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EMBO J。2002年4月15日；21(8): 2045–2053.
数字对象标识：10.1093/emboj/21.8.2045年
预防性维修识别码：PMC125967项目
PMID：11953324

DNA修复内切酶XPF–ERCC1的活性位点形成高度保守的核酸酶基序

杰奎琳·恩兹林和奥兰多·D·施勒1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

XPF–ERCC1是一种结构特异性核酸内切酶，参与核苷酸切除修复、链间交联修复和同源重组。到目前为止，还没有实验表明异二聚体的哪个亚基具有核酸酶活性，以及哪些氨基酸有助于催化。我们使用亲和裂解分析，将活性位点定位到XPF的670–740氨基酸。分析该区域产生的点突变在核酸酶活性、金属配位和DNA结合中的作用。核酸酶活性需要一些酸性和碱性残基，但不需要DNA结合。XPF–ERCC1对底物结合和催化的分离对于研究这种蛋白质在各种DNA修复过程中的作用将是非常宝贵的。XPF活性位点区域与Mus81家族和推测的古生RNA解旋酶家族的蛋白质的比对表明，参与核酸酶活性的XPF的七个残基在三个蛋白质家族中是绝对保守的，表明它们共享一个共同的核酸酶基序。

关键词：亲和切割/DNA修复/核酸内切酶/定点突变/XPF–ERCC1

介绍

在哺乳动物中，紫外线和环境诱变剂形成的DNA损伤主要通过核苷酸切除修复（NER）去除(弗里德伯格等., 1995;林达尔和伍德，1999年). 在人类中，NER缺乏与遗传性着色性干皮病综合征（XP）有关，其特征是对阳光极度敏感，皮肤癌的发病率增加了1000倍以上，在某些情况下，还会出现神经系统异常(布茨玛等., 1998). 在NER中，将受损的DNA链切割到损伤处5′和3′，去除长度为～30个核苷酸的受损寡核苷酸，并通过修复合成填补缺口。切除步骤涉及至少18个多肽，即XPA至XPG基因编码的蛋白质，代表7个XP互补基团、ERCC1、hHR23B、RPA三聚体和TFIIH的附加亚单位(桑卡尔，1996年;伍德，1997年;德拉特等., 1999). 核心NER反应已经用纯化因子进行了重组，这使得对该途径的生化基础的理解取得了相当大的进展(阿布塞克拉等., 1995;亩等., 1995). 生化和细胞生物学研究表明，XPC–hHR23B是第一个检测DNA损伤位点的已知NER因子(菅泽等., 1998;沃尔克等., 2001). XPC–hHR23B随后招募TFIIH前往受损现场(横井等., 2000). TFIIH、XPB和XPD的两个解旋酶亚单位，以及XPA、RPA和XPG，参与了病灶周围约30 bp气泡的形成(埃文斯等., 1997;阿劳霍等., 2001). XPA和RPA似乎在损伤验证中发挥了作用，并且对于在切口前正确定位XPG和XPF–ERCC1这两种核酸内切酶至关重要(德拉特等1998年;米苏拉等., 2001). XPG对病灶的3′切口先于XPF–ERCC1的5′切口；后者需要XPG的结构存在，而不是催化活性(若杉等., 1997). XPG和XPF–ERCC1的切口位于切口复合体中双链/单链DNA（ds/ssDNA）的边界，在没有其他因素的情况下，这种结构特异性活性可以用人工DNA底物上的纯化蛋白来复制(巴德威尔等., 1994;奥多诺万等., 1994;Sijbers公司等.，1996年a). 对活细胞中各种NER蛋白的流动性的观察表明，NER是通过相关单个因子的顺序组装进行的，而不是通过预先组装的修复体的作用进行的(霍茨穆勒等., 1999).

要彻底了解NER反应，需要详细描述每种相关蛋白质的活性以及所有这些蛋白质之间的相互作用。在这种背景下，我们对XPF–ERCC1内切酶的特性产生了兴趣。XPF和ERCC1在哺乳动物细胞和在体外，各种证据表明，这两种蛋白质在彼此缺失的情况下是不稳定的(Biggerstaff等人，1993年;Reardon等人，1993年;van Vuuren等人，1993年;Yagi等人，1997年). 除了在NER中的作用外，XPF–ERCC1在DNA代谢中还有其他尚未被了解的功能。XPF或ERCC1缺陷的哺乳动物和仓鼠细胞比其他NER因子缺陷的细胞对品牌间交联剂（ICL）的敏感性更高(Hoy等人，1985年). 此外，XPF–ERCC1可以在靠近ds/ssDNA连接的ICL的两侧进行切口(Kuraoka等人，2000年). XPF–ERCC1在同源重组中的参与是通过对芽殖酵母的研究首次提出的酿酒酵母，其中同源Rad1–Rad10复合物是从入侵同源链中移除长的非同源尾所必需的(Fishman-Lobell和Haber，1992年;Bardwell等人，1994年). 最近，在哺乳动物细胞中证实了ERCC1在同源重组中的作用(Sargent等人，2000年;Niedernhofer等人，2001年). ERCC1基因敲除小鼠的严重表型也支持XPF–ERCC1在NER之外的作用，包括生长迟缓、肝肾异常和早期死亡等症状，这不能仅用NER缺陷来解释(McWhir等人，1993年;Weeda等人，1997年).

XPF–ERCC1的一些功能域已被映射。异二聚体是通过XPF和ERCC1的C末端结构域相互作用形成的(德拉特等.，1998年b). XPF和ERCC1的C末端也包含两个螺旋-发夹-螺旋基序，这些基序经常出现在结合扭曲DNA结构的蛋白质中(Sijbers公司等1996年b;盖拉德和伍德，2001年). 已证明ERCC1通过氨基酸93–120与XPA相互作用，NER反应需要这种相互作用(锂等., 1994,1995). 序列比较将XPF蛋白家族与古菌RNA解旋酶的SF2超家族和Mus81蛋白家族联系在一起，它们是一种复合物的一部分，该复合物具有霍利迪连接分解作用(斯古罗斯等., 1999;Interthal和Heyer，2000年;博迪等., 2001;陈等., 2001;卡利拉曼等., 2001). 这三种蛋白质共享高度保守的V/IERKX三已预测在金属配位和核酸酶活性中起作用的D序列(阿拉文等., 1999). Mus81中这个基序中的天冬氨酸最近被证明是核酸酶活性所必需的(博迪等., 2001;陈等., 2001).

我们使用亲和裂解方法以公正的方式鉴定XPF–ERCC1的金属结合和活性位点。用二价铁取代蛋白质的金属辅因子，二价铁能够进行芬顿反应生成羟基自由基，导致金属结合位点附近的肽键断裂。以这种方式获得的肽片段的序列可以产生关于金属结合位点位置的信息(扎伊奇科夫等., 1996;莱克·安德森等., 1997;Cao和Barany，1998年;基姆等., 1999;赫拉瓦季等., 2000). 将这种铁介导的裂解技术应用于XPF–ERCC1，绘制了XPF亚基的670和740氨基酸之间的金属结合位点。我们在该区域的酸性和碱性残基中产生了一些突变并对其进行了表征，并证明其中一些残基在金属结合和/或催化中发挥作用。这些突变都不影响DNA结合，表明XPF–ERCC1的DNA结合和催化作用是可以分离的。实验确定的XPF–ERCC1活性位点的序列分析与理论预测一致，揭示了一种在真核生物和古生菌中广泛保守的新核酸酶基序。

结果

重组XPF–ERCC1的纯化

先前的研究报告成功地从这两种物质中纯化XPF–ERCC1大肠杆菌杆状病毒感染的昆虫细胞。我们最初评估了含有His的复合物的纯化程序6两个亚基上的标签在大肠杆菌然而，我们纯化方案中的凝胶过滤步骤表明，在我们手中，大多数蛋白质以聚集形式存在，并以过剩的未结合ERCC1形式存在（图1A、 虚线）。只有极少量的XPF–ERCC1在异二聚体XPF–ERCC1的预期范围内洗脱。值得注意的是，仅在与异二聚体蛋白相对应的组分中检测到蛋白洗脱的核酸内切酶活性（数据未显示）。因此，我们制定了一项使用His从杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中纯化XPF–ERCC1的方案6ERCC1上的标签。我们使用镍琼脂糖色谱、凝胶过滤和肝素柱（图1B） ●●●●。与来自大肠杆菌凝胶过滤柱的剖面图显示，Sf9昆虫细胞中表达的绝大多数XPF–ERCC1在异二聚体的预期范围内洗脱（图1A、 实线）并显示预期的核酸酶活性。

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图1。重组XPF–ERCC1的纯化。(A类)XPF–ERCC1凝胶过滤曲线的比较大肠杆菌（虚线）和Sf9昆虫细胞（实线）。约45 ml处的峰对应于蛋白质处于聚集状态的色谱柱的空隙体积，约65 ml处的峰值对应于约200 kDa的分子量，约75 ml处的高峰对应于约60 kDa。指出了峰组分中鉴定的蛋白质。(B类)SDS-PAGE凝胶（10%）纯化Sf9细胞的XPF-ERCC1异二聚体；用CBB染色观察蛋白质。显示了单个柱步骤后的细胞裂解物（Lys）和混合组分，即Ni-NTA–琼脂糖（Ni）、凝胶过滤（Gf）和肝素（Hep）。XPF和ERCC1的分子量分别为115和40 kDa。

利用亲和裂解对XPF–ERCC1金属结合位点进行定位

我们打算用亲和裂解技术鉴定XPF–ERCC1的金属结合区和活性位点区域。为此，金属辅因子（Mg2+或Mn2+)可以用铁代替2+，具有还原分子氧以形成超氧化物和羟基自由基的能力。这样的活性氧物种可以在金属结合位点附近切割多肽主链以产生肽片段，然后可以通过N-末端测序来鉴定。确定铁是否2+可以替代镁2+或Mn2+在XPF–ERCC1中，我们测试了铁存在下蛋白质的核酸酶活性2+.XPF–ERCC1显示了铁的剩余核酸酶活性2+（未显示数据）。显然，Fe2+能够进入蛋白质的活性部位，而铁2+-因此，介导的切割实验可以指导我们找到XPF–ERCC1的活性位点。用FeCl培养XPF–ERCC12在抗坏血酸盐的存在下3+它是在还原氧气以再生铁后形成的2+)确实导致了蛋白质切割。SDS–PAGE显示了在广泛的Fe范围内非常重复的裂解模式2+浓度（10–1000µM）和培养时间（3–15 h）。最关键的参数是pH值，在pH值7.0时获得最佳结果。

典型模式由五条带组成（带1-5，按大小顺序递减），估计分子量为102-52 kDa（图2A） ●●●●。为了确定裂解位点，凝胶被印在PVDF膜上，这些片段的N末端受到Edman降解。条带1-4易于测序，且均含有XPF的原始N末端（图2C） 这表明解理位点位于XPF的C末端，但未能揭示解理位点的确切位置。数次尝试对带5进行测序均未成功。带5（52 kDa）可能代表与带4（62 kDa。

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图2。XPF–ERCC1的铁诱导解理。(A类)用50µM FeCl处理前后纯化XPF–ERCC1的SDS–PAGE凝胶（8%）2和20 mM抗坏血酸在0°C下保持15小时。观察到的五个XPF裂解产物被指定为1-5条带，大小依次减小，估计分子量分别为102、95、88、62和52 kDa。使用10kDa蛋白质阶梯（生命科技）作为标记物。显示了90和60 kDa标记带的位置。(B类)XPF–ERCC1的SDS–PAGE凝胶（12%）按（A）处理。25至30 kDa之间的三条带被指定为6至8条带。显示了30和20 kDa标记带的位置。(C类)（A）和（B）中带1-8的肽片段的N末端测序结果。(D类)XPF中解理位点的位置。物种间保守的XPF区域显示为灰色，包含深灰色解理位点的区域和高度保守的V/IERKX三黑色D图案。解理位点用箭头表示。(E类)XPF 673-737区的氨基酸序列。保留的残基为粗体，选择用于定点突变的残基用星号标记，切割位点用箭头标记。

为了获得更多关于导致条带1-3形成的切割位点的信息，我们试图获得其C末端对应物的序列。因此，我们进行了更大规模的裂解反应，并在更高百分比的SDS-PAGE凝胶上进行了分析（图2B） ●●●●。在这些条件下，我们观察到三条额外的谱带，分子量在25-30 kDa之间（谱带6-8）。为了获得这些带中蛋白质片段的N末端序列，有必要在铁之前浓缩蛋白质2+/抗坏血酸处理，每道使用约200µg蛋白质，随后将其印在PVDF膜上。最后，这三条带的N末端测序表明，它们确实是XPF衍生的，在680、702和734处有裂解位点（图2C–E）。因此，频带6–8很可能分别构成频带3、2和1的C端对应物。因此，我们能够绘制的三个裂解位点位于XPF亚基的保守C末端结构域（图2D和E），在高度保守的V/IERKX的两侧三D图案。该基序已被预测在XPF–ERCC1的核酸酶活性中发挥作用，其中的天冬氨酸残基已被证明参与Mus81的核酸酶活性(阿拉文等., 1999;博迪等., 2001;陈等., 2001). 有趣的是，没有观察到ERCC1的解理，这表明XPF包含整个金属结合位点。

假定活性位点突变的XPF–ERCC1的产生

由于三个可识别的铁诱导解理位点位于XPF的670和740残基之间，因此我们得出结论，XPF的这一区域对金属结合很重要，可能包含XPF–ERCC1的活性位点。我们选择XPF亚基中的12个氨基酸残基进行定点突变（图2E） ●●●●。选择E679、E701、Q733和C734是因为它们位于解理位点。除E701外，这些残基高度保守。D676、D704、E714和D720（和E679）是该区域中绝对保守的酸性残基，因此可能在金属结合和催化中发挥作用。选择带正电且高度保守的R678、R681、R715和K716来研究它们在催化和与DNA骨架结合中的作用。所有12个残基均突变为丙氨酸，并与ERCC1一起在Sf9昆虫细胞中表达。与野生型蛋白一样，对所有10个酸性或碱性残基突变的蛋白进行表达和纯化。重要的是，凝胶过滤柱的剖面图显示，这些突变体以异二聚体的形式存在，表明它们被正确折叠（数据未显示）。只有R715A突变体显示了相对大量（～80%）的聚集蛋白，但仍获得了足够数量的异二聚体蛋白用于生化表征。相比之下，Q733A和C734A突变体仅出现在凝胶过滤柱的聚合范围内（数据未显示），表明它们没有正确折叠。因此，我们没有进一步描述这两个突变体。

铁附近酸性和碱性残基的突变2+-诱导裂解位点对核酸内切酶活性的影响

我们使用前面描述的茎环底物研究野生型和突变型XPF–ERCC1的内切酶活性(德拉特等.，1998年c). 与早期研究一致，我们在金属浓度为0.4mM MnCl时观察到最佳活性2或2mM氯化镁2蛋白质超过底物2倍。锰的活性最高2+作为辅因子，在优化条件下，XPF–ERCC1导致约80%的茎环底物裂解（图三A、 车道b）。在XPF突变体中，只有E701A表现出与野生型相同的活性水平。R681A显示了约70%的野生型活性，表明这两个残基对核酸酶活性并不重要（图三，车道f和g）。在MnCl存在下，E679A和E714A分别表现出5%和30%的野生型活性2在MgCl存在下无（E679A）或只有残余活性（E714A）2（图三，泳道e和i），表明这些残基中的突变影响金属结合位点的结构。高MnCl2或氯化镁2浓度没有导致这两个突变体的活性增加（数据未显示）。将678和715位的两个精氨酸残基替换，得到的蛋白质只有残余活性（图三而XPF的D676、D704、K716和D720突变的异二聚体没有任何活性（图三，通道c、h、k和l），表明至少有四个突变残基是酶活性所必需的。

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图3。野生型和突变型XPF–ERCC1的核酸酶活性。用野生型（WT，b通道）或突变型（c–l通道）XPF–ERCC1（200 fmol）在含有(A类)0.4 mM氯化锰2或(B类)2 mM氯化镁2在15%变性聚丙烯酰胺凝胶上分析反应。测试的XPF突变、46mer干环底物（箭头所示的切割部位）和9/10mer切割产物均显示出来。

大多数（但不是全部）酸性残基的突变会改变金属结合位点

接下来，我们想了解突变体活性的降低是否与异二聚体与金属辅因子相互作用的能力有关。我们使用铁介导的裂解条件来鉴定金属结合位点，以此来衡量突变蛋白与金属相互作用的能力。我们预计具有完整金属结合位点的异二聚体将显示相同的裂解模式，而金属结合位点破坏将导致某些特征裂解位点的消失。由于XPF–ERCC1在两种镁的存在下都是活性的2+和锰2+，我们预计只有酸性残基的突变才会影响与金属的相互作用，如Mg2+与氮配体没有良好的相互作用。我们对XPF–ERCC1突变体进行铁处理2+/抗坏血酸处理并将形成的裂解模式与野生型蛋白质的裂解模式进行了比较。我们观察到所有基本突变体以及E701A和D720A突变体的切割模式没有变化（图4). 相反，在D676A、E679A、D704A和E714A突变体的裂解模式中，带1-3明显缺失，表明这些替换改变甚至破坏了金属结合位点。这四个酸性残基的突变导致核酸酶活性没有或降低，表明它们通过金属结合介导催化。在所有突变体中都观察到条带4和5，这表明存在两个金属结合位点，或者这些条带是非特异性形成的。

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图4。野生型和突变型XPF–ERCC1铁诱导裂解的比较。用50µM FeCl培养纯化的野生型（WT）和突变型XPF–ERCC12和20 mM抗坏血酸在0°C下放置15小时，并在8%SDS–PAGE凝胶上进行分析。由铁诱导解理产生的带1-3，分子量分别为～102、95和88 kDa，用三个点表示（如果存在）。

XPF活性位点区域的突变不影响DNA结合

为了检测导致核酸酶和金属结合活性缺陷的突变是否对DNA结合有任何影响，我们进行了电泳迁移率变化分析（EMSA）。我们最初使用XPF的D720A突变体来建立结合条件（图5A） ●●●●。我们通过比较野生型异二聚体XPF（D676A）–ERCC1（催化和金属配位缺陷）和XPF（D 720A）–ERCC1（催化剂缺陷但精通金属结合）的能力，研究了二价金属在这种结合作用中的作用在存在和不存在各种金属的情况下与茎环基质结合。正如预期的那样，我们观察到在MnCl存在下，底物与野生型蛋白质发生裂解2或氯化镁2（图5B、 通道B和c），表明EMSA中观察到的蛋白质-DNA复合物处于活性构象。两种突变蛋白与MnCl的结合能力无明显差异2或氯化镁2或CaCl存在下的野生型和突变蛋白2和EDTA（图5B、 车道d–m）。显然，二价金属离子的存在并不是DNA结合的先决条件，金属辅因子的身份对结合亲和力没有显著影响。

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图5。催化失活的XPF–ERCC1突变体特异性结合到茎环底物。5′-32所有实验均使用浓度为17 nM的P标记的茎12–环22底物，这是添加到反应混合物中的最后一种成分。除非另有说明，否则蛋白质浓度为68 nM和MnCl2（0.4 mM）作为辅因子。反应在室温下培养30分钟，并在4%天然聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。(A类)增加XPF（D720A）–ERCC1浓度与底物孵育，以证明XPF–ERCCl与茎环底物的结合。蛋白质浓度：通道b，17 nM；车道c，34 nM；车道d，51 nM；车道e，68 nM；车道f，85 nM；车道g，102 nM；泳道h，136 nM；泳道i，170nM。(B类)二价金属离子对野生型和突变型XPF–ERCC1底物结合的影响。野生型（WT）XPF–ERCC1，车道b–e；D676A，车道f–i；D720A，j–m车道。金属辅因子浓度：Mn2+，0.4毫米；镁2+，2毫米；钙2+，2毫米。EDTA（E）浓度，5 mM。(C类)特异性和非特异性寡核苷酸竞争对手数量增加对XPF（D720A）-ERCC1底物结合的影响。竞争对手：b道，无竞争对手；车道c–f、主干12–环路22（分别为68、340、850和1700 nM）；车道g–j，干12 dsDNA（分别为340、850、1700和3400 nM）；车道k–n，环22 ssDNA（分别为340、850、1700和3400 nM）。(D类)野生型（WT）和突变型XPF–ERCC1底物结合的比较。

我们继续研究XPF–ERCC1与ds/ssDNA结合的特异性，通过挑战特定和非特定竞争对手的结合反应。我们使用未标记的干环底物作为我们的特定竞争对手，而该分子的双链或单链区域分别作为dsDNA和ssDNA竞争对手。添加20倍过量（340 nM）的特定竞争对手可完全抑制复合物的形成，而添加100倍过量（1.7µM）的dsDNA或ssDNA竞争对手对结合反应没有影响（图5C） ●●●●。这些观察结果表明XPF–ERCC1与ds/ssDNA连接的结合非常特异。接下来，我们想看看是否所有的突变体都能与茎环结合。我们观察到，所有核酸酶活性受损的突变体表现出非常相似的结合活性（图5D） ●●●●。R681A和E701A突变体具有近野生型核酸酶活性，能够在EMSA条件下部分裂解底物（与核酸酶条件非常相似）。我们的数据清楚地表明，XPF中的任何突变都不会影响蛋白质的DNA结合能力。

讨论

XPF活性位点的鉴定–ERCC1

XPF–ERCC1是一种结构特异性核酸内切酶，在NER、ICL修复和同源重组中发挥作用。在这项工作之前，还没有确定这种异二聚体的活性部位。我们使用亲和裂解方法来鉴定蛋白质活性位点中与金属离子配位的残基(扎伊奇科夫等., 1996;莱克·安德森等., 1997;曹和巴拉尼，1998年;基姆等., 1999;赫拉瓦季等., 2000). 这种方法利用了大多数金属依赖性核酸内切酶所采用的机制的相似性，其中涉及二价金属离子（通常是Mg2+或Mn2+)主要通过天冬氨酸或谷氨酸残基。我们用铁取代酶的金属辅因子2+，它可以在活性部位产生羟基自由基，从而近距离切割肽骨架。我们用这种方法对获得的片段进行了N末端测序，并确定了XPF的679/680、701/702和733/734氨基酸之间的三个裂解位点。我们使用定点突变研究了切割位点及其周围的酸性和碱性残基的作用（图2E） ，并确定了几个对催化很重要甚至是必不可少的残基。我们现在通过生物化学方法鉴定出的活性位点区域与预测的结果非常吻合阿拉文等. (1999)，who建议该区域包含基于多重序列比对的核酸酶基序（见下文）。然而，我们的结果与另一项研究相反，该研究表明XPF的N端378氨基酸具有核酸内切酶活性(麦卡琴-马洛尼等., 1999). 这项研究已经受到了盖拉德和伍德（2001），他们不能单独在XPF中检测核酸酶活性。

活性部位残留物的假定作用

除了Q733A和C734A突变体外，我们引入XPF的突变对蛋白质折叠、ERCC1异二聚体形成和DNA结合没有影响。我们检测了在镁存在下每个突变体的核酸酶活性2+和锰2+以及它们经受铁介导解理的能力，以查看它们是否包含完整的金属结合位点。基于此分析，我们可以将我们调查的酸性残留物分为三类。D676和D704对核酸酶活性和金属结合都是绝对必需的，并且显然通过金属离子的配位对催化有贡献。D720对催化也很重要，但不参与金属结合。它可能在激活水分子作为磷酸二酯键水解所需的亲核剂方面发挥一般碱的作用。核酸酶中酸性残基的这种作用已经被证明，例如限制性内切酶E113巴姆HI（高）(Pingoud和Jeltsch，2001年). E679和E714的突变导致镁存在时核酸酶活性严重降低2+，而Mn的使用2+作为辅因子，核酸酶活性很高（野生型为5%和30%）。这两个突变体都没有经历铁介导的蛋白质裂解。显然，这两个残基的突变导致了金属结合位点的改变，而金属结合位点仍然可以结合锰2+，但不是镁2+.已知Mn2+对配体配位的要求不太严格，并且通常对蛋白质中的金属结合位点表现出比镁更高的亲和力2+(Cowan，1998年). 我们在XPF的四个基本残基中产生了突变。R678、R715和K716的突变严重影响了核酸酶的活性，而R681的突变没有太大影响。由于这些突变对XPF的DNA结合亲和力没有任何明显影响，因此ERCC1、R678、R715和K716可能参与催化。与催化有关的残基的一般作用与其他核酸内切酶的观察结果一致(Hosfield等人，1998年;Chevalier和Stoddard，2001年;Pingoud和Jeltsch，2001年). 这些残基的作用有待结构和更详细的生物化学研究的更精确表征。

一个新的保守核酸酶基序

我们的研究已经确定了许多对XPF–ERCC1催化作用重要或必不可少的残基。之前已经证明有两类蛋白质与XPF具有序列相似性：推测的SF2的古老RNA解旋酶和参与减数分裂重组和停滞复制叉重新启动的Holliday连接解旋酶Mus81家族(Aravind等人，1999年;Sgoros等人，1999年;Interthal和Heyer，2000年;Boddy等人，2001年;Chen等人，2001年;Kaliraman等人，2001年;Mullen等人，2001年). 这两个蛋白质家族，如XPF，都含有高度保守的V/IERKX三D基序，尚未在其他蛋白质中检测到。对这三个家族的蛋白质进行比对后发现，XPF中对应于D676、E679、D704、E714、R715、K716和D720的残基在这些蛋白质中是绝对保守的，并且形成了一个新的保守核酸酶基序的核心（图6). 对序列比对的进一步检查表明，三个额外的极性残基S724、R729和Q733可能参与催化，以及15个疏水性或芳香性残基，可能有助于保守该核酸内切酶基序的整体折叠，在蛋白质的这一区域也高度保守到绝对保守。Mus81与ERCC1同源物Mms4形成异二聚体面包酵母和中的Eme1葡萄裂殖酵母，作为Holliday结分解酶的一部分发挥作用，因此具有结构特异性内切酶活性，底物特异性与XPF–ERCC1略有不同(Boddy等人，2001年;Chen等人，2001年;Kaliraman等人，2001年). 与我们的观察结果一致，Mus81中两个相邻天冬氨酸的突变，对应于XPF中的S719和D720，导致连接断裂活性的丧失。此外，相应的突变等位基因S.pombe公司显示Mus81空等位基因的表型(Boddy等人，2001年;Chen等人，2001年). 据我们所知，推测的古生物解旋酶尚未进行生化表征，但XPF中催化残基的高度保守性表明它们也具有核酸酶活性。

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图6。XPF内切酶结构域与其同源物的比对。比对显示人类XPF的673–737氨基酸与XPF、推测的古解旋酶和Mus81家族的同源蛋白。对齐蛋白（DDBJ/EMBL/GenBank登录号显示在括号中）：人类（Hs）XPF(Q92889问题)，小鼠（Mm）ERCC4(AAC03240型)，仓鼠（Cg）ERCC4(BAA89299型),黑腹果蝇（Dm）梅9(Q24087问题),秀丽隐杆线虫（Ce）半径1(CAB70217型),拟南芥（在）Rad1(NP_198931号),葡萄裂殖酵母（西班牙语）RAD16(第36617页),酿酒酵母（科学）RAD1(P06777号),富氏古球虫（Af）假定RNA解旋酶(AAB89786型),詹氏甲烷球菌（Mj）假定RNA解旋酶(AAB99518型),热自养甲烷热菌（Mt）假定RNA解旋酶(AAB85892型),霍里克希热球菌（Ph）推测RNA解旋酶(NP_143722号),深海热球菌（Pa）推定的RNA解旋酶(NP_125972号),硫矿硫化叶菌（Ss）假定RNA解旋酶(CAB57574号机组)，Sc Mus81号(NP_010674号)，Sp Mus81号(CAB09772电话)，博物馆81(AAB37627型)，Dm Mus81(AAF45571型)，Mm Mus81(AAL28066型)，Hs Mus81号(AAL28065型). 保存的残留物用以下颜色表示：绿色、疏水性（I、L、V、M）；红色，酸性（D，E）；蓝色，基本（K、R、H）；棕色，芳香（F，Y，W）；黄色（G，P）；紫色（C、N、Q、S、T）；橙色（A）。保守度≥85%的残基显示在一致序列中；强调了绝对保守残基。显示了保留的疏水（h）和芳香（a）残留物。上述比对总结了本研究中产生的突变体的生化特性结果。

结论

我们利用亲和裂解和定点突变对XPF–ERCC1的活性位点进行了表征。我们的研究揭示了一个保守的核酸酶基序，该基序也存在于Mus81和古生物RNA解旋酶家族的蛋白质中。XPF–ERCC1对DNA结合和催化的分离对于进一步研究该蛋白在NER、链间交联修复和同源重组中的作用具有重要价值。

材料和方法

用于诱变的寡核苷酸引物由Microsynth（瑞士）合成。在Expedite 8909核酸合成系统上合成核酸酶和EMSA的寡核苷酸，并通过变性PAGE进行纯化。除非另有说明，所有酶均购自新英格兰生物实验室。[γ-32P] ATP从Amersham/Farmacia获得。所有其他化学品和试剂均来自Fluka或Sigma。常规分子生物学操作是使用标准协议进行的(萨姆布鲁克等., 1989).

大肠杆菌中重组XPF–ERCC1的纯化

含有XPF和ERCC1的pET28·XPF/ERCC1载体及其C末端His6标签是W.de Laat和H.Odijk（荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学）赠送的一份礼物。大肠杆菌用pET28·XPF/ERCC1转化BL21（DE3）细胞；使用单个菌落接种1 l含有50 mg氨苄青霉素和50 mg卡那霉素的LB培养基，并在37°C下培养。在OD6000.6时，将培养物冷却至20°C，并将IPTG添加至最终浓度1 mM，然后在20°C下进一步培养过夜。通过低速离心收集细胞，并将其重新悬浮在含有一片溶解蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）的50 ml裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、10%甘油、5 mMβ-巯基乙醇、5 mM-EDTA和1 mM PMSF）中。超声处理后，在40000℃下离心澄清裂解液克在4°C下保持30分钟。通过缓慢添加25%（w/v）硫酸链霉素溶液至最终浓度为50 mg/ml的裂解液，进行链霉素沉淀。通过在4000转/分下在4°C下离心30分钟，去除产生的颗粒。随后，（NH4)2SO公司4通过滴加65%（v/v）的饱和中和（NH）进行沉淀4)2SO公司4蛋白质混合物的溶液。在冰上额外培养30分钟后，通过在4000转/分、4°C下离心30分钟，获得沉淀。将颗粒重新悬浮在含有1 mM咪唑、500 mM NaCl和1 ml Ni-NTA琼脂糖（齐亚根）的15 ml镍缓冲液（50 mM磷酸钾，pH 8.0，10%甘油，5 mMβ-巯基乙醇和1 mM PMSF）中，在4°C下孵育3 h并装入柱中。分别用10 ml含有10 mM咪唑/300 mM NaCl的镍缓冲液和10 ml含有50 mM咪唑啉/300 mM NaCl。XPF–ERCC1在含有300 mM咪唑/300 mM NaCl的4 ml镍缓冲液中洗脱。随后，将蛋白质加载到在Gf缓冲液（25 mM HEPES pH 8.0、150 mM NaCl、10%甘油和5 mMβ-巯基乙醇）中平衡的HiLoad 16/60 Superdex 200凝胶过滤柱（Pharmacia）上。将含有感兴趣蛋白质的组分闪冻并储存在-80°C下。

XPF–ERCC1复合物杆状病毒的产生和纯化

质粒pFastBac1-XPF和pFastBac1-ERCC1-His是W.de Laat和N.Wijgers赠送的礼物，用于转化活性DH10Bac细胞。分离出Bacmid DNA并用于转染Sf9昆虫细胞，并根据制造商的说明（BAC to BAC系统；生命科技）扩增病毒。用于蛋白质生产，10个T-175烧瓶，容量为2.5×107细胞被XPF和ERCC1病毒共同感染，m.o.i为5。在感染后65 h通过低速离心收集细胞，并将其重新悬浮在40 ml溶解缓冲液中（50 mM磷酸钾，pH 8.0，10%甘油，0.1%NP-40，5 mMβ-巯基乙醇和1 mM PMSF），其中含有一片溶解的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）。在冰上孵育20分钟后，添加氯化钠至最终浓度800 mM，并对裂解液进行超声处理。在40000℃下通过离心澄清裂解液克在4°C下保持30分钟。将所得提取物与1.5 ml Ni-NTA-琼脂糖（Qiagen）在4°C、1 mM咪唑存在下孵育5小时。通过低速离心收集珠粒，并将其重悬于含有1mM咪唑和800mM NaCl的15ml Ni缓冲液中，并装入柱中。分别用10 ml含有5 mM咪唑/500 mM NaCl的镍缓冲液和10 ml含有10 mM咪唑/500 mM NaCl。XPF–ERCC1在含有50 mM咪唑/300 mM NaCl的5 ml镍缓冲液中洗脱，并使用在Gf缓冲液中平衡的HiLoad 16/60 Superdex 200色谱柱（Pharmacia）通过凝胶过滤进一步纯化。将含有XPF–ERCC1异二聚体的组分从60至70 ml洗脱，汇集并浓缩在1 ml在Gf缓冲液中平衡的HiTrap肝素柱（Pharmacia）上。在Gf缓冲液中使用线性10柱体积梯度从0.15到1 M NaCl洗脱蛋白质。在280 nm处直接测量蛋白质浓度，将纯化的蛋白质快速冷冻在等分样品中并储存在-80°C下。通常，可获得浓度为0.1–0.6 mg/ml的0.25–1 mg纯化络合物。

铁2+-诱导蛋白亲和力裂解分析

将HEPES–NaOH pH 7.0添加至最终浓度为50 mM，将新制备的氯化亚铁添加至20–300µl纯化XPF–ERCC1蛋白。将溶液在冰上培养15分钟，然后添加抗坏血酸至最终浓度20 mM，并在冰上再培养3–15小时。裂解产物在8%或12%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后立即用考马斯亮蓝（CBB）染色或印在Immobilon-P PVDF膜（Millipore）上进行N末端测序。在pH 11.0的10mM CAPS和10%甲醇中在100V下进行电印迹90分钟。根据制造商的说明，对带子进行了可视化处理。如有必要，在SDS–PAGE和CBB染色前沉淀蛋白质溶液，或者如果样品用于N末端测序，则在Fe之前在中心粒管（Amicon）中浓缩5到10倍2+/抗坏血酸处理。P.Hunziker和R.Sack使用制造商推荐的标准化学协议，在G1005A型蛋白质测序器（安捷伦科技公司）上进行N端测序。

XPF点突变的构建

根据制造商的说明（Stratagene），使用QuikChange定点突变试剂盒进行定点突变，以在pFastBac1·XPF中引入点突变。pFastBac1·XPF用作模板和寡核苷酸引物，用于产生包含所需突变的突变，如果可能，还包括用于选择的标记限制位点。使用了以下引物（限制位点用下划线表示，修饰核苷酸用斜体表示）：

XPF–D676A，GGTACACAGCAAGCATTTGTG公司GCAATG公司CGTGAATTTCG公司(英国标准普尔DI）；XPF–R678A，GCATAGTGTGGATGGC公司T型GAATTC公司CGAAGTGAGCTTCCATC公司(生态RI）；XPF–E679A，GTTGTGGATAT公司GCGCGC公司ATTTCGAAGTGTTCC公司(Bss公司HII）；XPF–R681A，GTGGATATGCGGAATTT公司GCTAGC公司GAGCTTCCATCTCATCC公司(Nhe公司I） ；XPF–E701A、GACATTGAACCCGTGACGCTAGC公司GGTTGGATTACATCC公司(Nhe公司一） ；XPF–D704A，CCCGTGACTTTAGAGGTT公司GGCGCC公司TACATCCTCACTCCAG公司(纳尔一） ；XPF–E714A、CCAGAAAATGTGCGTG气相色谱AAGAGTATCAGTG公司(Bss公司HII）；XPF–R715A、CCAGAAAATGTGCGTGGAGGC公司CAAGAGTATCAGTGATTAATCG（-）；XPF–K716A、CCAGAAAATGTGCGGAGCGCGCT公司自动增益控制ATCAGTGATTTAATCGGC公司(Nhe公司一） ；XPF–D720A，GAGCGCAAGAGTATCA公司GCGCGC公司TAATCGGCTCTTTAAATAACGGC公司(英国标准协会HII）；XPF–Q733A、GGCCGTCTACAGCGCATGC公司ATCTCCATGTCC公司(速度一） ；XPF–C734A、GGCGCCTACAGCCAGGC关贸总协定CATGTCCCGCTAC公司(生态RV）。

阳性克隆被测序以排除引入额外突变，并被亚克隆到含有野生型XPF的原始pFastBac1·XPF载体中。使用酶亚克隆突变体D676A、R678A、E679A和R681AX厘米我和幽门螺杆菌一、 使用酶亚克隆突变体E701A、D704A、E714A、R715A、K716A、D720A、Q733A和C734A英国标准时间BI和血红蛋白I.突变XPF蛋白与野生型ERCC1在Sf9昆虫细胞中共同表达，并使用与野生型异二聚体相同的程序进行纯化。

核酸酶分析

A stem12–loop22寡核苷酸（GCCAGCGCTGT22CCGAGCGCTGGC）为5′-32P端部标记。在25 mM HEPES（pH 8.0）、40 mM NaCl、10%甘油、0.5 mMβ-巯基乙醇、0.1 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）和0.4 mM MnCl中进行核酸酶反应（15µl）2或2mM氯化镁2反应混合物含有100 fmol DNA底物和20–200 fmol XPF–ERCC1蛋白，并在30°C下培养2小时。使用氯化铁的反应2除pH 7.0，10-40 mM NaCl，20-100µM FeCl2使用1 pmol的XPF–ERCC1。通过添加15µl负载染料（90%甲酰胺/10 mM EDTA）并在95°C下加热5分钟，停止反应。将样品加载到含有0.5×TBE的15%（19:1）变性聚丙烯酰胺凝胶上，并在200 V下运行3 h。反应产物通过放射自显影术进行可视化，并在荧光成像仪上进行定量（STORM860；分子动力学）。

凝胶阻滞实验

在所有带移实验中使用核酸酶分析中使用的相同底物。每反应250 fmol底物（其中50 fmol为5′-32P末端标记）与野生型或突变型XPF–ERCC1蛋白在反应体积为15µl的25 mM HEPES（pH 8.0）、40 mM NaCl、15%甘油、0.5 mMβ-巯基乙醇、0.1 mg/ml BSA和0.4 mM MnCl中孵育2或2 mM氯化镁2图的图例中描述了所调查的变量5在室温下培养30分钟后，将样品加载到含0.5×TBE的4%（37.5:1）天然聚丙烯酰胺凝胶上，并在4°C下100 V下运行1 h。凝胶干燥，并通过放射自显影术显示条带。

致谢

我们感谢Peter Hunziker和Ragna Sack的N末端测序；Wouter de Laat、Hanny Odijk和Nils Wijgers提供XPF–ERCC1表达质粒；以及Schärer实验室的成员Josef Jiricny、Primo Schár和Hanspeter Nägeli，以获得持续的支持和有益的讨论。这项工作得到了瑞士国家科学基金会、人类前沿科学计划和EMBO青年研究员计划的支持。

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