跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
EMBO J。2002年5月15日；21(10): 2496–2506.
数字对象标识：10.1093/emboj/21.10.2496
预防性维修识别码：PMC126000
PMID：12006501

四聚体Mad1–Mad2核心复合物的晶体结构：纺锤检查点“安全带”束缚机制的含义

露西娅·西罗尼,玛丽娜·马佩利,斯特凡·纳普,1 安娜·德安东尼,宽德贞,2和安德烈亚·穆萨乔三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

纺锤体检查点蛋白Mad1将Mad2招募到未附着的动粒，对Mad2–Cdc20复合物的形成至关重要体内但不是在体外Mad1–Mad2络合物的晶体结构显示出不对称四聚体，细长的Mad1单体从卷曲线圈分离，与Mad2形成两个相连的亚络合物。Mad2的C末端尾部是铰接的活动元件，像分子“安全带”一样包裹在细长的配体周围。我们证明了Mad1是Mad2–Cdc20复合体的竞争性抑制剂，并提出Mad1–Mad2复合体作为控制Cdc20结合Mad2释放的调节门。Mad1–Mad2在四聚体中高度稳定，但1:1的Mad1-Mad2复合物在有利的结合能驱动下缓慢释放Mad2用于Cdc20结合。因此，检查点激活期间Mad2与Cdc20结合的速率可能受到构象变化的调节，这些构象变化会破坏四聚体Mad1–Mad2组装的稳定性，从而促进Mad2的释放。我们还表明，解锁Mad2的C末端尾部是从Mad2释放配体所必需的，“安全带”机制可能会延长Mad2-配体复合物的寿命。

关键词：后期/Cdc20/Mad1/Mad2/有丝分裂纺锤体检查点

介绍

纺锤体组装检查点监测有丝分裂中姐妹染色单体的双向定向，并防止纺锤体受损时姐妹染色单体内聚力的丧失(哈德威克，1998年;沙阿和克利夫兰，2000年). Mad1、Mad2、Bub1、BubR1/Mad3和Bub3与前期和中期的动粒结合，以监测姐妹染色单体与纺锤体的附着(陈等., 1996,1998;Li和Benezra，1996年;Taylor和McKeon，1997年;泰勒等1998年). 这些蛋白质从酵母到后生动物都是保守的，这表明源于独立动粒的信号转导途径在所有真核生物中的功能和机制都是相似的。纺锤体检查点的目标是后发复合体（APC），这是一种多亚单位泛素连接酶，其活性最终决定了姐妹染色单体在中期-后期过渡期的内聚力损失(扎卡里亚和纳斯密斯，1999年). APC抑制需要Mad2与Cdc20直接相互作用，Cdc20是APC的正调控因子(锂等1997年;方等., 1998;黄星京等., 1998;卡利奥等., 1998;基姆等., 1998;Wassmann和Benezra，1998年). Mad2结合受损的Cdc20突变体在分裂酵母和芽殖酵母中Mad2或Mps1过度表达后，不会在中期停滞(黄星京等., 1998;基姆等., 1998). Mad2基因在哺乳动物中至关重要，一个Mad2等位基因的断裂导致染色体丢失率增加，检查点功能受损，并可能促进肿瘤发生，这一观察结果强调了Mad2的重要性(多布斯等., 2000;米歇尔等., 2001).

Mad2还与Mad1相互作用，Mad1是一种718残基卷曲线圈蛋白(Hardwick和Murray，1995年;Chen等人，1998年,1999;Jin等人，1998年). Cdc20和Mad1与Mad2的复合物是唯一的，在没有其他蛋白质的情况下发生在体外(Sironi等人，2001年;张和李，2001;Luo等人，2002年). 这些复合物之间的确切关系尚不清楚，但Mad2和Cdc20在缺乏Mad1的芽殖酵母菌株中无法相互作用，这表明两者之间存在功能联系(Hwang等人，1998年;Fraschini等人，2001年)通过观察，Mad1缺失严重影响哺乳动物细胞的纺锤体检查点(Luo等人，2002年). 因此，尽管Mad2可以在没有其他蛋白质的情况下与Cdc20有效相互作用在体外，将Mad2绑定到Mad1使这种交互成为可能体内动力学研究表明，Mad2在动粒处循环，周转迅速(豪厄尔等人，2000年,2001). 可以想象，Cdc20可能会在未附着的动粒处与Mad2结合并分离，以防止已经双向的姐妹染色单体上的凝聚力丧失。利用遗传和生物化学方法绘制了Mad1和Cdc20上的Mad2结合位点(Hwang等人，1998年;Jin等人，1998年;Kim等人，1998年;Luo等人，2000年;张和李，2001)最近研究表明，这些原本不相关的蛋白质共享一个～10-残基Mad2结合基序(Luo等人，2002年). 这表明Mad2通过竞争从一个配体转移到另一个配子。Mad2与包含Mad1和Cdc20结合位点的肽的结合促进了Mad2 C末端尾部类似的剧烈构象变化(Luo等人，2000年,2002)，增加了Mad1可能为Cdc20条目准备Mad2绑定站点的可能性，增加了此交互的速度(Luo等人，2002年).

我们测定了四聚体Mad1–Mad2核心复合物的晶体结构，并分析了其结构和生化特性，以了解该复合物如何有利于Mad2–Cdc20相互作用。我们发现Mad1是Cdc20的竞争性抑制剂，Mad1–Mad2复合物被设计用于减缓Mad2–Cdc20的形成速率。Mad2的C末端尾部锁定在Mad1配体中，释放Mad2可能需要其展开。我们一致表明，之前Mad2与Mad1的结合降低了Mad2–Cdc20相互作用的速率在体外相对于未绑定（apo）Mad2。Mad1结合位点埋藏在Mad1–Mad2四聚体的界面，未受干扰的Mad1-Mad2四聚体不会释放Mad2。然而，1:1复合体将允许从Mad1缓慢交换Mad2以进行Cdc20绑定。这些结果表明，Mad1–Mad2复合物中适当的构象变化可能允许Mad2为Cdc20结合而调节释放，我们的热力学研究表明这是一种有利的相互作用。

结果

结构确定

人Mad1的C末端区域（残基485–718，Mad1）之间的可溶性复合物485–718)和组氨酸标记的人类Mad2重量从细菌中提纯(西罗尼等., 2001). 该络合物在尺寸排除色谱（SEC）柱的单峰中洗脱，但进一步分析确定其含有超静态计量量的Mad2重量，可能是由于Mad2聚合(西罗尼等., 2001). 始终如一，疯狂1485–718–疯狂2重量多分散（未显示）且未结晶。Mad2型133A兰特是Mad2的一个点突变，用丙氨酸取代Arg133，有效结合Mad1和Cdc20(西罗尼等., 2001). 它与Mad1的相互作用是紧密的，导致单分散络合物（未显示）中没有在含有Mad2的络合物中观察到的过量Mad2重量(西罗尼等., 2001). 我们将由此产生的复合物称为Mad1–Mad2核心复合物。虽然我们无法确定Mad1485–718–疯狂2R133A合金（大型Mad1–Mad2核心复合体），包含Mad1（Mad1）较短片段的复合体485–584–疯狂2133A兰特：短的Mad1–Mad2核心复合物）产生可结晶的样品。在硒代亚砜衍生物上使用SIRAS方法以2.05Å的分辨率测定结构（表我)如材料和方法中所述。

表一。

结构确定
数据统计高分辨率本机低分辨率本机峰值1峰值2
水晶形状我二二二
设施和光束线欧洲战略参考框架ID14Elettra XRD1公司欧洲战略参考框架ID29Elettra XRD1公司
单元单元尺寸（Å）一= 111.0b条= 63.0c= 139.5一= 111.6b条= 63.0c= 261.5一= 111.7b条= 63.2c= 262.6一= 111.4b条= 62.9c= 262.2
 角度（°）β = 111.6β = 90.3β = 90.6β = 90.4
波长（Å）0.934010.97930.9809
决议（Å）25–2.0525–3.225–3.325–3.5
观测/独特反射368 557/113 010228 813/58 325169 263/54 062154 312/48 031
完整性（最后一个外壳）（%）99.2 (90.0)95.3（79.8）82.6 (62.2)95.2 (84.1)
R（右）sym（对称）一（最后一个外壳）（%）3.8 (34.1)6.3 (37.5)5.5 (8.3)4.5 (7.6)
我/σ我（最后一个外壳）18.2 (2.9)16.9 (2.9)13.4 (8.0)14.7 (8.3)
不对称装置中Mad1–Mad2的数量
4–4
8–8
8–8
8–8
精炼统计
蛋白质原子9237   
水分子711   
R（右）晶体b条（数据百分比）24.0 (95)   
R（右）自由的c（%）（数据的%）26.8（5）   
R.m.s.债券（Å）0.015   
R.m.s.角（°）1.88   

cR（右）自由的等于R（右）晶体但使用从细化中排除的不相交反射集进行计算。

Mad1–Mad2的总体视图核心复杂的

疯狂1–疯狂2核心是一种四聚体，包含每个亚单位（Mad2）的两个拷贝A类和Mad2B，图中为黄色1; 和Mad1A类和Mad1B). Mad1分子被拉长，并由一个涉及N端α1螺旋（青色）的平行卷曲线圈紧紧地结合在一起。Mad1链在螺旋线圈末端以相反的方向分开，并指向其Mad2配体，随后与另一螺旋段（α2，绿色）一起从中出现～20个残基。Mad1（深蓝色）的α1和α2螺旋之间的片段包含Mad2结合的关键残基。该片段的第一部分（“连接子”；残基531-539）很灵活，在Mad1中采用了不同的构象A类和Mad1B如α1螺旋的叠加所示（图1C） ●●●●。因此，Mad1–Mad2核心复合体显著不对称。第二部分（残基540–549）包含Mad2结合基序，它支持定义Mad1的基本相同的相互作用A类–疯狂2A类和Mad1B–疯狂2B亚复合物。两种Mad2单体中的C末端尾部（残基161–205）发生了类似于Mad2与Mad2结合肽1（MBP1）溶液结构中观察到的构象变化(罗等., 2002).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cdf234f1.jpg

图1。Mad1–Mad2复合体的结构。(A类和B)从正交方向看Mad1–Mad2四聚体的带状图。Mad2型A类和Mad2B（黄色）是复合物中的两个Mad2单体。Mad1链条（Mad1A类和Mad1B)通过N端线圈（青色）进行交互。深蓝色片段包含Mad2结合位点。在C末端区域（绿色）恢复螺旋构象。螺旋线圈的2倍对称性在连接处断裂，复合物是不对称的。(C类)Mad1的N末端区域的叠加A类和Mad1B显示了它们的结构差异。图表由Ribbons生成(卡森，1991年). (D类)Mad1的序列。编号是指全长人类（Hs）Mad1。添加N-末端蛋氨酸进行翻译。二级结构的赋值指分子Mad1A类在第一个四聚体中。黄色方框标签Mad1A类任何Mad2的4.5Å范围内的残留物A类原子。(E类)在螺旋界面残留物的球棒模型（暗红色）晶体中，Mad1的α2螺旋（α2′是不同四聚体中的等效螺旋）之间的反平行螺旋相互作用。(F类)对表达His-Mad2（通道1和7）、His-Mad 2–Mad1的细菌裂解物进行固定化金属亲和色谱（IMAC）下拉分析485–718和指示的突变体（2-5道），或His-Mad2-Mad1485–584和指示的突变体（第8–11道）。(G公司)显示Mad1–Mad2综合体预测总体结构的方案。文中引用的Hs Mad1位置如图所示。RLK是有助于Bub1–Bub3结合的序列基序。假定的α3螺旋和C末端结构域分别以浅绿色和灰色显示。

Paircoil服务器(伯杰等., 1995)建议在我们的结构中不包括Hs Mad1的N末端片段（残基1–484）的连续卷曲线圈。在这个区域中有一些重要的片段，可能需要将Mad1定位在动粒上(陈等., 1999). 预测还表明，在584残基附近短暂中断后（选择该残基结束我们的构建），一个具有较高线圈形成倾向的片段将恢复到630残基。Mad1α2螺旋的几何A类和Mad1B当它们从同源的Mad2配体中出现时，与平行螺旋的形成是不相容的。在晶体中，这些螺旋以反平行方向排列，在第二个四聚体中具有等效片段（α2′）（图1E） ●●●●。尽管这种相互作用很弱（因为Mad1485–584–Mad2仍然是溶液中的四聚体），这表明α2螺旋可以形成分子内反平行卷曲螺旋，推测α3螺旋位于残基590和630之间，连接环暂时适合残基579–589。

为了验证这一假设，我们引入了亲水性残基来代替参与晶体中观察到的α2–α2′界面稳定的疏水性残基（图1F） ●●●●。而Mad1的野生型（wt）序列485–718在细菌（第2道）中共表达后，His-Mad2从细菌裂解物中拖出，产生Mad1485–718突变体不能与Mad2相互作用（泳道3-5）。然而，当引入Mad1时，相同的突变完全沉默485–584（9-11车道）。如果突变的残基暴露在Mad1中的溶剂中，则可以解释这种显著差异485–584埋在Mad1485至718，因为在这种情况下，疏水到亲水取代预计会导致后者的结构失稳，而不是前者。这些结果以及表明可能存在α3段的结构预测表明，α2螺旋可能确实参与了与晶体中观察到的类似的分子内α2–α3反平行相互作用。假定的α3螺旋中的保守RLK（Arg-Leu-Lys）基序介导了芽殖酵母中Bub1–Bub3与Mad1–Mad2的结合（Hs-Mad1中的相应基序位于残基617–619），这种相互作用的突变消除可防止检查点激活而不损害Mad2结合(布雷迪和哈德威克，2000年). 图中的卡通1G显示Mad1可能由一个长的平行卷曲线圈组成，通向两个头部结构域，每个结构域包含一个Mad2结合位点，随后是一个反平行卷曲螺旋，以及一个C末端～90-残留区域（灰色），该区域以前被确定为消除检查点的突变靶点(Chen等人，1999年). 对有限蛋白水解的抵抗（未显示）表明Mad1的C末端结构域折叠成一个稳定结构域。我们认为我们的晶体结构揭示的2–2四聚体组装是功能性Mad1–Mad2物种体内.

“安全带”系紧机构

Mad1–Mad2复合物的结构证实了最近的发现，Mad1和Cdc20具有共同的Mad2结合基序(罗等., 2002). Mad2与核心复合物中两个Mad1基序的相互作用细节基本相同，结合促进了Mad2 C末端尾部的显著重组（残基161-205；图中的红色片段2A） 与Wagner及其合作者报告的apo-Mad2结构相比(罗等., 2000). Mad2的前160个残基在载脂蛋白或Mad1结合的Mad2中结构不变，但C末端区域（从β6–β7环开始，图中的“铰链环”2B和C）占据了这些结构中大型外露β-板的相对边缘。在复合体中，Mad2 C末端尾部穿过β-板的整个表面，并以类似于系紧的安全带的方式锁定Mad1。图中的表面表示清楚了这一点2C、 显示Mad1链如何通过Mad2“线程化”。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cdf234f2.jpg

图2。Mad2 C末端尾部的构象重排。(A类)报告的apo-Mad2功能区图Luo等人（2000）。Mad2的C端区域显示为红色(B)Mad1–Mad2复合物中C末端的构象发生变化。Mad1型A类–马达2A类显示了子复合体。Mad1型B和Mad2B为了提高清晰度而省略了，但进行了相同的重排。这是从“铰链环”开始的。在这两个结构中还重新排列了一个短的N末端片段。(C类)使用与（A和B）中相同颜色编码的Mad2分子表面，以及Mad1的蠕虫表示(Nicholls等人，1991年). 复杂的中断必须涉及Mad2 C端子尾部的打开。(D类)Mad2与Mad1的大多数触点（定义和颜色编码如图所示1)映射到Mad2的C端子段（Mad2触点A类显示）。Hs（小时）：智人; 克朗：非洲爪蟾; 科学：酿酒酵母图中还显示了.Hs Mad2B/Rev7。描述了apo-Mad2（apo）和Mad1-bound Mad2的二级结构。编号指Hs Mad2。虚线表示电子密度图中不可见的区域。N端多组氨酸标记被省略，因为它在电子密度图中不可见。

最近报道了Mad2结合基序与MBP1肽的结构比对，MBP1与Mad2的溶液结构(罗等., 2002)，如图所示三答：我们注意到APC激活物CDH1（Mad2B/Rev7的靶点）中的基序保守程度较低(陈和芳，2001;普弗勒（Pfleger）等., 2001). Mad2结合基序中的点突变消除了芽殖酵母中Mad2–Cdc20的相互作用和纺锤体检查点(黄星京等., 1998;基姆等., 1998). 为了测试Mad1中的类似突变是否影响Mad2结合，将残基Lys541、Leu543、Met545或Pro549突变为丙氨酸，以及野生型和突变型Mad1的数量485–718对固定化His-Mad2的共纯化进行了评价。Lys541（未显示）和Pro549的突变完全废除了结合，而其他两个突变体表现出部分但显著的结合降低（图三B） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cdf234f3.jpg

图3。Mad2与Mad2结合基序的相互作用。(A类)Mad1、Cdc20和MBP1中的Mad2结合基序。深度：黑腹果蝇，其他缩写如图所示2。该基序也存在于CDH1中，包含潜在的CDK或MAPK靶位点（斜体）。红色方框表示影响我们研究中分析的Cdc20–Mad2和星号Mad1突变的突变位点。(B)His-Mad2–疯狂1485至718和指示的突变体在细菌中共同表达，IMAC纯化，并通过SDS-PAGE进行分析。车道1，分子量标记；通道2-6，指示表达测试的细菌总裂解物，显示总蛋白生成；通道7–11，IMAC纯化样品。(C类)Mad1和MBP1绑定到Mad2的比较。Mad1–Mad2显示为图中的颜色方案2B.为了提高可读性，删除了大多数结构元素，只显示了主链原子。还显示了MBP1（浅灰色）和Mad2（深灰色）的等效区域。氢键显示为虚线。对主链氢键中涉及的配体和Mad2残基进行了标记。

Mad2复合物与MBP1肽的比较(罗等., 2002)并且与Mad1确定了实质性的相似之处，但也存在重要的差异（图三C） ●●●●。除了与Mad2形成许多范德华和极性接触外，这两种配体还通过在Mad1暴露的β-片末端添加一条（反平行）β-链来结合，这种结合机制被定义为β-增强(哈里森，1996年). 然而，与Mad1相比，MBP1肽采用了更为延伸和放松的构象。构造线形表明，MBP1的Ser1（S1）和Pro8（P8）与Mad1的Lys541（K541）和Pro549（P549）占据的位置基本相同。因此，必须在Mad2结合位点内容纳九个Mad1残基，而不是MBP1中的八个。Mad1链在残留物545-548周围凸出，推动Mad2铰链环（图三C） ●●●●。因此，Mad1链与Mad2的β6链和Mad2铰链环的一段之间的反平行配对是不完美的，并且相对于Mad2–MBP1复合体，限制为较少数量的链间氢键（图三C） ●●●●。这可能至少部分解释了为什么Mad1和Cdc20合成肽序列相似，赖氨酸和脯氨酸残基间距相同（人类Mad1中的K541和P549），其Mad2配体明显弱于MBP1肽(罗等., 2002). 噬菌体展示策略罗等. (2002)与Mad1和Cdc20中的序列不同的已识别序列（如MBP1）可能表明Mad2与Mad2和Cdc20-Mad2结合基序的相互作用被设计为次优。

然而，需要注意的是，Mad1–Mad2相互作用通过四聚体中的一些额外接触而稳定，其中一些接触涉及Mad2结合基序保守部分上游的Mad1连接区。由于连接子区域不对称，这两个子复合物中的接触不同（图​（图4A4A和B）。Mad1型A类残基527–539参与了与Mad2的一些额外相互作用A类（图4A、 左），这在Mad1中未观察到B–疯狂2B亚复合物（图4A、 右侧）。疯子1B然而，接头（残基530–538）通过紧密地紧贴Mad1来补偿较少的接触A类–疯狂2A类界面如图所示4B.尽管复合物的不对称性质（其起源尚不清楚，但似乎依赖于连接体的灵活性），Mad2的两个配体结合位点A类和Mad2B深埋在四聚体中Mad1–Mad2亚复合物之间的界面处（图4C和D）。如下所示，该组织显著提高了Mad1–Mad2复合体的稳定性。我们预测，从四聚体复合体中释放Mad2意味着结构开放以暴露Mad2的C末端尾部。这可能发生在由络合物不对称性决定的优先“断裂”线上。因此，尽管我们在这里没有证明核心复合物的不对称性在功能上很重要，但我们倾向于这个假设。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cdf234f4.jpg

图4。Mad1–Mad2四聚体的组织。(A类)Mad1中的联系人A类–疯狂2A类（左）和Mad1B–疯狂2B（右）。Mad1型B残留540–554与Mad2形成基本相同的接触B、和被省略。Mad1的链接器区域B与Mad2的联系很少B与Mad1相比A类–疯狂2A类.使用LIGPLOT创建的图形(华莱士等., 1995). (B)Mad1的连接区（深灰色）B（浅灰色）接触由Mad1残留物组成的复合表面A类和Mad2A类（着色方案如图所示1和​和2）。2). 为了保持清晰，只有Mad1A类和Mad2A类与Mad1形成氢键的残基B显示了，但也存在一些范德瓦尔斯触点。该视图与图中所采用的视图类似2和Mad2B为了清楚起见，省略了。(C类和D类)四聚体中Mad2的分子表面如图所示着色2（Mad2的C端区域B用深红色将其与Mad2的等效区域区分开来A类). （D）中的视图与图中的视图类似1A、 而在（C）中，从顶部观察分子。Mad2的C末端区域A类和Mad2B（显示铰链环）位于Mad1–Mad2子复合物之间的界面。

对Mad2交换反应的见解

Mad1和Cdc20共享一个保守的Mad2结合基序的发现表明，将Mad2带到Cdc20上的Mad1依赖反应是通过直接竞争机制发生的。该结构表明，未事先解锁C端子尾部，Mad1无法释放。Mad2残基Val181、Leu183、Phe186、Ile190、Val193、Val197和Tyr199堆积在Mad2疏水核上，稳定闭合构象。其中两个残基（Val197和Tyr199）和另两个直接参与与Mad1相互作用的残基（Met196和Ala198）属于C末端10-残基片段，其缺失（Mad2ΔC)废除Mad1和Cdc20与Mad2的结合(罗等., 2000;西罗尼等., 2001). 在apo-Mad2中，这些残基在溶液中无序，不需要进行结构稳定（图2D类；罗等., 2000). 这可能解释了为什么Mad2ΔC结构稳定，但配体识别受损(罗等., 2000;西罗尼等., 2001). 如预期的，由于存在类似的Mad2结合位点，Mad2的C末端尾部可能在Mad1和Cdc20复合物中采用类似的构象(罗等., 2002). 除非尾部开放发生在快速的时间尺度上，否则从Mad1–Mad2到Cdc20–Mad1复合体的转变将受到尾部开放动力学的限制，与Mad2对Cdc20和Mad1的相对亲和力无关。由于两个Mad1–Mad2结合位点被埋藏，因此四聚体复合体中的Cdc20可能无法访问它们（图4). 这些考虑提出了一个问题，即假定的交换反应是否会自发地将Mad2从Mad1转移到Cdc20。为了回答这个问题，我们设计了一组实验来剖析以下因素对结合机制的贡献：（i）Mad2对Mad1和Cdc20结合基序的相对偏好，（ii）Mad2C末端尾对Mad2的锁定，以及（iii）Mad1-Mad2相互作用的稳定，因为它可能发生在四聚体中。

首先，我们使用等温滴定量热法（ITC；表二). 这些研究中使用的Mad1序列不太可能支持自齐聚反应，因为它缺少线圈区域。还表明，Mad2与Cdc20和Mad1肽的相互作用产生简单的1:1络合物(Sironi等人，2001年； Luo等人，2002年). 因此，我们的热力学研究可能测量到Mad2与其配体之间的1:1相互作用。我们将这些相互作用称为“单价”，以将其与Mad1–Mad2四聚体中发生的相互作用区分开来，后者更紧密（见上文和下文）。如表所示二，Mad2以10倍的高亲和力结合Cdc20基序(K（K）D类=100 nM）比Mad1图案(K（K）D类=1.0µM）。我们还评估了Mad2中的R133A取代是否对配体结合有任何影响。表二显示Mad2重量和单体Mad2133A兰特以基本相同的亲和力结合其Mad1和Cdc20配体，证实R133A突变的非侵入性。虽然无法从结构上解释为什么Mad2比Mad1更紧密地结合Cdc20肽，但量热测定表明，如果Mad1–Mad2没有进一步稳定化，则Mad2从单价Mad1-Mad2络合物交换到Cdc20是一种受欢迎的反应。

表二。

Mad2与Mad1和Cdc20相互作用的热力学参数
互动K（K）B（10）6M（M）–1)K（K）D类(10–6M）ΔH光突发事件（千卡/摩尔）TΔS（千卡/摩尔）ΔG光突发事件（千卡/摩尔）N个
Mad1和Mad2重量0.961.04–13.1–4.9–8.20.95
Mad1+Mad2133A兰特20.5–14.4–5.8–8.61.15
Cdc20+Mad2重量9.40.1–13.9–4.4–9.50.90
Cdc20+Mad2133A兰特9.20.1–16.0–6.6–9.40.96

Mad1和Cdc20是与人类Mad1相对应的合成肽523–550和Cdc20111–138.K（K）B，结合常数；K（K）D类，离解常数；ΔH光突发事件，观察到的结合焓；ΔS，熵；ΔG光突发事件观察到吉布斯自由能；N个，结合化学计量。

配体释放可能需要Mad2 C-末端的初步去折叠，闭合构象有望延迟Mad2-配体复合物的破坏。为了测试这一点，我们研究了Cdc20合成肽与单价Mad1–Mad2复合物竞争的能力是否对C末端尾部的初始状态（锁定或解锁）敏感。我们考虑了apo-Mad2（图2A） 作为解锁状态的代表，而锁定状态由已经绑定到Mad1的Mad2样本表示。实验的图形表示如图右侧所示5A.GST–Mad1523–550固相固定化后直接与重组apo-Mad2混合R133A合金（Mad2未锁定）存在不同浓度的Cdc20肽，或与apo-Mad2预孵育60分钟133A兰特允许复合物形成（Mad2锁定），然后与Cdc20孵育。两个样品的竞争反应都延长了15或300分钟，最后通过离心分离结合蛋白，清洗并用SDS-PAGE检测（图5，左侧面板）。在没有预培养的情况下，在15或300分钟后，模式是相同的（比较两种凝胶中的8-11通道），表明竞争反应在15分钟的时间范围内达到平衡。GST预孵育–Mad1523–550然而，使用Mad2后，Cdc20肽在15分钟的时间范围内竞争Mad1-bounded Mad2的能力显著降低，即使在孵育60分钟后，我们也检测到预培养和非预培养样品中存在显著差异（数据未显示）。在300分钟的孵育后（左下面板），这些差异完全消除，表明这段时间足以平衡竞争反应。即使在15分钟后，在没有竞争性肽（比较通道4和8）的情况下，在预培养和非预培养样品中也观察到类似的Mad2结合水平，表明这段时间足以使Mad2与Mad1结合。15分钟时，Mad1中预先孵育的Mad2的释放也取决于竞争肽的浓度，这表明除了尾部开放外，结合配体的释放也限制了交换反应。因此，即使这是一个相当缓慢的反应，Mad1–Mad2交互的关闭速率也必须比Cdc20–Mad1交互的打开速率慢得多就其本身而言(Sironi等人，2001年;Luo等人，2002年). 结果还表明，Cdc20和Mad1分别是其与Mad2复合物的竞争性抑制剂，并表明C末端尾部的构象变化旨在减缓结合配体的释放。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cdf234f5.jpg

图5。假设交换机制分析。(A类)增加浓度的Cdc20合成肽与Mad2孵育，Mad2之前曾或未与固相结合GST–Mad1孵育523–550在预培养实验中，允许复合物形成60分钟，然后添加竞争性肽。如果不允许预孵育，则同时混合三种成分并孵育15或300分钟。右侧显示了图示。孵育后，通过离心收集珠子和结合蛋白，并通过SDS-PAGE进行清洗和分析。分子量标记，输入GST–Mad1523–550和Mad2显示在车道1-3上。(B)独立Mad1–Mad2、Mad2的叠加SEC配置文件133A兰特和Cdc20111–150合成肽。通过SEC，蛋白质/肽呈单峰运行。SDS-PAGE也显示了收集部分的分离。从1.2至2.1 ml中收集了9个100µl组分（1–9）。(C类)当疯狂2133A兰特与5倍过量的Cdc20一起孵育111–150并由SEC分隔，形成Mad2–Cdc20复合形式[比较（B）和（C）中的车道4–5]。(D类)当Mad1–Mad2复合物与Cdc20孵化时111–150，未观察到绑定。此外，由于未检测到Mad2–Cdc20复合物或游离Mad1，该肽无法破坏该复合物。

竞争实验是用单价Mad1片段进行的。为了确定四聚体中Mad1–Mad2相互作用是否进一步稳定，我们询问Cdc20肽是否能够从Mad1-Mad2释放Mad2核心.我们孵化了短线Mad1–Mad2核心（最终浓度为～200µM），1 mM浓度的合成肽含有Cdc20的Mad2结合位点，在可变培养时间后，通过尺寸排除色谱法（SEC）最终解析所得物种。在控制实验中，短Mad1–Mad2核心，疯狂2133A兰特Cdc20肽从SEC柱上洗脱为单峰，如图中所示5B.回收Mad2峰中的Cdc20肽（图5C、 通道4–6）表明可以使用此方法轻松检测Mad2–Cdc20复合体。即使在16小时孵育后，Cdc20肽也不会与Mad1–Mad2结合，也不会破坏这个复合物，正如Mad2–Cdc20或游离Mad1的出现所揭示的那样（图5D） ●●●●。长Mad1–Mad2的类似实验核心给出了相同的结果，与Cdc20孵育后复合物没有关联或破坏(西罗尼等., 2001). 使用截断形式的Cdc20不太可能导致交换缺乏，因为含有Mad2结合位点的Cdc2片段比全长Cdc20更紧密的Mad2配体(唐等., 2001;张和李，2001). 这表明短Mad1–Mad2核心复合物非常紧密，与较大的对应物无法区分，并证实了基于结构的预测，即四聚体Mad1-Mad2比单价复合物更稳定。

讨论

Mad1通过β增强与Mad2相互作用，这是蛋白质-蛋白质复合物中的一种常见结合机制。Mad1–Mad2的非典型特征是Mad2 C末端尾部在Mad1配体上的重新折叠，这让人想起系好的安全带。我们不知道其他蛋白质中有类似的结合机制。Mad2–Cdc20复合体的组织结构与Mad1–Mad2类似，具有一个细长的Cdc20片段（残基123–137）“穿过”Mad2 C末端尾部。

这项研究的重要结论是：（i）单价Mad1是Mad2–Cdc20复合物的弱竞争性抑制剂，（ii）Mad2 C-末端尾部的构象为Mad2从其配体复合物中释放引入了动力学屏障，这是其所需的去折叠的结果，以及（iii）Mad1–Mad2复合物的四聚体组装加强了相互作用，阻止了Mad2的释放。正如对竞争性抑制剂的预期，Mad1反对Mad2与Cdc20结合（图5). Mad1对于建立Mad2–Cdc20复合体至关重要体内(Hwang等人，1998年;Fraschini等人，2001年)发现它是Mad2–Cdc20的竞争性抑制剂是违反直觉的。了解Cdc20和Mad2无法交互的原因体内在没有Mad1的情况下，尽管它们已被证明是直接配体在体外，现在是一个非常紧迫的问题。Mad2与全长Cdc20结合不良，表明结合位点在全长蛋白中被屏蔽(Tang等人，2001;Zhang和Lees，2001年). 激活的Mad1–Mad2复合物可能有助于Cdc20暴露其Mad2结合位点。此外，Cdc20与细胞伴侣相关，这可能限制其与Mad2相互作用的能力体内(Ho等人，2002年;松树，2002). 拓扑考虑对于限制Mad2–Cdc20交互也很重要。Mad1将Mad2招募到kinetochores，Mad2–Cdc20交互预计将在这里进行(Chen等人，1998年;Luo等人，2002年). 然而，尚不清楚为什么Cdc20以Mad1独立的方式定位于动粒(沙阿和克利夫兰，2000年;Sironi等人，2001年;Luo等人，2002年)，在直接招募Mad2到这些结构中是无效的。Mad2和Cdc20的浓度可能不足以驱动复杂的形成，而Mad1可能能够通过高亲和力结合位点将Mad2招募到动粒。随后，外部能量输入可能会破坏Mad1–Mad2复合物的稳定性，使Mad2在足够高的局部浓度下释放，以支持与Cdc20的相互作用（图6). 我们认为，如果通过Mad1漏斗是Mad2有效到达Cdc20的唯一途径，那么Mad1作为Mad2–Cdc20复合体的媒人的作用，尽管它是这种相互作用的竞争抑制剂，但可以解释这一作用体内.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为cdf234f6.jpg

图6。主轴检查点中Mad1–Mad2功能的模型。(A类)未受干扰的Mad1–Mad2不会与Cdc20交换Mad2。我们的Mad1–Mad2结构可能与这个不改变的、高亲和力的Mad1-Mad2复合物有关。(B)主轴检查点的扰动会降低Mad2与Mad1的亲和力。单价Mad1–Mad2相互作用亲和力低，表明如果Mad1-Mad2头部因相互旋转而独立，亲和力可能会降低。Cdc20现在与Mad1竞争Mad2绑定。Mad2是如何重新加载到复合物上的尚不清楚，但有理由认为，生成了一个新的Mad2结合位点，以高亲和力捕获Mad2。(C类)这个高亲和力位点将恢复未受干扰的复合体，并且这个循环可能会继续，直到附着和/或张力减弱检查点信号，阻止Mad2进一步释放到Cdc20。

先前的研究表明，在细胞周期中存在一种未受干扰的、稳定的Mad1–Mad2复合物(Shah和Cleveland，2000年). 如上所述，纺锤体检查点可能会破坏该复合物在动粒的稳定性，以促进Mad2向Cdc20的转移，以及随后从细胞质池中招募新的Mad2（图6). 微管连接可能恢复Mad1–Mad2的非活性形式，阻止Mad2进一步分配到APC抑制复合物中，最终抑制检查点信号。由于孤立单价Mad1–Mad2相互作用的亲和力显著低于四聚体中发生的亲和力，因此Mad1-Mad2的转化核心构象改变可能会破坏四聚体组装中观察到的球状头部的相互作用，并导致Mad2配体结合位点暴露在配体交换中，从而促进分离形式。在Mad2释放后，高亲和力结合位点的再生可能募集新的Mad2，以恢复高亲和力未受干扰的Mad1–Mad2核心复合物。这个循环可能会一直持续到检查点被激活，并由代谢能量维持。检查点激活期间，Mad2在动粒细胞的高周转率可能反映了这个反应的动力学(豪厄尔等人，2000年,2001). 积极的监管者有望在假定的交换反应中发挥重要作用。Bub1–Bub3复合物在Mad2结合位点附近结合Mad1–Mad2的建议进一步证实了该激酶磷酸化Mad1在体外(Seeley等人，1999年)作为Mad1–Mad2的潜在监管机构。交换反应中的其他参与者可能是BubR1–Bub3复合物，它与Cdc20结合，并可能进入同样含有Mad2的四元复合物(Fraschini等人，2001年;Sudakin等人，2001年;Tang等人，2001)和Mps1激酶，磷酸化芽殖酵母中的Mad1(Hardwick等人，1996年). 我们的工作表明，在配体从Mad2释放之前，C末端锁必须打开。这一观察排除了Mad1支持Mad2通过稳定带有重组C末端尾部的预先形成的模板来结合Cdc20的提议(Luo等人，2002年). 一旦Mad2–Cdc20复合体在激活的动粒上形成，“安全带”捆绑机制可能有助于延迟其破坏。尽管在缺乏激活的检查点的情况下需要低结合亲和力来防止显著的直接结合，但该机制可能允许在动粒处生成运动稳定的Mad2–Cdc20复合物。

安在体外针对Mad2从可溶池流向Mad1然后流向Cdc20的机制的方法必须处理这样一个事实，即Mad2和Cdc20可检测浓度的简单混合在体外将导致直接绑定。然而，Mad2通过Mad1流入Cdc20的假设提出了几个可测试的含义体内。当检查点激活时，Mad1–Mad2复合体中Mad2的释放速率必须增加，而当检查点启动时，需要较高的结合速率才能在动粒处补充Mad2。应该可以确定Mad1、Mad2或其他纺锤体检查点蛋白中的突变，这些突变不影响Mad2与Mad1的相互作用，而是影响从该复合物中释放Mad2以结合Cdc20。上述描述了Mad1中这种“交换变种”的可能候选基因(布雷迪和哈德威克，2000年). 此外，由于Cdc20是Mad2的最终受体，Mad2在动粒的动态行为应该受到Cdc20缺失的影响。测量细胞周期不同阶段的Mad1、Mad2和Cdc20动力学，并采用适当的突变策略，可以用来测试这个假设。

材料和方法

结构确定

Mad1–Mad2基本上按照描述生成和纯化(西罗尼等., 2001). 将蛋白质浓缩至7.5 mg/ml，并在20°C下，在含有100 mM硫酸铵、100 mM柠檬酸钠（pH 5.2）和10 mM二硫苏糖醇的储液罐中通过悬滴技术结晶。该络合物的硒代蛋氨酸（SeMet）衍生物在类似条件下结晶。X射线衍射数据（表我)在低温下，在含有35–40%甘油的低温缓冲液中收集，并用Denzo-Scalepack进行处理(Otwinowski，1993年). 虽然在自然条件下确定了两种相关的单斜晶型（表我)，我们无法识别强衍射晶型I的SeMet衍生物，并且使用晶型II找到了相位问题的初始解决方案。用SnB程序鉴定了不对称单元（AU）中56个硒原子的子集(威克斯和米勒，1999年)来自两个独立收集的峰值数据集中的异常差异。使用MLPHARE进行相位细化(协作计算项目，1994年)针对峰值数据集的异常差异以及它们与晶体形态II的低分辨率本地数据集的同构差异进行了研究。CNS中的溶剂翻转后(布伦格尔等., 1998)，图谱显示了清晰的溶剂边界和清晰的蛋白质特征。apo-Mad2模型(罗等., 2000)初步拟合了电子密度，这使得鉴定属于同一Mad1–Mad2络合物的重原子簇子集成为可能。这最终导致了对AU中八个Mad2单体相关的非晶体学对称（NCS）算符的识别。由此得到的密度修正3.3Å图质量极佳，可以毫不含糊地拟合Mad2单一体。该模型用于通过AMoRe分子替换找到Mad2单体在晶型I中的位置(协作计算项目，1994年). 四种Mad2单体中只发现了三种。在Molrep模式下，使用程序ARP/wARP识别Mad1分子和第四个Mad2单体（其平均B因子明显高于其他Mad2模型）(佩拉基斯等., 2001). 使用程序O进行模型构建(琼斯等., 1991). 需要使用CNS进行几轮精炼和手动重建，以生成最终模型，该模型包含四个Mad2单体的残基10-203，第一个四聚体中Mad1A和Mad1B的残基493-579，第二个四聚物中Mad1A和Mad1的残基487-579和485-584（表我). 90.6%和9.4%的残留物分别位于Ramachandran地块的最有利和额外允许区域内，不允许区域内没有残留物。

Mad2结合参数的测定

用按说明纯化的蛋白质样品进行热量测定(西罗尼等., 2001)和与人类Cdc20相对应的合成肽111–138和Mad1523–550使用VP-ITC滴定量热计（MicroCal Inc.）在25°C下测定。每次滴定实验包括首次注射2µl，然后注射29次8µl。通过减去空白滴定值校正稀释热的结合等温线，并使用仪器提供的Origin软件包进行评估。

体外结合和竞争分析

对于图中所示的实验1和​和3，三将含有His-Mad2或与Mad1及其突变体共同表达的His-Mad 2的细菌裂解物与Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）孵育。通过离心收集结合蛋白，洗涤并通过SDS–PAGE进行分析。IMAC纯化后观察到的蛋白质水平反映出His-Mad2在多顺反子载体中的表达水平高于Mad1(西罗尼等., 2001). 对于图中的分析5A、 将含有人类Cdc20残基111–138的合成肽以0、6、30和120µM的浓度（分别为8–11道）添加到固相结合的GST–Mad1中523–550（2µM；泳道1），之前与6µM Mad2（泳道2）在4°C下在不存在Cdc20肽的情况下孵育1小时。未进行预培养的实验使用与预培养实验中相同浓度的试剂进行，但竞争性Cdc20肽（3–6道；与8–11道中的浓度相同）被添加到固相结合的GST–Mad1中523–550添加Mad2之前。混合三种试剂后，两种反应在室温（RT）下延长指定时间。将珠离心、洗涤并通过SDS-PAGE分析结合蛋白。对于图形的实验​图5B–D，5B–D，短Mad1–Mad2核心复合体，Mad2133A兰特(西罗尼等., 2001)和Cdc20111–150合成肽在SMART系统（Amersham-Pharmacia）的Superdex200柱上进行分析。评估短Mad1–Mad2核心复合物或Mad2的肽结合133A兰特将这些物种混合，在RT下培养不同时间，最后在同一色谱柱上分离。

加入号码

Mad1–Mad2的坐标可从蛋白质数据库获得（ID代码1GO4）。

致谢

感谢凯文·哈德威克（Kevin Hardwick）、克里斯蒂安·赫林（Kristian Helin）、詹·迈克尔·彼得斯（Jan-Michael Peters）、西蒙内塔·皮亚蒂（Simonetta Piatti）和穆萨乔（Musacchio）小组成员对手稿的批判性阅读和讨论，感谢余洪涛（Hongtao Yu）分享Mad2–MBP1的。还要感谢安迪·汤普森（Andy Thompson）和埃德·米切尔（Ed Mitchell）（欧洲同步辐射设施）以及马西莫·德加诺（Massimo Degano）和阿尔伯托·卡塞塔（阿尔贝托·卡西塔（辛克洛通·的里雅斯特）在数据收集方面的支持。A.M.是EMBO青年研究员，也是意大利癌症研究基金会的学者。这项工作得到了意大利癌症研究协会（Italian Association for Cancer Research）对a.M.的资助。我们也要感谢哈佛大学高级科学研究基金会Giovanni Armenise的慷慨支持。

工具书类

  • Berger B.、Wilson，D.B.、Wolf，E.、Tonchev，T.、Milla，M.和Kim，P.S.（1995）利用成对残差相关性预测螺旋线圈。程序。美国国家科学院。科学。美国,92, 8259–8263.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brady D.M.和Hardwick，K.G.（2000）Mad1p、Bub1p和Bub3p之间的复杂构造对主轴检查点功能至关重要。货币。生物。,10, 675–678. [公共医学][谷歌学者]
  • 布伦格A.T。等（1998）结晶与核磁共振系统：一种新的大分子结构测定软件套件。《水晶学报》。D类,54, 905–921. [公共医学][谷歌学者]
  • Carson M.（1991）《缎带2.0》。J.应用。结晶器。,24, 958–961.[谷歌学者]
  • Chen J.和Fang，G.（2001）MAD2B是后接复合体的抑制剂。基因发育。,15, 1765–1770.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen R.H.，Waters，J.C.，Salmon，E.D.和Murray，A.W.（1996）具有未连接的动粒的纺锤体组装检查点组件XMAD2的协会。科学类,274, 242–246. [公共医学][谷歌学者]
  • Chen R.H.、Shevchenko，A.、Mann，M.和Murray，A.W.（1998）纺锤检查点蛋白Xmad1将Xmad2招募到未附着的动粒细胞。《细胞生物学杂志》。,143, 283–295.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen R.H.、Brady，D.M.、Smith，D.、Murray，A.W.和Hardwick，K.G.（1999）芽变酵母的纺锤体检查点取决于Mad1和Mad2蛋白质之间的紧密复合物。分子生物学。单元格,10，2607–2618页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 合作计算项目，第4期（1994）CCP4套件：蛋白质结晶学程序。《水晶学报》。D类,50, 760–763. [公共医学][谷歌学者]
  • Dobles M.、Liberal，V.、Scott，M.L.、Benezra，R.和Sorger，P.K.（2000）缺乏有丝分裂检查点蛋白Mad2的小鼠的染色体错位和凋亡。单元格,101, 635–645. [公共医学][谷歌学者]
  • Fang G.，Yu，H.和Kirschner，M.W.（1998）CDC20蛋白家族成员的直接结合激活了有丝分裂和G1.摩尔细胞,2, 163–171. [公共医学][谷歌学者]
  • Fraschini R.、Beretta，A.、Sironi，L.、Musaccchio，A.、Lucchini，G.和Piatti，S.（2001）Bub3与Mad2、Mad3和Cdc20的相互作用是由WD40重复介导的，不需要完整的动粒。EMBO J。,20, 6648–6659.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hardwick K.G.（1998）主轴检查点。趋势Genet。,14, 1–4. [公共医学][谷歌学者]
  • Hardwick K.G.和Murray，A.W.（1995）Mad1p，芽殖酵母中纺锤组装检查点的磷酸蛋白成分。《细胞生物学杂志》。,131, 709–720.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hardwick K.G.、Weiss，E.、Luca，F.C.、Winey，M.和Murray，A.W.（1996）在无有丝分裂纺锤体破坏的情况下激活芽殖酵母纺锤体组装检查点。科学类,273, 953–956. [公共医学][谷歌学者]
  • Harrison S.C.（1996）肽-表面结合：PDZ和PTB结构域的情况。单元格,86, 341–343. [公共医学][谷歌学者]
  • 何毅（Ho Y.）。等.（2002）蛋白质复合物的系统鉴定酿酒酵母通过质谱分析。自然,415, 180–183. [公共医学][谷歌学者]
  • Howell B.J.、Hoffman，D.B.、Fang，G.、Murray，A.W.和Salmon，E.D.（2000）活细胞中动粒、纺锤体纤维和纺锤体极的Mad2动力学可视化。《细胞生物学杂志》。,150, 1233–1250.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Howell B.J.、McEwen，B.F.、Canman，J.C.、Hoffman，D.B.、Farrar，E.M.、Rieder，C.L.和Salmon，E.D.（2001）细胞质动力蛋白/动力蛋白驱动动粒蛋白运输到纺锤体两极，并在有丝分裂纺锤体检查点失活中发挥作用。《细胞生物学杂志》。,155, 1159–1172.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hwang L.H.，Lau，L.F.，Smith，D.L.，Mistrot，C.A.，Hardwick，K.G.，Hwang，E.S.，Amon，A.和Murray，A.W.（1998）芽孢酵母Cdc20：纺锤检查点的目标。科学类,279, 1041–1044. [公共医学][谷歌学者]
  • Jin D.Y.，Spencer，F.和Jeang，K.T.（1998）人类T细胞白血病病毒1型癌蛋白Tax靶向人类有丝分裂检查点蛋白MAD1。单元格,93, 81–91. [公共医学][谷歌学者]
  • Jones T.A.、Zou，J.-Y.和Cowan，S.W.（1991）在电子密度图中构建蛋白质模型的改进方法以及这些模型中的错误位置。《水晶学报》。A类,47, 110–119. [公共医学][谷歌学者]
  • Kallio M.、Weinstein，J.、Daum，J.R.、Burke，D.J.和Gorbsky，G.J.（1998）哺乳动物p55CDC介导纺锤体检查点蛋白Mad2与环体/后发性复合体的关联，并参与调节后期发病和晚期有丝分裂事件。《细胞生物学杂志》。,141, 1393–1406.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim S.H.，Lin，D.P.，Matsumoto，S.，Kitazono，A.和Matsumomo，T.（1998）裂变酵母Slp1：Mad2依赖性纺锤体检查点的效应器。科学类,279，1045–1047。[公共医学][谷歌学者]
  • Li Y.和Benezra，R.（1996）人类有丝分裂检查点基因的鉴定：hsMAD2型.科学类,274, 246–248. [公共医学][谷歌学者]
  • Li Y.，Gorbea，C.，Mahaffey，D.，Rechsteiner，M.和Benezra，R.（1997年）MAD2与环体/回指复合体相关并抑制其活性。程序。美国国家科学院。科学。美国,94，12431–12436页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Luo X.，Fang，G.，Coldiron，M.，Lin，Y.，Yu，H.，Kirschner，M.W.和Wagner，G.（2000）mad2纺锤体组装检查点蛋白的结构及其与cdc20的相互作用。自然结构。生物。,7, 224–229. [公共医学][谷歌学者]
  • Luo X.，Tang，Z.，Rizo，J.和Yu，H.（2002）Mad2纺锤体检查点蛋白与Mad1或Cdc20结合后发生类似的主要构象变化。摩尔细胞,9, 59–71. [公共医学][谷歌学者]
  • 米歇尔·L.S。等.（2001）MAD2单倍体不足会导致哺乳动物细胞的过早后期和染色体不稳定。自然,409，355–359。[公共医学][谷歌学者]
  • Nicholls A.、Sharp，K.A.和Honig，B.（1991）《蛋白质折叠和结合：碳氢化合物界面和热力学性质的见解》。蛋白质,11, 281–296. [公共医学][谷歌学者]
  • Otwinowski Z.（1993）振荡数据简化程序。英国沃灵顿达斯伯里实验室科学与工程研究委员会。
  • Perrakis A.、Harkiolaki，M.、Wilson，K.S.和Lamzin，V.S.（2001）ARP/wARP和分子替换。《水晶学报》。D类,57, 1445–1450. [公共医学][谷歌学者]
  • Pfleger C.M.、Salic，A.、Lee，E.和Kirschner，M.W.（2001）MAD2相关蛋白MAD2L2对Cdh1–APC的抑制：调节Cdh1的新机制。基因发育。,15, 1759–1764.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pines J.（2002）《萨拉曼卡细胞周期试验：G研讨会》2/M进程和相关检查点。EMBO代表。,三, 17–21.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Seeley T.W.，Wang，L.和Zhen，J.Y.（1999）BUB1激酶对人MAD1的磷酸化在体外.生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。,257, 589–595. [公共医学][谷歌学者]
  • Shah J.V.和Cleveland，D.W.（2000）《等待后期：Mad2和主轴组件检查点》。单元格,103, 997–1000. [公共医学][谷歌学者]
  • Sironi L.、Melixetian M.、Faretta M.、Prosperini E.、Helin K.和Musacchio A.（2001）Mad2与Mad1和Cdc20结合，而不是齐聚，是纺锤体检查点所必需的。EMBO J。,20, 6371–6382.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sudakin V.，Chan，G.K.和Yen，T.J.（2001）HeLa细胞中APC/C的检查点抑制由BUBR1、BUB3、CDC20和MAD2的复合物介导。《细胞生物学杂志》。,154, 925–936.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tang Z.、Bharadwaj，R.、Li，B.和Yu，H.（2001）有丝分裂检查点蛋白Bub1R对APC–Cdc20的Mad2非依赖性抑制。开发单元,1, 227–237. [公共医学][谷歌学者]
  • Taylor S.S.，Ha，E.和McKeon，F.（1998）Bub3的人类同源物是Bub1和Mad3/Bub1相关蛋白激酶的动粒定位所必需的。《细胞生物学杂志》。,142，1-11。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Taylor S.S.和McKeon，F.（1997）小鼠Bub1的动粒定位是正常有丝分裂时间和对纺锤体损伤的检查点反应所必需的。单元格,89, 727–735. [公共医学][谷歌学者]
  • Wallace A.C.，Laskowski，R.A.和Thornton，J.M.（1995）LIGPLOT：一个生成蛋白质-配体相互作用示意图的程序。蛋白质工程。,8, 127–134. [公共医学][谷歌学者]
  • Wassmann K.和Benezra，R.（1998）Mad2在有丝分裂期间与APC/p55Cdc复合物短暂相关。程序。美国国家科学院。科学。美国,95, 11193–11198.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Weeks C.M.和Miller，R.（1999）SnB v2.0的设计和实现。J.应用。结晶器。,32, 120–124.[谷歌学者]
  • Zachariae W.和Nasmysy，K.（1999）《谁的结局是毁灭：细胞分裂和后期复合体》。基因发育。,13, 2039–2058. [公共医学][谷歌学者]
  • Zhang Y.和Lees，E.（2001）在Cdc20上识别Mad2和后延复合体的重叠结合域：纺锤体检查点调控模型。分子细胞。生物。,21, 5190–5199.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团