的核心(Linden等人，1999年). 鉴于这一信息，我们倾向于采用一种需要as-yet-unidentified感光器的模型。多个光感受器神经孢子菌属已被建议(达尔曼达，1980年)基于使用不同读数时作用光谱的多个峰值和差异，即相移与光诱导的颈动脉生成(De Fabo等人，1976年).

光信号转导的分子复杂性

无论WC蛋白中的任何一种是否是光感受器，它们对于光信号转导的一个子集（例如颈动脉生成）是必需的，而FRQ对于另一个子集（例如分生孢子）是必需的。这两种输出具有截然不同的光敏度，支持分支光输入路径的存在(Merrow等人，2001年). 在完全没有光诱导的胡萝卜素生成的情况下，也可以看到多种光输入途径的其他证据wc-2型仍然能够光诱导基因表达的突变株(Degli-Innocenti和Russo，1984年;Collett等人，2002年)或WC-1磷酸化(Talora等人，1999年). Δwc-2型这些研究中使用的菌株不是光诱导的基因表达或胡萝卜素生成菌株。

在这里，我们通过证明光调节的分生持续存在于盲人中，继续从遗传学上定义分支光输入途径厕所突变菌株。我们还发现，在分生枝内，Δwc-1型和Δwc-2型菌株在光诱导下的基因表达。与之前的工作相比(Crosthwaite等人，1997年)，我们发现频率qRNA和蛋白质在Δ中被诱导wc-1型突变体（图三和​和4）。4). 然而，蛋白质在Δ中既没有被诱导也没有被修饰wc-2型(Collett等人，2002年). 因此，虽然FRQ蛋白对于光调节的分生至关重要(Chang和Nakashima，1997年;Merrow等人，1999年;Lakin-Thomas和Brody，2000年)，其急性诱导(Crosthwaite等人，1995年;Collett等人，2002年)，其循环（就其在生物钟中的作用而言）及其磷酸化(Garceau等人，1997年)不是。

不同于的光感应频率q,虚拟虚拟现实需要WC-1（图三)-分支系统中的一条小枝，表明VVD是胡萝卜素生成分支的一部分，该分支可能与其他在wc-1型突变体(Sommer等人，1989年;Arpaia等人，1993年;Li和Schmidhauser，1995年). The most conspicuous feature of a虚拟虚拟现实突变是异常高的类胡萝卜素积累，但它也调节对昼夜节律系统光输入的影响。这些影响可能是通过破坏长时间光照下反应的适应来介导的(Heintzen等人，2001年;Schwerdtfeger和Linden，2001年;Shrode等人，2001年). 功能上，WC-2似乎在vvd/频率因为这是两个基因的光诱导表达所必需的（见图8).

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图8。一种新型光感受器的遗传证据神经孢子菌属.致癌作用和分生孢子是两种受光和昼夜节律调节的产物。致癌作用需要两种WC蛋白，而没有FRQ，光对分生孢子的调节就失败了。所有三种蛋白都是调节其基因表达的复合物的一部分（为清楚起见，此处未作说明）(Crosthwaite等人，1997年;Lee等人，2000年;Goerl等人，2001年;Merrow等人，2001年;Cheng等人，2002年). 该图并非旨在总结已知的调节间效应，而是定义的光信号途径。符号：填充圆圈、蛋白质产品；闪电、外源光；矩形，蛋白质复合物形成。

光响应的昼夜调节：响应强度与灵敏度

据报道，在几个系统中，昼夜节律时钟的光输入发生了昼夜调节(Roenneberg和Merrow，2000年). 在神经孢子菌属光诱导基因表达和胡萝卜素生成反应强度的日变化(Heintzen等人，2001年;Merrow等人，2001年)可以归因于FRQ对WC-1水平的调节，推测WC-1是一个光感受器。有FRQ时，光诱导胡萝卜素生成的响应强度大于无FRQ时的响应强度，而两种情况下的通量率阈值都没有变化，即没有灵敏度缺陷，这与光感受器的定量而非定性变化一致。因此，FRQ在不改变灵敏度的情况下起到响应放大器的作用。相反，在分生的情况下，通量滴定揭示了WC突变体的敏感性缺陷（图6). 这样的观察表明，在这两种情况下，光感觉发生了独特的改变厕所突变菌株。在野生型菌株中，用于分生孢子的光感受器由FRQ、WC-1、WC-2和一种新型光感受剂的功能组成。FRQ参与这一过程是因为wc-1型菌株接近野生型敏感性，在恒定光照下，它也能产生相对于野生型约50%的FRQ蛋白水平（图4和​和5）。5). 相反，灵敏度最低的应变（Δwc-2型和Δwc-1型Δwc-2型)FRQ最低（野生型水平的～5%）。考虑到WC-1和FRQ水平在一天中发生变化，光输入的昼夜节律调节可能会影响灵敏度（通量阈值）和反应强度。

神经孢子虫的复视

基本观察表明，至少有一个光调节表型在厕所突变体重塑了我们的光感概念神经孢子菌属我们面临着许多新问题和一些新工具。首先，调节分生路径的光感受器是什么？为了找到其基因，双突变菌株是LD循环中诱变和后续筛选的最佳候选菌株。其次，光输入的昼夜节律调制是否会影响光接收的灵敏度？为了解决这个问题，必须在整个生理周期中构建高密度通量滴定曲线。第三，光通过FRQ、WC-1或WC-2调节无性发育的哪些方面？用微阵列分析应该能揭示每个突变株中光诱导的独特基因集。这些信息将补充先前描述的已知事件和基因表达谱(Sachs和Yanofsky，1991年;Madi等人，1994年). 也有可能厕所突变体通过代谢（非转录）机制调节分生。最后，考虑到厕所突变体在持续的黑暗中表现出自我维持的节律性，这种节律性可以被光同步，还有哪些额外的分子成分负责这些残留的昼夜节律性？双突变体的突变和适当条件下的筛选将揭示额外的生物钟成分。

材料和方法

应变

被称为野生型的菌株是标准的实验室菌株，用于昼夜节律实验，以及在神经孢子菌属.它含有一个叫做乐队(bd公司)导致分生孢子的每日固结(Sargent等人，1956年). Δwc-1型通过杂交RIP突变体获得菌株(Talora等人，1999年)在上bd公司背景。Δwc-2型此处使用的应变(234瓦FGSC 3187；堪萨斯州堪萨斯城真菌遗传库存中心）是一种导致产生截短蛋白质的点突变(林登和马西诺，1997年)，也被交叉以获得wc-2 234w；bd公司（称为Δwc-2型). Δ的所有结果wc-2型使用完全敲除菌株确认(Collett等人，2002年). 双突变体wc-2 234w；bd；wc-1型RIP（称为Δwc-1型Δwc-2型在这项工作中）是通过跨越bd；Δwc-1型RIP和Δwc-2；生物柴油菌株。

输水管实验和数据分析

“输卵管”（长40厘米，直径1.2厘米）可以可视化约1周的线性生长，因此非常适合用于描述定时发育事件的实验。用于这些实验的竞赛管介质是1×Vogels盐(沃格尔，1964年)2%琼脂、0.5%精氨酸和10 ng/ml生物素（即不添加葡萄糖，导致突变菌株中形成更清晰的条带）。LD循环从接种小试管开始，在恒定光照下培养1天，然后转移到12小时光照和12小时黑暗的循环（24小时LD循环）。当生长达到试管的远端时（>1周），实验结束。使用冷白色荧光灯泡发出的光（欧司朗，德国）；注量率为4µE/m2/s、 除非另有说明（图1和​和6）。6). 所有实验均受到严格控制并永久记录，以便在25°C下保持温度，以排除温度影响。在恒定条件下进行的实验中，试管在恒定光照下发芽（如上所述）过夜，然后转移到恒定黑暗中，在昏暗的红光下显示生长速度。按照CHRONO程序确定的时间，定期标记小导管，以促进生长和分生孢子发育与消逝时间的相关性(Roenneberg和Taylor，2000年).

通过平均每个菌株在每个通量率下的竞赛管数据（每个通量，野生型有两个竞赛管，每个突变体有四到六个竞赛管；使用了所有竞赛管，即未进行选择）来分析通量滴定实验。通过周期图分析来评估光调节分生孢子同步的程度(索科洛夫和布歇尔，1978年)对于使用CHRONO的每个平均时间序列(Roenneberg和Taylor，2000年). 结果表示为给定菌株最高Qp值的百分比。Fluence响应曲线的拟合如梅罗等. (2001).

分子分析

液体培养用于评估光诱导分子组分。菌丝体在液体培养基中生长，方法是将培养7-10天的分生孢子接种到与小试管相同的培养基中，但添加2%的葡萄糖，省略琼脂。培养皿接种10个5分生孢子/ml，在恒定光照下萌发16h，然后在25°C下转入黑暗，直到DD28开始光培养。在指定的时间或在光照下4小时后采集电极（通量滴定）。

如前所述，制备并加工RNA和蛋白质用于北部和西部分析(戈尔等., 2001;梅罗等., 2001). 分别使用5%、7.5%和10%聚丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶拆分WC-1、FRQ和WC-2。对于WC-1和FRQ的检测，使用单克隆抗体，而对于WC-2的检测，则使用亲和纯化的多克隆抗WC-2。

如前所述，在圆盘培养中测量光诱导菌丝体胡萝卜素生成(梅罗等., 2001).

鸣谢

我们感谢Vera Schiewe和Astrid Bauer的支持，感谢Moyra Mason的技术帮助，感谢G.Macino、L.Franchi、H.Prokisch和W.Neupert对手稿的批判性评论，感谢J.Loros和M.Collett发送wc-2型在出版物中对其进行描述之前，先进行基因敲除。我们感谢赫尔穆特·克劳斯纳（Helmut Klaussner）的精湛工艺，我们需要依靠他来满足我们苛刻而复杂的基础设施。这项工作得到了德意志基金会、弗里德里希·鲍尔和迈耶·斯特鲁克曼基金会以及汉堡埃彭多夫公司的支持。

证据中添加的注释

自从接受这份手稿以来，刘毅教授告诉我们wc-1型点突变可以重新启动翻译。我们感谢他向我们发送了一份完整的wc-1型RIP应变。利用该菌株，我们证实了在没有WC-1的情况下，通过光循环进行夹带。J.Loros教授还建议，“Δ”符号应仅用于通过完全ORF替换构建的敲除等位基因。我们很抱歉出现任何混淆，请读者参阅材料、方法和结果部分以及图2，以完整描述菌株。

工具书类

  • Ahmad M.和Cashmore，A.R.（1998）1元人民币的蓝光感光体拟南芥与光敏色素A相互作用在体外.分子电池,1, 939–948. [公共医学][谷歌学者]
  • Albrecht U.、Zheng，B.、Larkin，D.、Sun，Z.S.和Lee，C.C.（2001）每1米和每2米对生理时钟的正常重置至关重要。生物学杂志。节奏,16, 100–104. [公共医学][谷歌学者]
  • Aronson B.D.、Johnson，K.A.和Dunlap，J.C.（1994a）昼夜节律钟位点频率：单个ORF定义周期长度和温度补偿。程序。美国国家科学院。科学。美国,91, 7683–7687.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Aronson B.D.、Johnson，K.A.、Loros，J.J.和Dunlap，J.C.（1994b）定义生物钟的负反馈：时钟基因的自动调节频率.科学类,263, 1578–1584. [公共医学][谷歌学者]
  • Arpaia G.、Loros，J.J.、Dunlap，J.C.、Morelli，G.和Macino，G.（1993）《光与生物钟的相互作用》。植物生理学。,102, 1299–1305.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ballario P.、Vittorioso P.，Magrelli A.、Talora C.、Cabibbo A.和Macino G.（1996年）白领-1，蓝光响应的中央调节器神经孢子菌属，是一种锌指蛋白。EMBO J。,15, 1650–1657.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ballario P.、Talora，C.、Galli，D.、Linden，H.和Macino，G.（1998年）PAS和LOV结构域的二聚化和蓝光光响应中的作用粗糙脉孢菌白领蛋白。摩尔微生物。,29, 719–729. [公共医学][谷歌学者]
  • Chang B.和Nakashima，H.（1997）明暗周期对粗糙脉孢菌.J.植物研究。,110, 449–453.[谷歌学者]
  • Cheng P.，Yang，Y.，Heintzen，C.和Liu，Y.（2001a）线圈结构域介导的FRQ–FRQ相互作用对于其在神经孢子菌属.EMBO J。,20, 101–108.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cheng P.，Yang，Y.和Liu，Y.（2001b）联锁反馈回路有助于提高神经孢子菌属生物钟。程序。美国国家科学院。科学。美国,98, 7408–7413.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cheng P.，Yang，Y.，Gardner，K.H.和Liu，Y.（2002）PAS结构域介导的WC-1/WC-2相互作用对于维持WC-1的稳态水平以及这两种蛋白质在小鼠昼夜节律时钟和光反应中的功能至关重要神经孢子菌属.分子细胞。生物。,22, 517–524.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Christie J.M.、Salomon，M.、Nozue，K.、Wada，M.和Briggs，W.R.（1999）蓝光感光体趋光素（nph1）的LOV（光、氧或电压）域：发色团黄素单核苷酸的结合位点。程序。美国国家科学院。科学。美国,96, 8779–8783.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Collett M.A.、Garceau，N.、Dunlap，J.C.和Loros，J.J.（2002）神经孢子菌属时钟基因频率由白领-2驱动，但不依赖于白领-2。遗传学,160, 149–158.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Corrochano L.M.，Lauter，F.R.，Ebbole，D.J.和Yanofsky，C.（1995）基因的光和发育调控con-10型属于粗糙脉孢菌.开发生物。,167, 190–200. [公共医学][谷歌学者]
  • Crosthwaite S.K.、Loros，J.J.和Dunlap，J.C.（1995）光诱导昼夜节律钟的重置是通过快速增加频率成绩单。单元格,81, 1003–1012. [公共医学][谷歌学者]
  • Crosthwaite S.K.、Dunlap，J.C.和Loros，J.J.（1997）神经孢子菌wc-1和wc-2型：转录、光反应和昼夜节律的起源。科学类,276, 763–769. [公共医学][谷歌学者]
  • De Fabo E.C.、Harding，R.W.和Shropshire，W.，Jr（1976）260至800纳米之间的作用光谱，用于光诱导类胡萝卜素生物合成粗糙脉孢菌.植物生理学。,57, 440–445.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Degli-Innocenti F.和Russo，V.E.（1984）白领的突变体粗糙脉孢菌并对其在蓝光诱导原鞘形成中的行为进行了研究。《细菌学杂志》。,159, 757–761.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Denault D.L.、Loros，J.J.和Dunlap，J.C.（2001）WC-2介导的WC-1–FRQ相互作用在神经孢子菌属.EMBO J。,20, 109–117.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dharmanada S.（1980）《生物钟的研究》粗糙脉孢菌：光诱导相移。加州大学圣克鲁斯分校博士论文。
  • Garceau N.Y.、Liu，Y.、Loros，J.J.和Dunlap，J.（1997）翻译和时间特异性磷酸化的替代启动产生多种形式的基本时钟蛋白频率。单元格,89, 469–476. [公共医学][谷歌学者]
  • Goerl M.、Merrow M.、Huttner B.、Johnson J.、Roenneberg T.和Brunner M.（2001）频率中的类PEST元素决定了粗糙脉孢菌.EMBO J。,20, 7074–7084.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Harding R.W.和Melles，S.（1984）粗糙脉孢菌鞘外喙使用白领和白化病患者突变体。植物生理学。,72, 996–1000.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Harding R.W.和Turner，R.V.（1981）类胡萝卜素生物合成途径的光调节白化病患者和白领的突变体粗糙脉孢菌.植物生理学。,68, 745–749.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Heintzen C.、Loros，J.J.和Dunlap，J.C.（2001）PAS蛋白VIVID定义了一个抑制光输入、调节门控和调节时钟重置的时钟相关反馈回路。单元格,104, 453–464. [公共医学][谷歌学者]
  • Iwasaki H.、Williams，S.B.、Kitayama，Y.、Ishiura，M.、Golden，S.S.和Kondo，T.（2000）一种KaiC-相互作用的感觉组氨酸激酶，SasA，是维持蓝藻强烈昼夜节律振荡所必需的。单元格,101, 223–233. [公共医学][谷歌学者]
  • Lakin-Thomas P.L.和Brody，S.（2000）《昼夜节律》粗糙脉孢菌：脂质缺乏使强健的节律恢复为零频率和白领突变体。程序。美国国家科学院。科学。美国,97, 256–261.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lauter F.-R.、Yamashiro，C.T.和Yanofsky，C.（1997）《光刺激在粗糙脉孢菌：野生型菌株和突变体的研究wc-1型,wc-2型和橡子-2.光化学杂志。光生物。B生物。,37, 203–211.[谷歌学者]
  • Lee K.，Loros，J.J.和Dunlap，J.C.（2000）神经孢子菌属昼夜节律系统。科学类,289, 107–110. [公共医学][谷歌学者]
  • Li C.和Schmidhauser，T.J.（1995）铝-1和铝-2，类胡萝卜素生物合成所必需的两种酶的结构基因神经孢子菌属.开发生物。,169, 90–95. [公共医学][谷歌学者]
  • Linden H.和Macino，G.（1997）白领2，蓝光信号转导中控制光调节基因表达的合作伙伴粗糙脉孢菌.EMBO J。,16, 98–109.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Linden H.，Ballario，P.，Arpaia，G.和Macino，G.（1999）《看到光明：新闻》神经孢子菌属蓝光信号转导。高级基因。,41, 35–54. [公共医学][谷歌学者]
  • Loros J.J.和Feldman，J.F.（1986）频率q-的9个突变粗糙脉孢菌.生物学杂志。节奏,1, 187–198. [公共医学][谷歌学者]
  • Loros J.J.、Richman，A.和Feldman，J.F.（1986）频率q轨迹粗糙脉孢菌.遗传学,114, 1095–1110.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Madi L.，Ebbole，D.J.，White，B.T.和Yanofsky，C.（1994）粗糙脉孢菌改变基因表达和分生孢子发育。程序。美国国家科学院。科学。美国,91, 6226–6230.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • McClung C.R.，Fox，B.A.和Dunlap，J.C.（1989）神经孢子菌属时钟基因频率与共享序列元素果蝇属时钟基因周期.自然,339, 558–562. [公共医学][谷歌学者]
  • Merrow M.，Brunner，M.和Roenneberg，T.（1999）神经孢子菌属时钟基因频率.自然,399, 584–586. [公共医学][谷歌学者]
  • Merrow M.、Franchi，L.、Dragovic，Z.、Görl，M.、Johnson，J.、Brunner，M.，Macino，G.和Roenneberg，T.（2001）粗糙脉孢菌.EMBO J。,20, 307–315.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nakashima H.和Fujimura，Y.（1982）粗糙脉孢菌高pH值的铵盐。植物,155, 431–436. [公共医学][谷歌学者]
  • Ninneman H.（1991）光刺激突变株的分生孢子粗糙脉孢菌.光化学杂志。光生物。B生物。,9, 189–199. [公共医学][谷歌学者]
  • Pittendrigh C.S.、Bruce V.G.、Rosensweig N.S.和Rubin M.L.（1959）粗糙脉孢菌.自然,184, 169–170.[谷歌学者]
  • Roenneberg T.和Merrow，M.（1998）分子昼夜节律振荡器——另一种假设。生物学杂志。节奏,13, 167–179. [公共医学][谷歌学者]
  • Roenneberg T.和Merrow，M.（2000）昼夜节律光输入：通过Romam ducunt的omnes.货币。生物。,10，R742–R745。[公共医学][谷歌学者]
  • Roenneberg T.和Taylor，W.（2000）生物发光的自动记录，特别是昼夜节律的分析。方法酶制剂。,305, 104–119. [公共医学][谷歌学者]
  • Russo V.E.（1988）蓝光诱导bd公司的突变体神经孢子菌属：双突变体bd公司,wc-1型和bd公司,wc-2型都是瞎子。光化学。光生物。,2, 59–65. [公共医学][谷歌学者]
  • Sachs M.S.和Yanofsky，C.（1991年）参与孢子萌发和氨基酸生物合成的基因的发育表达粗糙脉孢菌.开发生物。,148, 117–128. [公共医学][谷歌学者]
  • Sargent M.L.，Briggs，W.R.和Woodward，D.O.（1956）由无倒置应变表达的节律的昼夜性质粗糙脉孢菌.植物生理学。,41, 1343–1349.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Schwerdtfeger C.和Linden，H.（2001）蓝光适应和光信号转导的脱敏粗糙脉孢菌.摩尔微生物。,39, 1080–1087. [公共医学][谷歌学者]
  • Selker E.U.和Garrett，P.W.（1988）DNA序列复制触发了粗糙脉孢菌.程序。美国国家科学院。科学。美国,85, 6870–6874.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shrode L.B.、Lewis，Z.A.、White，L.D.、Bell-Pedersen，D.和Ebbole，D.J.（2001）虚拟虚拟现实分生孢子特异基因的光适应需要粗糙脉孢菌但不是昼夜节律。真菌遗传学。生物。,32, 169–181. [公共医学][谷歌学者]
  • Sokolove P.G.和Bushell，W.N.（1978）卡方周期图：用于分析昼夜节律。J.西奥。生物。,72, 131–160. [公共医学][谷歌学者]
  • Sokolovsky V.Y.、Lauter，F.-R.、Müller-Röber，B.、Ricci，M.、Schmidhauser，T.J.和Russo，V.E.A.（1992年）蓝光诱导基因的氮调节粗糙脉孢菌.《遗传学微生物学杂志》。,138, 2045–2049.[谷歌学者]
  • Somers D.E.、Devlin、P.F.和Kay，S.A.（1998年）拟南芥生物钟。科学类,282, 1488–1490. [公共医学][谷歌学者]
  • Sommer T.、Chambers，J.A.、Eberle，J.、Lauter，F.R.和Russo，V.E.（1989）粗糙脉孢菌.核酸研究。,17, 5713–5723.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Talora C.、Franchi，L.、Linden，H.、Ballario，P.和Macino，G.（1999）白领-1–白领-2复合物在蓝光信号转导中的作用。EMBO J。,18, 4961–4968.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Vogel H.J.（1964）赖氨酸途径在真菌中的分布：进化意义。美国国家。,98, 435–446.[谷歌学者]
  • West D.J.（1976）紫外线照射下孢子昼夜节律的相移。神经孢子菌新闻。,23, 17–18.[谷歌学者]
  • Yang Y.，Cheng，P.，Zhi，G.和Liu，Y.（2001）鉴定磷酸化钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶神经孢子菌属生物钟蛋白频率。生物学杂志。化学。,276, 41064–41072. [公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团